Name: Evaluación de la viabilidad de la inyección de grasa humana en ratones desnudos con micro-tomografía computarizada (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Aprende a evaluar la retención de injertos de grasa en ratones desnudos mediante micro-tomografía computarizada. Este método permite cuantificar objetivamente la viabilidad del injerto en múltiples puntos temporales sin sacrificar al animal.

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Este estudio fue apoyado por la Fundación Oak, el Laboratorio Hagey Pediátrica Medicina Regenerativa, y el Instituto Nacional de Salud, Becas NIHR21DE019274, NIHR01DE019434, NIHR01DE021683 y NIHU01HL099776 a MTLDCW fue apoyado por la AEC Franklin H. Martin Facultad de Becas de Investigación, la Hagey Laboratorio de Pediatría Medicina Regenerativa, y el Premio Académico Facultad Instituto de Investigación de Salud Infantil de la Universidad de Stanford. Micro-CT se llevó a cabo en el Centro de Stanford para la Innovación en imágenes in vivo.

NOTA: Los protocolos experimentales y formularios de consentimiento de los pacientes para la obtención de grasa fueron revisados ​​y aprobados por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Stanford (Protocolo # 2188). Todos los animales procedimientos fueron aprobados por el grupo administrativo de Stanford en Laboratorio Animal Care (APLAC) en virtud del protocolo # 9999. Todos los experimentos se llevaron a cabo con estricto apego a la seguridad de los animales y las directrices cuidado humano. 1. Fat cosecha <ol><li> Usando el procedimiento Coleman 17-19, obtener tejido adiposo humano desde el abdomen, flanco, y / o regiones del muslo de pacientes femeninos sanos sometidos a liposucción electiva. </li><li> Para procesar la lipoaspirado para el injerto, comenzará al permitir que la grasa se asiente durante 30 minutos. </li><li> Lipoaspirado normalmente se asienta en tres capas, con aceite en la parte superior, la grasa en el medio, y la sangre en la parte inferior. Aspirar y desechar la capa de aceite superior y la capa inferior de la sangre. </li><li> Para quitar aún más cualquier tumesc restantefluido ent o restos de células, se centrifuga la grasa durante 5 min a 350 xg y 4 ° C, y aspirar la capa acuosa inferior. </li><li> Calcular la cantidad de grasa necesaria para el injerto, permitiendo error de entrega 20%, y transferir el volumen deseado de grasa a 50 ml cónico (s). Multiplicar 400 por el número de ratones en el estudio para obtener microlitros de grasa necesaria para el injerto. </li><li> En este punto, si se realiza la célula Asistida trasplante de grasa 20,21, lugar volumen de grasa para injertar en el hielo. Entonces cosechar células derivadas de tejido adiposo del estroma (ASC) de la grasa restante utilizando la técnica estándar descrita por Zuk et al 22. </li></ol> 2. injerto de grasa <ol><li> Obtener femenino, homocigotos CD-1 ratones desnudos para el estudio experimental. Elige ratones entre 8 - 12 semanas de edad. </li><li> Para inducir la anestesia, el lugar del ratón en una caja de caída con 2,5% de mezcla de isoflurano / oxígeno a 2 L / min durante aproximadamente 10 min. Tenga en cuenta que ISOF recomendadolurane dosis varía con la cepa de ratón. </li><li> Cuando la tasa de respiración del ratón se ha desacelerado, confirmar sedación adecuada con una pizca dedo del pie. Aplicar veterinaria pomada oftálmica lubricante a los dos ojos del ratón. </li><li> Si el ratón no se inmuta en respuesta a la pizca dedo del pie, lo que confirma un avión suficiente de la anestesia. Coloque la nariz del ratón en una ojiva entregar 2,5% de mezcla de isoflurano / oxígeno a 2.1 L / min. Si ratón retrae de pizca dedo del pie, volver al cuadro de derribo y nueva prueba después de 5 minutos. </li><li> Establecer campo estéril bajo el ratón y luego esterilizar cuero cabelludo con 2,5% de povidona yodada seguido de una solución de etanol al 70%. Repite dos veces más. </li><li> Coloque paños quirúrgicos sobre el ratón y tenga