Inducir miointimal Hiperplasia Versus aterosclerosis en ratones: una introducción de dos modelos válidos

El objetivo general del siguiente experimento consiste en presentar dos modelos animales válidos que provocan un estrechamiento de la aorta mediante mecanismos diferentes. El primer modelo es la cateterización con balón de la aorta para inducir el desarrollo de hiperplasia miointimal. En primer lugar, se expone la aorta abdominal infrarrenal y se pinza.

Luego, se abre la aorta mediante una incisión transversal y se introduce el catéter con balón. Se realiza entonces la desnudación del endotelio de la aorta con el catéter inflado y se finaliza la cirugía. El segundo modelo consiste en una manipulación dietética de ratones transgénicos nulos para APOE para inducir placas ateroscleróticas.

Estos ratones se mantienen en condiciones estándar y se alimentan con una dieta occidental rica en lípidos durante cuatro a seis meses. En última instancia, el análisis histológico de la hiperplasia miointimal inducida quirúrgicamente y del modelo de restricción dietética muestra que producen un estrechamiento luminal diferente. Hoy les mostraremos dos modelos distintos para inducir el estrechamiento luminal: el modelo en ratón mediante un catéter con balón para inducir lesión vascular y el modelo de arteriosclerosis.

Utilizando ratones transgénicos en la dieta occidental, el modelo de catéter con balón puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la estenosis. El modelo de ratón transgénico homocigoto con mutación en el gen E superior se utiliza para estudiar la fisiopatología de la aterosclerosis. Para el modelo de hiperplasia íntima, obtener ratones C 57 black six J que pesen aproximadamente 25 gramos.

Manténgalos en condiciones normales con una dieta habitual. Tras anestesiar al ratón con 2% isoflurano, recorte el vello abdominal y administre carprofeno mediante inyección subcutánea para analgesia. A continuación, desinfecte alternativamente la piel con providona yodada y etanol al 80 % en dos ciclos.

Ahora verifique la ausencia de reflejos mediante una compresión del dedo del pie. Comience la cirugía separando la piel y el músculo a lo largo de la línea alba. A continuación, envuelva los intestinos en un guante humedecido con solución salina y luego, cuidadosamente, retire el tejido adiposo, exponiendo la aorta abdominal.

Ahora exponga la aorta infrarrenal hasta su bifurcación. Tenga cuidado de no dañar ningún vaso colateral. Ahora coloque la pinza en la aorta.

Primero, coloque una pinza microquirúrgica en la aorta infrarrenal proximal para interrumpir el flujo sanguíneo. Segundo, coloque una segunda pinza distal cerca de la bifurcación aórtica. Cuando el flujo sanguíneo esté interrumpido, realice una pequeña incisión en la aorta cerca de la pinza proximal.

Introduzca el catéter hacia la pinza distal de la aorta para provocar una lesión endotelial. Desnude la aorta inflando cuidadosa y lentamente el balón del catéter y retirando el catéter en dirección hacia la pinza proximal. Repita esta maniobra dos veces, para un total de tres inflaciones de la aorta.

Ahora retire el catéter y cierre la incisión aórtica utilizando suturas corridas de prolina 10 au. Con las suturas colocadas, abra cuidadosamente el clamp distal si hay sangrado en el sitio de autotomía de la AOR. Vuelva a cerrar el clamp, localice el sangrado y deténgalo con puntos adicionales interrumpidos.

Cuando no haya sangrado, abra lentamente la pinza proximal. Debe ser visible un pulso aórtico distal a la incisión. Ahora coloque los intestinos en C dos.

A continuación, cierre la pared abdominal comenzando por la capa muscular utilizando seis suturas continuas de prolinas OTT. Luego, cierre la piel con cinco suturas OTT y transfiera al ratón de regreso a su jaula. Durante los primeros tres días posteriores a la cirugía, agregue metrazol al agua de bebida para el control del dolor.

Supervise al animal durante toda su recuperación, lo cual toma aproximadamente 28 días. Para el modelo de aterosclerosis, obtenga ratones deficientes en A POE de cuatro semanas de edad. Mantenga a estos ratones en condiciones estándar con una dieta occidental rica en lípidos durante cuatro a seis meses.

Mantenga esta dieta durante todo el experimento. Seis horas antes de extraer la aorta, retire el acceso a la comida. A continuación, prepare el ratón para la cirugía como se describe en la sección anterior.

Comience la cirugía abriendo el tórax. A continuación, corte el ápice del corazón y perfúndalo bajo presión suave con tres mililitros de paraformaldehído al 4 % a través de la raíz aórtica para fijar la aorta. Luego, libere la aorta desde su raíz hasta su bifurcación.

Intente eliminar la mayor cantidad posible de tejido adiposo. A continuación, corte el arco aórtico y guárdelo en paraformaldehído al 4 %. Ahora transfiera el corazón y el árbol aórtico a un recipiente de silicona con PBS en el interior.

Corte un extremo del árbol aórtico y fíjelo sobre la capa de silicona con alfileres finos. Abra la aorta longitudinalmente y deje que el tejido aórtico repose en PBS a temperatura ambiente durante unos minutos. Luego, enjuague el tejido una vez con etanol al 50 % e introdúzcalo en un baño de Sudan.

Tres, solución de tinción durante aproximadamente 15 minutos. Después de la tinción, enjuague rápidamente el tejido con etanol al 50 % durante unos segundos para eliminar solo el exceso de Sudan. Un enjuague excesivo eliminará demasiado colorante; inmediatamente enjuague el tejido con agua destilada y continúe con la obtención de imágenes. Para el modelo de hiperplasia íntima miointimal, se obtuvieron aortas de ratón desendotelizadas, se incluyeron en parafina y se tiñeron con cromo. Las relaciones Im se calcularon a partir de las secciones teñidas con tricromo midiendo el grosor de la íntima y de la media.

Mediante análisis computarizado seguido del cálculo de la relación, el espesor máximo de la placa se midió como el espesor máximo de la íntima en la luz mediante morfometría computarizada. El porcentaje de oclusión luminal se calculó como la relación entre la nueva luz interna y la luz anterior. El área de la placa se calculó restando la nueva luz interna de la luz anterior.

Se realizaron los mismos análisis en secciones transversales teñidas con tricrómato del modelo de aterosclerosis en la válvula aórtica, el arco aórtico y la aorta descendente, únicamente para el modelo de aterosclerosis. La aorta descendente se abrió longitudinalmente y se tiñó con rojo de Sudan. Se midió el área de la placa y el área total de la aorta con la ayuda de un ordenador para el análisis de ambos modelos.

Otros métodos, como la histopatología y la microscopía confocal de inmunofluorescencia, pueden realizarse para responder preguntas como la ablación luminal, la morfología y la celularidad. Gracias por ver este video y mucha suerte con sus experimentos.