El cultivo Caenorhabditis elegans En axénico Liquid Media y Creación de transgénicos Worms por bombardeo de micropartículas

C. elegans usualmente se cultivan en placas de agar sólido o en cultivos líquidos sembradas con E. coli. Para evitar subproductos bacterianos de confusión estudios toxicológicos y nutricionales, se utilizó un medio líquido axénicos, CEHR, para crecer y sincronizar un gran número de gusanos para una gama de aplicaciones posteriores.

El objetivo general de este procedimiento es introducir y aumentar la elegancia del mar en los medios líquidos CENIC para numerosas aplicaciones posteriores. Esto se logra primero blanqueando los gusanos de tumba de placas de agar hambrientas. El segundo paso del procedimiento es transferir los óvulos liberados a M-C-E-H-R con antibióticos y permitir que se desarrollen hasta la etapa de tumba, lo que puede llevar de siete a 10 días.

El tercer paso es blanquear las tumbas y permitir que se desarrollen por segunda vez hasta la etapa de tumba sin antibióticos adicionales. El paso final es sincronizar los gusanos del hacha y utilizarlos para estudios nutricionales que examinen el crecimiento y desarrollo de los gusanos. En última instancia, los resultados muestran que la elegancia silvestre de tipo C crece bien en medios Axe Liquid y los medios M-C-E-H-R se pueden utilizar para examinar las necesidades nutricionales de los gusanos sin subproductos bacterianos.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como el cultivo de lombrices en placas de agar o en medios líquidos con bacterias, es que los efectos de los elementos nutricionales o las toxinas se pueden probar sin confundir los subproductos bacterianos. Por lo general, los individuos nuevos en este método tendrán dificultades debido a la preparación del medio y la adaptación inicial de los gusanos al medio líquido EMIC. Este procedimiento describe la preparación de medios líquidos M-C-E-H-R-A que permiten que C elegance crezca sin una fuente de alimento bacteriana.

Utilizando una técnica estrictamente estéril bajo una campana, mezcle los componentes del M-C-E-H-R en el siguiente orden. Comience con colina, citrato de diac ácido y siga con la vitamina y el factor de crecimiento. Mezcle el acetol mio, el cloruro humano y, por último, agregue agua desionizada Filtre la mezcla M-C-E-H-R a través de un filtro de 0,22 micras con succión.

A continuación, en el siguiente orden, agregue el ácido nucleico, mezcle la mezcla de minerales, lact, albúmina, hidrolizado, aminoácidos esenciales, aminoácidos no esenciales, fosfato de potasio, deg, pila de glucosa, sal de sodio y agua desionizada. Ahora vuelve a filtrar la mezcla con succión. Después del filtrado, agregue colesterol al medio y luego verifique el pH de una alícuota de medio.

El pH debe estar entre seis y 6,5. Si la solución se preparó correctamente, agregue un 20% de volumen de la leche pasteurizada al medio M-C-E-H-R utilizando una técnica estéril escrupulosa. Almacene los medios a cuatro grados centígrados.

Tenga listas 10 placas NGM de 60 milímetros llenas de gusanos GR que han consumido la mayor parte de la OP 50 E coli disponible. Enjuague estos gusanos en un tubo cónico de 50 mililitros. Usando cinco mililitros de tampón M nine por placa, deje que los gusanos se asienten y luego retire con cuidado el sobrenadante.

Repita esto, enjuague dos veces más agregando tampón M nueve, permitiendo que los gusanos se asienten y eliminando el sobrenadante, luego agregue seis volúmenes de cloruro de sodio normal 0.1 al agregado de lombriz ahora en comparación con la suspensión de gusanos, prepare una mezcla de un volumen de cinco hidróxido de sodio normal y dos volúmenes de lejía fresca. Solución: Blanquea los gusanos añadiendo esta mezcla a la suspensión. Siguiente vórtice, se mezcla hasta que los gusanos de tumba se disuelven y solo quedan huevos en la suspensión.

Esto tarda entre cinco y 10 minutos. Utilice la microscopía de contraste de fase con un objetivo de 10 x para monitorizar esta reacción en el tubo. Una vez aislados los huevos, pellet a 800 G durante 45 segundos y a cuatro grados centígrados, aspirar el sobrenadante y enjuagar el pellet dos veces en 10 mililitros de agua estéril en la campana, repetir la centrifugación y aspiración para estos enjuagues.