cuidado de mantener el campo estéril. Los instrumentos estériles, guantes y PPE se deben utilizar en todo momento. </li><li> Si el volumen de grasa a injertar se colocó previamente en hielo, deje que la grasa que ajustar primero a RT antes de la entrega. </li><li> BackLoad una jeringa luer-lock 1 ml con 1 mlde grasa. </li><li> Conectar un 14 G, 8 cm de grasa cánula larga injerto hasta el final de la jeringa. </li><li> Primer sistema presionando el émbolo de la jeringa hasta entre 200 y 400 l de grasa permanece en la jeringa. Mientras oprime el émbolo de la jeringa confirmar que la cánula ha llenado totalmente con la grasa mediante la observación de la grasa que sale del orificio distal de la cánula. </li><li> Usando unas pinzas finas, levantar la piel dorsal en la línea media que recubre el caudal-aspecto más del cráneo. Hacer un 1.5 mm cortadas en la piel con unas tijeras finas. </li><li> Coloque una sola sutura de nylon 6-0 a través de medio de la corte que posteriormente se utiliza para lograr bordes de la herida juntos después se realiza el injerto. No ate la sutura. </li><li> Crear un bolsillo subcutáneo sobre el cráneo mediante la inserción de la cánula a través de la incisión de la piel y pasando la cánula de ida y vuelta en un patrón en forma de abanico sobre el cráneo para liberar los archivos adjuntos del tejido conjuntivo a la piel suprayacente. </li><li> Una vez que el bolsillo se ha creado, coloque el cannula en la línea media del ratón directamente sobre el cráneo hasta la punta se encuentra en el rostral-más aspecto de la bolsa que debe ser justo detrás de una línea trazada entre los ojos. (Figura 1A) </li><li> Lentamente inyectar la grasa en una forma retrógrada, avanzar el émbolo mientras tira de la cánula de la espalda. Con unas pinzas, lleve los bordes de la herida juntos y levantarlos para mantener la grasa se filtre fuera del bolsillo. </li><li> Ate la sutura que se colocó anteriormente, asegurándose de que el primer nudo se encuentra ligeramente contra la piel. Ate tres más nudos cuadrados y cortar la sutura con una cola de 3 mm. (Figura 1B) </li><li> Confirme con la visualización y palpación manual que el bolsillo no está sobrecargada y que cubre el bolsillo de la piel no es tensa. Si la bolsa se ha llenado en exceso, cortar la sutura y quitar toda la grasa de dentro de la bolsa. Lavar el bolsillo a cabo con tampón fosfato salino (PBS) pH 7,4 y volver a inyectar un volumen más pequeño de grasa. </li><li> Retire del ratón de unnesthesia y colocar en su parte posterior o lateral en una jaula limpia por sí mismo. Monitorear el animal para la respiración regular, los movimientos normales, ausencia de sangrado, y signos de dolor o angustia. Administrar buprenorfina 0,1 mg / kg por vía subcutánea cada 6 horas durante un máximo de 48 horas si el animal está en el dolor. </li><li> Asegúrese de que el animal ha despertado lo suficiente como para mantener decúbito esternal antes de dejarla desatendida. No coloque animal en una jaula con otros animales hasta que se haya recuperado por completo. </li><li> Después de 4 horas, asegúrese de que el animal es capaz de comer y beber, moverse y respirar con normalidad y que no hay sangrado en el sitio de la operación. Lleve la unidad a las instalaciones de cuidado de los animales. </li></ol> 3. Micro-CT <ol><li> Ratones Scan para el volumen de línea de base por día postoperatorio 3, y luego repetir las exploraciones en las semanas después de la operación 2, 4, 6 y 8. </li><li> Cuando imágenes de los ratones en cada punto de tiempo, siga las pautas de sedación y cuidado de los animales antes y después del procedimiento como se indica anteriormente en S02.02 a 02.04 y de 02.17 a 02.19 los PTE. </li><li> Realizar análisis bajo un escáner micro-CT con un tamaño de voxel reconstrucción de 100 micras o mejor. </li><li> Con un kilovoltage de rayos X de pico de 80 kVp y una corriente de ánodo de 450 mu, administrar una dosis de ración de aproximadamente 5 centiGy durante una exploración de 9 min para cada ratón. Tenga en cuenta estos valores varían dependiendo del protocolo de exploración. </li><li> Antes de realizar la primera exploración, calibre micro-CT con un fantasma de imagen que distingue entre el aire, el agua, y la intensidad de los huesos. </li><li> Coloque cuatro ratones en el escáner en la posición ventral con dos ratones en la parte superior y dos en la parte inferior. Una cama de exploración puede ser fácilmente construido utilizando 60 ml jeringas para sujetar el cuerpo del ratón y jeringas de 10 ml como conos de ojiva. 