Protocolo de Estudos de Extinção do medo condicionado em Naturally Ciclismo ratas

O objetivo geral deste procedimento é examinar os efeitos dos hormônios gonadais no comportamento de extinção do medo em mulheres durante estados hormonais baixos e altos do ciclo Esra e o papel do estradiol quando administrado exogenamente. Isso é feito monitorando primeiro o ciclo de esra de ratos fêmeas adultos e identificando em qual fase eles estão antes da experimentação. Em seguida, os animais que estão na fase de estro são colocados em suas câmaras designadas para habitação e condicionamento do medo.

No dia seguinte, quando os animais estão no cio, as fêmeas são injetadas com estradiol ou veículo e passam por treinamento de extinção do medo. Finalmente, no terceiro dia, os animais são colocados de volta na mesma câmara para testar a lembrança da sessão de extinção no dia anterior. Em última análise, o esfregaço vaginal para identificação de estratos EST permite que os investigadores manipulem as flutuações naturais nos hormônios gonadais para estudar sua influência na memória de extinção do medo.

Este protocolo pode ser usado para ajudar a responder a questões-chave no campo das diferenças sexuais, como os processos de extinção do medo são diferentes em homens e mulheres? E em caso afirmativo, quais são os mecanismos hormonais e neurobiológicos que atendem a essas diferenças? A principal vantagem deste protocolo é que ele pode ajudar a promover o estudo da idade feminina na extinção do medo, compartilhando métodos para fazê-lo.

Pesquisadores novos nesses métodos geralmente lutam para monitorar de forma confiável o ciclo de eser porque o procedimento pode ser demorado e muito dependente da técnica adequada. As implicações desses estudos podem contribuir para opções de tratamento específicas do sexo para transtornos relacionados ao medo e à ansiedade. Isso pode ser importante, uma vez que as mulheres são duas vezes mais propensas do que os homens a desenvolver essas psicopatologias.

Lisa man, um pós-doutorado no laboratório, bem como cuidados secretos. Um assistente de pesquisa no laboratório mostrará o procedimento Para coletar amostras para monitorar o ciclo estral. Depois de preparar uma solução salina a 0,9%, mergulhe um aplicador com ponta de algodão no líquido e use uma toalha de papel para enxugar a ponta do excesso de solução, segurando a cauda de um rato para cima e tomando cuidado para não causar angústia.

Insira suavemente a ponta de algodão no canal vaginal não muito profundo e role-a pelas paredes para capturar as células vaginais soltas antes rapidamente. Removendo a ponta sem transferir muito fluido, role suavemente a ponta do aplicador em uma lâmina de microscópio pré-rotulada, garantindo que a amostra seja transferida para a lâmina. Colete amostras por pelo menos dois ciclos completos e transfira vários dias consecutivos em uma lâmina para poder rastrear e identificar melhor os extras diários de EST.

A fase muda uma vez que as lâminas estejam secas, mergulhe-as 10 vezes no fixador e depois 10 vezes na solução de coloração. E, finalmente, cinco vezes em solução de contracoloração. Enxágüe suavemente com água.

Deixe as lâminas secarem completamente ao ar antes de serem vistas ao microscópio antes do início do experimento de condicionamento, pré-expondo as fêmeas às câmaras de condicionamento com as luzes da casa acesas por 20 a 30 minutos por dia durante três dias para permitir que elas se aclimatem ao ambiente. Atribua a caixa à qual eles estão pré-expostos como sua câmara para o estudo. Limpe completamente as caixas entre as sessões e os animais para remover odores, pois eles podem afetar o comportamento e o ciclo de estresse da EST.

Uma vez verificado que os animais estão na fase estral do ciclo extra EST, iniciar a fase de condicionamento de habituação. Faça medições de linha de base de tom de congelamento antes do estímulo da condição do primeiro tom, medindo os segundos que o animal passa um móbile durante o estímulo. Intervalo de tempo ausente, calcule a pontuação percentual de congelamento dividindo o segundo gasto imóvel pela duração do teste.

