Un rastreable En Vivo Ensayo para mitocondrial Moduladores Usando transgénico bioluminiscente Caenorhabditis elegans

El objetivo general del siguiente experimento es identificar la toxicidad mitocondrial o los efectos beneficiosos de los fármacos utilizando el organismo modelo. C elegancia. Esto se logra mediante la cuantificación in vivo de los niveles de TP en cepas transgénicas de elgan marino que expresan la enzima crucífera de luciérnaga fusionada con la proteína fluorescente verde.

El gen de fusión confiere dos propiedades distintas a los nematodos. La primera es que cuando se les da el sustrato Lucifer, los nematodos emiten luz en el rango visible en proporción a sus reservas celulares de A TP. Y la segunda es que cuando se iluminan con la longitud de onda adecuada, exhibirán una fuerte fluorescencia verde.

La fluorescencia es independiente de los niveles de TP de los nematodos y es proporcional a su masa o número. Por lo tanto, se puede utilizar para normalizar las mediciones de bioluminiscencia. Durante un ensayo típico, una población de gusanos sincronizados en el desarrollo se cultiva hasta la etapa larvaria L cuatro.

A continuación, los nematodos se tratan con los compuestos del fármaco problema durante un período de tiempo antes de la medición de la fluorescencia y la bioluminiscencia. Los resultados muestran una posible toxicidad del fármaco. Cuando se reduce la bioluminiscencia, una señal mejorada indica un éxito para realizar más pruebas de efectos beneficiosos sobre la función mitocondrial.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como el cribado de fármacos en células cultivadas, es que el cribado se está llevando a cabo en el contexto fisiológico de un organismo pluricelular vivo completo con cerca del 50% de oftalmología genética para humanos. Y al igual que los humanos, la elegancia en realidad requiere una fosforilación oxidativa mitocondrial para desarrollarse en la edad adulta y sus mitocondrias también comparten con las mitocondrias de los mamíferos muchas características en términos de su estructura, su función, su bioenergética Los parámetros críticos dentro del protocolo incluyen la etapa de desarrollo en la que se iniciaron las exposiciones, la duración de la exposición al nematodo, al fármaco de interés y la siembra de un número similar de nematodos a cada uno de los pozos, y por supuesto, evitar la contaminación desde el primer día. En condiciones estériles, transfiera los nematodos de una placa de medio de crecimiento de nematodos de seis centímetros en dos mililitros de medio completo S a un matraz con 30 gramos por litro de E. coli.

OP 50 en medio S completo, luego incubar el matraz agitando el cuarto día, blanquear el cultivo de nematodos GR para recolectar los huevos y sincronizar la población de lombrices. Luego incubar los huevos durante la noche en un matraz de vidrio que contenga 15 mililitros de medio completo S con agitación al día siguiente, día cinco, los nematodos estarán en la misma etapa de crecimiento. Para determinar el número de gusanos eclosionados usando una punta limpia cada vez, transfiera tres alícuotas de 100 microlitros de nematodos a microtubos separados que contengan 900 microlitros de medio, complementados con 0.01% entre 20 pipeteos hacia arriba y hacia abajo varias veces para liberar cualquier lombriz adherida a la punta.

A continuación, cuente los nematodos en cuatro gotas separadas de 10 microlitros de cada uno de los tubos de dilución por triplicado, y calcule el volumen de la suspensión de nematodos necesaria para establecer dos cultivos de 20 mililitros con 10 nematodos por 10 microlitros, decantar los volúmenes aproximados en dos tubos cónicos de 15 mililitros prepesados. Pese los tubos para determinar el volumen real dispensado. Luego, para ajustar el vórtice de volúmenes objetivo, frote suavemente y elimine el exceso de volumen.

Ahora, lavar los nematodos en un total de 14 mililitros de S fresco, medio completo por tubo y resus suspender los pellets en cinco mililitros de medio completo S con 30 gramos por litro de equali. OP 50. Transfiera los nematodos a matraces de vidrio cónicos que contengan 15 mililitros de S completo con 30 gramos por litro de equali.

OP 50 a un volumen total de 20 mililitros por matraz y registrar el tiempo de alimentación. Promedie el número de nematodos en nueve gotas de 10 microlitros para confirmar que los cultivos se diluyen a 10 nematodos por 10 microlitros. Coloque los cultivos en la incubadora durante 42 a 44 horas.