23 </li><li> Mantener ratones bajo anestesia con una mezcla de isoflurano / oxígeno 2.5% a 2.1 L por minuto. </li><li> Confirme imagen scout con el que todo el cráneo del ratón, desde la nariz hasta la primera vértebra cervical, y de arriba del cráneo hasta la base del skull, se va a ver. </li></ol> Análisis 4. Micro-CT <ol><li> Abra las imágenes reconstruidas con un micro-CT de imágenes de software de análisis que permite la creación de regiones de interés (ROI) mediante la selección de voxels utilizando umbrales de intensidad de los píxeles. El software también permite la creación de superficies 3D mediante la interpolación de voxels seleccionados, y para el análisis del volumen. </li><li> Comience por cargar las imágenes de TC reconstruidas en dos dimensiones (2D) coronal, axial y sagital. (Figura 2A) </li><li> Utilizando el corte axial como guía, vaya a la rebanada sagital que corresponde al aspecto más a la izquierda del injerto de grasa. Seleccionar un umbral superior e inferior para la intensidad de los píxeles que captura todos los voxels correspondientes al injerto de grasa, pero que excluye el tejido circundante y hueso. (Figura 2B) </li><li> Definir una ROI en la vista sagital que corresponde al injerto de grasa usando umbrales de intensidad de píxel previamente definidos. REPEAT este procedimiento cada quinta rebanada sagital, navegar hasta que se alcanza más a la derecha aspecto del injerto. (Figura 2C) </li><li> Interpolar voxels seleccionados de todas las ROI de 2D en una sola, combinada ROI 3D. (Figura 2D) </li><li> Volumen ROI Record calculado por el software. </li><li> Render del isosuperficie 3D para visualizar el volumen final del injerto de grasa. (Figura 2E) </li><li> En los análisis posteriores, asegúrese de mantener los valores mínimo umbral máxima intensidad de los píxeles y los mismos que los utilizados para el análisis de referencia. </li></ol> 5. La grasa de la cosecha <ol><li> Después de ratones han sido escaneados para la semana 8 24,25 punto de tiempo, anestesiar a los ratones como se describe anteriormente anteriormente en los pasos 2.2 a 2.4 y 2.17 a 2.19. </li><li> Siguiendo directrices APLAC, la eutanasia a los ratones mediante la separación de sus columnas vertebrales. </li><li> Coloque el ratón en el campo operatorio. Con unas tijeras de tenotomía, abrir cuidadosamente el bolsillo y diseccionar tque recubre la piel y anexos del tejido conectivo del injerto de grasa. </li><li> En este punto, puede ayudar para escindir un parche de la piel dorsal suprayacente para ayudar en la extracción del injerto. (Figura 3A) </li><li> Ligeramente mantener la tracción sobre el injerto con unas pinzas y gire injerto de lado a lado para visualizar los sucesivos puntos de tensión que deben ser liberados con unas tijeras. </li><li> Manténgase lo más cerca del injerto como sea posible cuando la escisión de minimizar el tejido conectivo se toma con el injerto. (Figura 3B) </li><li> Después de la escisión de injerto, medir la masa en una escala tarado que tiene una precisión de al menos 0,01 gramos. </li><li> Calcular el volumen del injerto de grasa utilizando el valor de la masa medida y la densidad media de la grasa humana (0,9 g / ml) como una tasa de conversión. </li><li> Comparar volumen calculado de injerto de grasa a la obtenida usando micro-CT. </li><li> Injertos de grasa pueden ser procesados ​​para histología o su posterior análisis, si es necesario. </li></ol>