Para realizar o treinamento de extinção durante a fase de estro da EM, condicione os ratos em seu último dia de ESTRO, conforme determinado por esfregaço. Colocar os animais na câmara de condicionamento e realizar um ensaio de habituação apenas no CS. Induza um tom de CS por 30 segundos.

Depois de esperar em média três minutos antes da próxima tentativa, repita a tentativa de CS sozinha mais quatro vezes para um total de cinco tentativas antes do condicionamento. Conecte o piso da grade de choque do pé a um gerador de estimulação elétrica. Use um nível de estimulação de 0,5 a 0,6 miliamperes como estímulo incondicionado ou US e um tom de 80 decibéis de quatro quilohertz como CS imediatamente após a sessão de habituação.

Comece as tentativas de condicionamento do medo com CS US emparelhadas apresentando um 32º tom de CS, seguido por um choque de US de 0,5 segundo separado por um intervalo entre tentativas de aproximadamente três minutos. Repita a tentativa pareada mais seis vezes no final da sessão de condicionamento. Devolva os animais às gaiolas de origem e ao biotério até o dia seguinte do segundo dia.

Depois de esfregar e identificar a fase estral da EM para todos os animais submetidos ao primeiro dia do protocolo, prepare estradiol suficiente em óleo de gergelim ou solução salina a 0,9% para que cada animal receba uma dose de 15 microgramas por quilograma para administrar o hormônio por via subcutânea. Levante a pele solta entre a escápula pelo pescoço em uma pitada suave e insira a seringa no triângulo formado pelas dobras cutâneas. 30 minutos após os animais receberem suas injeções, coloque-os nas câmaras de condicionamento e comece o treinamento de extinção realizando 20 CS sozinhos.

Testes, cada um consistindo em um 32º tom de quatro quilohertz, 80 decibéis com aproximadamente três minutos entre os testes, 24 horas depois. No terceiro dia, esfregue os animais que completaram as sessões nos dias um e dois após colocar os animais em suas câmaras de condicionamento designadas. Comece a sessão de recall de extinção realizando três testes de Cs sozinhos com aproximadamente três minutos entre os testes após a conclusão da sessão de recordação, retorne os animais às suas gaiolas de origem e analise os dados de acordo com o protocolo de texto neste protocolo de extinção do medo.

Os animais que se extinguiram bem e mantiveram a memória do treinamento de extinção exibiram baixo medo no último dia de testes comportamentais durante a recordação da extinção. Como demonstrado aqui, ratos machos e fêmeas não diferem significativamente na expressão de medo condicionado. Durante cada fase, uma diferença de sexo torna-se evidente quando os animais são analisados separadamente como grupos de fases ES de alto e baixo estrogênio.

Este gráfico mostra o efeito da fase estro na memória de extinção do medo, ratos fêmeas que passam por treinamento de extinção durante a fase de baixo estrogênio do ciclo extra EST. Não se lembre da memória de extinção no terceiro dia, bem como daqueles treinados em PROEs. No entanto, quando as fêmeas metri são injetadas por via subcutânea com uma dose de 15 microgramas por quilograma de estradiol antes da extinção, a consolidação do aprendizado da memória de extinção do medo parece ser aprimorada, conforme demonstrado pelo baixo congelamento durante a recordação da extinção.

Portanto, esses dados indicam que os hormônios gonadais podem modular a lembrança da extinção do medo e também mediar as diferenças sexuais nos comportamentos condicionados de extinção do medo. Procedimentos adicionais, como cirurgia de canulação e imuno-histoquímica, podem ser realizados em conjunto com o método descrito aqui para responder a perguntas como: onde o estradiol está agindo no cérebro para modular o medo, a extinção, a consolidação da memória e como o estradiol está alterando a atividade neuronal nessas regiões? Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma compreensão clara de como estudar a reciclagem natural de ratos fêmeas e a influência do estradiol na extensão ex clara.