En el séptimo día, coloque los cultivos de nematodos en un solo matraz con un remolino suave y continuo. Luego transfiera tres o cuatro mililitros de alícuotas de nematodos a un solo comedero estéril de 60 mililitros. Utilice una pipeta de ocho canales para Eloqua, 25 microlitros de nematodos en suspensión por pocillo en 96.

Placas de microtitulación bien negras con fondos planos y transparentes. Luego regrese las tapas a los platos y deje los platos a un lado. Cada vez que se hayan sembrado dos placas, transfiera otras dos alícuotas de 2,5 mililitros de nematodos al comedero para reemplazar el volumen perdido.

Después de sembrar de 13 a 14 placas con nematodos, agregue 74 microlitros de medio completo S a cada pocillo y transfiera las placas a una cámara húmeda y a una incubadora agitadora hasta la administración del medicamento, mientras las placas están agitando. Descongele 2 96 placas de fármaco soldadas para pruebas. A continuación, utilizando una pipeta multicanal y cambiando las puntas cada vez.

Transfiera un microlitro de la primera columna de la primera placa de medicamento a las columnas uno a cinco de una placa de nematodos. Transfiera otro microlitro de la segunda columna de la placa del medicamento a las columnas ocho a 12 de la placa del nematodo. Luego agregue un microlitro de vehículo a las columnas seis y siete de la placa de nematodos.

Use las columnas restantes en la placa del medicamento para tratar el resto de las placas de nematodos de la misma manera, asegurándose de incluir también dos placas tratadas para todos los vehículos. Luego, regrese todas las placas a las cámaras húmedas en la incubadora de agitación durante otras 20 a 22 horas el octavo día. Para preparar una placa de control de fondo para las lecturas de fluorescencia, combine el contenido del pocillo de una placa de nematodos tratada para todo el vehículo y deje que los nematodos se asienten durante dos o tres minutos.

A continuación, recoja las bacterias que contienen snat y cargue muestras de 100 microlitros en cada pocillo de una microplaca negra con un fondo transparente. Observe la placa bajo un microscopio, observando los pocillos en los que se pueden ver los nematodos para permitir la exclusión de estos pocillos de la estimación del fondo fluorescente. A continuación, lea la fluorescencia finalmente para medir la bioluminiscencia de cada placa.

A su vez, dispense 50 microlitros de tampón de luminiscencia recién preparado a cada uno, coloque bien el plato en una plataforma de agitación y encienda el temporizador después de tres minutos. Lea la luminiscencia a un segundo por medición. En este primer experimento representativo, la podredumbre, conocida como un inhibidor del complejo mitocondrial uno, redujo la salida de luz de los nematodos después de exposiciones relativamente cortas y más largas en un rango de concentraciones.

En este experimento, se demostró que el herbicida paraquat disminuye significativamente la fluorescencia de la bioluminiscencia, la fluorescencia GFP y la bioluminiscencia normalizada de la cepa C PE 2 54. Además, la disminución de la bioluminiscencia fue mayor que la de la fluorescencia, lo que es consistente con los efectos conocidos de la disminución de la función mitocondrial y la reducción de la producción de TP provocada por el fármaco. Este gráfico ilustra un ejemplo de un compuesto que mejora la bioluminiscencia del nematodo, el oxaloacetato intermedio del ciclo del ácido cítrico a una concentración única de ocho milimolares.

Nótese que la variabilidad experimental observada entre estas series replicadas no es inusual para los experimentos basados en Lucifer. Aquí, se observó que los compuestos inhibidores de la luciferasa de lucifera de luciérnaga afectaban la actividad in vitro de luciferes a 25 micromolares y 100 micromolares con una atenuación casi completa de la actividad por el compuesto DDD. 1, 4 3 4, aunque no es directamente comparable, también se observó una disminución significativa en la bioluminiscencia después del tratamiento con compuestos inhibidores de Lucifer in vivo.

Demostrando que los cambios en la bioluminiscencia pueden ser el resultado de la acción de los inhibidores de la enzima Lucifer en lugar de cambios en los niveles in vivo de A TP. Al llevar a cabo este procedimiento, es importante tener en cuenta que los compuestos pueden afectar directamente la actividad de la enzima luciferasa de la luciérnaga en lugar de afectar el estado energético del gusano. Y, por lo tanto, los subcalentamientos se pueden validar utilizando muchas técnicas para evaluar la función mitocondrial, como, por ejemplo, la determinación del consumo de oxígeno, la determinación del potencial de membrana mitocondrial de las especies reactivas de oxígeno o la visualización de las mitocondrias en cepas de elegancia marina.

Con etiqueta GFP, mitocondrias.