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Ninguno de los autores tiene ningún interés financiero competitivo para informar.

Hasta este punto, la mayoría de los investigadores se han basado en modalidades no de imagen para cuantificar la supervivencia a largo plazo de los injertos de grasa, pero estos métodos requieren el sacrificio del animal estudio y producir una sola medición. 3,10-12 Nuestro estudio representa un método de análisis mejorado que permite objetivo, la cuantificación en tiempo real de grasa supervivencia del injerto en un modelo de ratón. Crítico en este proceso es garantizar que los r...

Los defectos de los tejidos blandos surgen de una variedad de causas que incluyen traumatismos, resección de tumores, envejecimiento y anomalías congénitas. Pueden ser debilitantes para los pacientes y representan uno de los problemas más comunes, pero desafiantes, para los cirujanos reconstructivos. Existen muchos métodos para tratar las deficiencias de los tejidos blandos, como los colgajos locales y libres, las inyecciones de colágeno y los rellenos sintéticos. 4-8 Sin embargo, desde su primer uso documentado por Neuber en 18931, la transferencia de grasa autóloga sigue siendo el estándar de oro para la reparación de los déficits de tejidos blandos, ya que está disponible, es fácil y segura de recolectar, y naturalmente compatible. 1,2
A pesar de estas ventajas, los injertos de grasa autóloga sufren de una supervivencia impredecible y variable, con tasas de retención que oscilan entre el 10 y el 80% a lo largo del tiempo. 1-3,9 Con el fin de explicar esta pérdida esperada de volumen y simetría, los cirujanos a menudo deben corregir en exceso al rellenar los defectos de los tejidos blandos, o realizar múltiples procedimientos de seguimiento.
Los lechos de injerto mal vascularizados son en parte culpables de esta reabsorción de tejidos. Además, la falta de un método de análisis de referencia para comparar la supervivencia del injerto también puede contribuir a la inconsistencia en los resultados informados. Un método preciso para medir el volumen del injerto reduciría el error de medición al evaluar las tasas de retención. Esto, a su vez, ayudaría a los investigadores a identificar con mayor precisión los factores causales que afectan la supervivencia del injerto. Aunque muchos modelos de animales de laboratorio han facilitado la evaluación cuantitativa y cualitativa de la supervivencia del injerto de grasa humana, la mayoría se basan en medios histológicos y bioquímicos y requieren sacrificar el animal de estudio para obtener una sola medición. 3,10-12 Poco se ha reportado sobre el uso de técnicas de imagen para enumerar la retención de volumen del injerto de grasa in vivo.
Un puñado de estudios clínicos han demostrado técnicas de medición más efectivas utilizando imágenes. La resonancia magnética (RM) fue empleada por Hörl et al. para medir la supervivencia del injerto de grasa13, y la TC fue utilizada por Har-Shai et al. y Fontdevila et al. en sus análisis de retención de volumen tras injerto en pacientes enfermos de VIH. 14,15 Empleando software de imágenes tridimensionales (3D), Meier et al. Se midió la retención de volumen en humanos después del injerto de grasa autóloga comparando imágenes del período preoperatorio y postoperatorio. 16
Sin embargo, en la investigación científica básica falta un método estandarizado que emplee imágenes para medir la supervivencia del injerto de grasa. Un enfoque de imagen de alta resolución para evaluar los volúmenes de los injertos de grasa permitiría no solo mediciones de volumen precisas y reproducibles, sino también mediciones repetidas que permitieran visualizar la evolución de la supervivencia del injerto de grasa en tiempo real.

<table><tbody>Centrífuga <tr><td>lipoaspirada</td><td></td><td></td><td></td>SAL</tr><tr><td></td><td>Beckman Coulter, Inc., Pasadena, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubos cónicos de 50 ml</td><td>BD Biosciences, San José, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ratones desnudos CD-1 (Crl:CD1-Foxn1nu)</td><td>Charles River Laboratories, Inc., Wilmington, MA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Henry Schein, Dublín, OH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2.5% Betadine</td><td>Purdue Pharma, L.P., Stamford, CT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>70% Solución de etanol&nbsp;</td><td>Gold Shield, Hayward, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jeringa Luer-Lock de 1 cc</td><td>BD Biosciences, San José, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cánula de calibre 14</td><td>Shippert Medical, Centennial, CO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinzas</td><td>Fine Science Tools, Heidelberg, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de tenotomía</td><td>Fine Science Tools, Heidelberg, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>6-0 sutura de nailon</td><td>Ethicon, Blue Ash, OH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato</td><td>Gibco, Carlsbad, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>escáner de micro-CT&nbsp;</td><td>Siemens Healthcare, Pleasanton, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phantom &nbsp;</td><td>TriFoil Imaging, Northridge, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software de análisis de imágenes</td><td>IRW, Siemens Healthcare, Pleasanton, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scale&nbsp;</td><td>Mettler-Toledo International, Inc., Columbus, OH</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

evaluación de la viabilidad de la inyección de grasa humana en ratones desnudos con micro-tomografía computarizada

Assessment of Viability of Human Fat Injection into Nude Mice with Micro-Computed Tomography

