Evaluación de la viabilidad de la inyección de grasa humana en ratones desnudos con micro-tomografía computarizada

El objetivo general de este procedimiento es describir un modelo de ratón que utiliza micro TC para comparar la retención de volumen entre las técnicas de diferimiento de la preparación y el suministro del injerto de grasa. Esto se logra procesando primero el lipo aspirado humano para obtener grasa lista para el injerto. El segundo paso es colocar injertos de grasa en el cuero cabelludo de ratones desnudos tímicos.

A continuación, se analiza semanalmente la supervivencia del injerto de grasa mediante ratones con tomografía computarizada, reconstruyendo imágenes y cuantificando la retención de volumen. El paso final es extraer el injerto de grasa al cabo de ocho semanas y compararlos por peso e histología. En última instancia, la microtomografía computarizada y la histología se utilizan para mostrar las diferencias en la calidad y la supervivencia del injerto de grasa.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como el pesaje de los injertos de grasa, es que permite visualizar y cuantificar objetivamente el volumen del injerto de grasa en múltiples puntos de tiempo después del injerto inicial sin tener que sacrificar al animal de estudio. La primera vez que tuvimos la idea de este método fue cuando comenzamos a utilizar la micro tomografía computarizada para analizar los defectos de la calva. Las implicaciones de esta técnica es que ofrece un modelo quirúrgico para todos los estudios que evalúan el injerto de grasa, la retención y la viabilidad.

Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque es difícil contener el injerto de grasa en la posición correcta sobre el cuero cabelludo. La demostración visual de esta técnica es fundamental, ya que los pasos de injerto y reconstrucción son difíciles de aprender porque hay numerosas etapas en las que una pequeña desviación en la técnica puede alterar el resultado. Utilizando el procedimiento de Coleman, obtenga tejido adiposo humano de las regiones del abdomen, el flanco y el muslo de pacientes femeninas sanas que se someten a una liposucción electiva.

Para procesar el lipo aspirado para el injerto, comience dejando que la grasa se asiente durante 30 minutos. El lipoaspirado generalmente se asienta en tres capas con aceite en la parte superior, grasa en el medio y sangre en la parte inferior. Aspire y deseche la capa superior de aceite seguida de la capa inferior de sangre.

Para eliminar aún más cualquier líquido tumescente restante o restos de células, centrifugar la grasa durante cinco minutos a 350 g y cuatro grados centígrados. Después de la centrifugación, aspire la capa inferior de sangre y la capa superior de aceite. Para calcular la cantidad de grasa necesaria para el injerto como se describe en el protocolo de texto, para realizar el injerto de grasa, obtenga ratones machos homocigotos hembra CD uno desnudos.

Para el estudio experimental, se eligieron ratones de entre ocho y 12 semanas de edad para inducir la anestesia. Coloque el ratón en una caja de extracción con una mezcla de oxígeno flúor al 2,5% a dos litros por minuto durante aproximadamente 10 minutos cuando la tasa de respiración del ratón haya disminuido. Confirme la sedación adecuada con un pellizco en el dedo del pie.

Aplique ungüento oftálmico lubricante veterinario en ambos ojos del ratón y coloque la nariz del ratón en un cono nasal, suministrando una mezcla de oxígeno flúor ISO al 2,5% a uno o dos litros por minuto. A continuación, configure un campo estéril debajo del mouse. A continuación, esterilizar el cuero cabelludo con yodo de povidona al 2,5%, seguido de una solución de etanol al 70%.

Repita la esterilización dos veces más. Cargue una jeringa de bloqueo de señuelo de un mililitro con un mililitro de grasa que se haya equilibrado a temperatura ambiente. Conecte una cánula de injerto de grasa de calibre 14 y ocho centímetros de largo al extremo de la jeringa.

Prepare el sistema presionando el émbolo de la jeringa hasta que queden entre 200 y 400 microlitros de grasa en la jeringa. Mientras presiona el émbolo de la jeringa, confirme que la cánula se ha llenado completamente de grasa observando la grasa que sale del orificio distal de la cánula con pinzas finas. Levanta la piel dorsal en la línea media que recubre la parte más cercana del cráneo.

Haz un corte de 1,5 milímetros en la piel con unas tijeras finas. Coloque una sutura de nailon de seis pulgadas en el centro del corte que luego se utilizará para unir los bordes de la herida. Después de realizar el injerto, no ate la sutura.