A continuación, vuelva a suspender el pellet de huevo con medios M-C-E-H-R y transfiera los huevos liberados a un matraz de cultivo de tejidos. Añadir 100 microgramos por mililitro de tetraciclina a los huevos del matraz. Este paso debe llevarse a cabo en una campana de flujo laminar.

Utilizando técnicas estrictamente estériles, transfiera los cultivos líquidos a una incubadora de 20 grados centígrados y cultívelos en una plataforma orbital. Agitador a 70 RPM monitorea el desarrollo de los gusanos diariamente. Después de siete a 10 días, el gusano debe desarrollarse a la etapa Ravi, transferir los gusanos a un tubo cónico y granularlos a 800 G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados en un rotor de cubo oscilante.

Después de aspirar el sobrenadante, vuelva a suspender la bolita de lombriz en un volumen de cloruro de sodio 0,1 molar y deje que las lombrices se asienten en hielo durante cinco minutos. Ahora, repita el procedimiento de blanqueo antes mencionado y cultive los huevos en el medio líquido cénico. Al igual que antes, es esencial que se utilicen técnicas estériles cuando se cultivan los gusanos aliados.

Evitar el uso de antibióticos garantiza que los cultivos de elegancia marina estén libres de bacterias contaminantes. Cuando el proceso de cultivo se repite, la segunda generación emite la tetraciclina del medio. En este punto, las referencias culturales sincronizadas se pueden preparar para la sincronización.

Agregue 10 mililitros de tampón M nine a los huevos liberados después del blanqueo de los gusanos GR y déjelos eclosionar durante la noche a 20 grados Celsius en una plataforma orbital. Agitador al día siguiente, pellet las larvas a 800 G durante cinco minutos y resuspender las larvas L. En 10 mililitros de M-C-E-H-R, transfiera la suspensión a un matraz de 25 centímetros cuadrados y hágalos crecer hasta su máxima densidad.

Es necesario controlar el crecimiento de las lombrices cada pocos días para garantizar que las lombrices no se llenen demasiado y agoten los nutrientes disponibles en los medios. Para almacenar un cultivo de gusanos axen, suspenda un pellet de lombrices en 0,5 mililitros de tampón S en viales de almacenamiento, agregue un volumen de tampón S con 30% de glicerol. Luego, transfiera los viales a menos 80 grados Celsius, seguido de un almacenamiento a largo plazo en nitrógeno líquido para descongelar, los gusanos incuban el vial a 37 grados Celsius hasta que casi todo el hielo se derrita, lo que toma unos dos minutos.

Luego, en condiciones estériles, transfiéralos nuevamente a los medios M-C-E-H-R. Una ventaja de usar M-C-E-H-R se observó en estudios que examinaron el requerimiento exacto de nutrientes en el desarrollo de las lombrices. Los gusanos se cultivaron en M-C-E-H-R suplementados con cantidades crecientes de hemo para determinar los niveles bajos, óptimos y tóxicos de hemo.

Además, se utilizó una cepa reportera que respondía inversamente al hemo para evaluar indirectamente el estado del hemo de los gusanos en un rango más pequeño de concentraciones. Estos gusanos cultivados a cuatro micromolares de hemo mostraron una alta fluorescencia, lo que indica que los gusanos estaban en un ambiente de bajo hemo. Cuando la concentración de hemo se incrementó a ocho micromolares, la expresión de GFP disminuyó.

Cuando la concentración de hemo se incrementó a 10 micromolares, los gusanos mostraron muy poca expresión de GFP y a 20 micromolares de hemo, no mostraron expresión de GFP. Al intentar este procedimiento, es importante recordar utilizar técnicas escrupulosamente estériles para garantizar que los cultivos sean emic y evitar la contaminación bacteriana. Después de ver este video, debería poder hacer que M-C-E-H-R establezca y mantenga una cultura de elegancia marina xenex que se pueda utilizar para una amplia cantidad de aplicaciones, que requieren una gran cantidad de elegancia marina.