A continuación, cree una bolsa subcutánea sobre el cráneo insertando la cánula a través de la incisión en la piel y pasando la cánula de un lado a otro en un patrón en forma de abanico sobre el cráneo para liberar cualquier unión del tejido conectivo a la piel suprayacente una vez que se haya creado la bolsa, coloque la cánula en la línea media del ratón directamente sobre el cráneo hasta que la punta quede en el aspecto theramos de la bolsa, que debe estar justo detrás de una línea trazada entre los ojos. Inyecte lentamente la grasa de forma retrógrada, haciendo avanzar el émbolo mientras tira de la cánula hacia atrás. Con fórceps, junte los bordes de la herida y levántelos para evitar que la grasa se escape de la bolsa.

Ata la sutura que se colocó previamente, asegurándote de que el primer nudo quede ligeramente contra la piel. Haz tres nudos cuadrados más y corta la sutura con una cola de tres milímetros. Retire el mouse de la anestesia y proceda con la recuperación como se detalla en el protocolo de texto.

Antes de realizar la primera exploración, calibre la micro tomografía computarizada con un maniquí de imágenes que distinga entre la intensidad del aire, el agua y los huesos. Después de la calibración. Coloque cuatro ratones en el escáner en posición ventral con dos ratones en la parte superior y dos en la parte inferior.

Colóquelo sobre una cama de escaneo. Anteriormente construido a partir de jeringas de 60 mililitros para sostener el cuerpo del ratón y jeringas de 10 mililitros como conos nasales. Confirme con una imagen de exploración que se tomará una imagen de todo el cráneo del ratón, desde la nariz hasta la primera vértebra cervical y desde la parte superior del cráneo hasta la base del cráneo.

Continúe con el escaneo como se detalla en el protocolo de texto. Abra las imágenes reconstruidas con un software de análisis de imágenes micro CT que permite la creación de regiones de interés o ROI mediante la selección de vóxeles utilizando umbrales para la intensidad de píxeles. Comience cargando las imágenes de TC reconstruidas en vistas bidimensionales, coronal, axial y sagital.

Usando el corte axial como guía, navegue hasta el corte sagital que corresponde al aspecto más a la izquierda del injerto de grasa. Seleccione un umbral superior e inferior para la intensidad de píxeles que capture todos los vóxeles correspondientes al injerto de grasa, pero que excluya el tejido y el hueso circundantes. Definir un ROI en la vista sagital que corresponde al injerto de grasa.

Utilizando umbrales de intensidad de píxeles previamente definidos, repita este procedimiento cada quinto corte sagital navegando hasta alcanzar el aspecto más a la derecha del injerto. A continuación, interpole los vóxeles seleccionados de todos los ROI 2D en un solo ROI 3D combinado, registre el volumen de ROI calculado por el software. Renderice la isosuperficie 3D para visualizar el volumen final del injerto de grasa.

En el análisis posterior, asegúrese de mantener los valores de umbral máximo y mínimo de intensidad de píxeles iguales a los utilizados para el análisis de referencia después de que los ratones hayan sido escaneados durante el punto de tiempo de la semana ocho. Eutanasiar a los ratones como se describe en el protocolo de texto. Coloque el ratón en el campo operatorio con unas tijeras de tenotomía, abra con cuidado el bolsillo y las uniones de piel y tejido conectivo suprayacentes del injerto de grasa.

En este punto, puede ser útil extirpar un parche de la piel dorsal suprayacente para ayudar a la extracción del injerto. Permanezca lo más cerca posible del injerto cuando realice la extirpación para minimizar el tejido conectivo que se extrae del injerto después de la extirpación del injerto. Mida la masa en una escala rasgada que tenga una precisión de al menos 0,01 gramos.

Los injertos de grasa disminuyeron progresivamente en volumen a lo largo del estudio, lo que resultó en una supervivencia media del 62,2% en la octava semana. Al finalizar la exploración de la semana ocho, cada injerto de grasa se extrajo en una sola pieza. Se utilizó una prueba de suma de rangos de coxina WIL para comparar la diferencia entre las mediciones de volumen del injerto de grasa obtenidas por micro TC o calculadas a partir de la masa física.

No se encontraron diferencias significativas entre estos dos métodos. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en dos horas por sesión si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar realizar las cirugías y reconstrucciones de la misma manera cada vez que siga este procedimiento.

Se pueden realizar otros métodos, como la tinción inmunológica y Q-R-T-P-C-R, para responder a preguntas adicionales, como cómo influyen la vascularización y la expresión génica en los diferentes métodos de injerto. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo procesar el lipo aspirado para injertar en serie, los injertos de tomografía computarizada in vivo, evaluar la supervivencia del injerto y explanificar los injertos para la histología del peso y el análisis futuro después de su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la cirugía plástica exploraran el injerto de grasa en el modelo de espejo.