Trasplante de grasa es una herramienta vital en el arsenal del cirujano para el tratamiento de los déficits de los tejidos blandos de todo el cuerpo. La grasa es el relleno de tejido blando ideales, ya que es fácilmente disponible, fácil de obtener, de bajo costo, e inherentemente biocompatible. 1 Sin embargo, a pesar de su creciente popularidad, el injerto de grasa se ​​ve obstaculizada por resultados impredecibles y la supervivencia variable de injerto, con tasas de retención publicados que van desde 10 -80%. 1-3 Para facilitar las investigaciones sobre el injerto de grasa, por lo tanto, hemos desarrollado un modelo animal que permite el análisis en tiempo real de la retención de volumen de grasa inyectada. Brevemente, una pequeña incisión en el cuero cabelludo de un CD-1 de ratón desnudo y 200-400 l de lipoaspirado procesado se coloca sobre el cráneo. El cuero cabelludo es elegido como el sitio receptor debido a su ausencia de grasa subcutánea nativo, y debido a la excelente contraste de fondo proporcionada por la bóveda craneal, que ayuda enel proceso de análisis. La tomografía computarizada de Micro (micro-CT) se utiliza para explorar el injerto al inicio del estudio y cada dos semanas a partir de entonces. Las imágenes de TC se reconstruyen, y un software de imagen se utiliza para cuantificar los volúmenes de injerto. Tradicionalmente, las técnicas para evaluar el volumen de grasa injerto han necesitado la eutanasia del animal estudio para proporcionar una sola evaluación del peso del injerto y el volumen de medición física ex vivo. Comparaciones bioquímicos e histológicos han requerido igualmente el animal estudio que ser sacrificados. Esta técnica de imagen descrito ofrece la ventaja de visualizar y cuantificar objetivamente el volumen en múltiples momentos después del injerto inicial sin tener que sacrificar el animal estudio. La técnica está limitada por el tamaño del injerto capaz de ser inyectado como la piel injertos más grandes riesgos y necrosis grasa. Este método tiene utilidad para todos los estudios que evalúan la viabilidad del injerto de grasa y retención de volumen. Es particularmente bien adaptado a providing de una representación visual de los injertos de grasa y después de los cambios de volumen en el tiempo.

Injertos de grasa disminuyeron progresivamente en volumen durante el curso de estudio, resultando en 62.2% de supervivencia media en la Semana 8. (Figura 4A) 24 A la finalización de la exploración Semana 8, cada injerto de grasa se ​​extrajo en una sola pieza. Se utilizó una prueba Wilcoxan suma de rangos para comparar la diferencia entre las mediciones de volumen de los injertos de grasa obtenidos por cualquiera de las micro-CT o calculados a partir de la masa física. No se encontraron difer...

El injerto de grasa es una técnica esencial para reconstruir los déficits de tejidos blandos. Sin embargo, sigue siendo un procedimiento impredecible caracterizado por una supervivencia variable del injerto. Nuestro objetivo era diseñar un modelo de ratón que utilizara un nuevo método de imagen para comparar la retención de volumen entre diferentes técnicas de preparación y administración de injertos de grasa.

Evaluación de la viabilidad de la inyección de grasa humana en ratones desnudos con micro-tomografía computarizada

Lipotransfer is a vital tool in the surgeon&#8217;s armamentarium for the treatment of soft tissue deficits of throughout the body. Fat is the ideal soft ...

El objetivo general de este procedimiento es describir un modelo de ratón que utiliza micro TC para comparar la retención de volumen entre las técnicas de diferimiento de la preparación y el suministro del injerto de grasa. Esto se logra procesando primero el lipo aspirado humano para obtener grasa lista para el injerto. El segundo paso es colocar injertos de grasa en el cuero cabelludo de ratones desnudos tímicos.A continuación, se analiza semanalmente la supervivencia del injerto de grasa mediante ratones con tomografía computarizada, reconstruyendo imágenes y cuantificando la retención de volumen. El paso final es extraer el injerto de grasa al cabo de ocho semanas y compararlos por peso e histología. En última instancia, la microtomografía computarizada y la histología se utilizan para mostrar las diferencias en la calidad y la supervivencia del injerto de grasa.La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como el pesaje de los injertos de grasa, es que permite visualizar y cuantificar objetivamente el volumen del injerto de grasa en múltiples puntos de tiempo después del injerto inicial sin tener que sacrificar al animal de estudio. La primera vez que tuvimos la idea de este método fue cuando comenzamos a utilizar la micro tomografía computarizada para analizar los defectos de la calva. Las implicaciones de esta técnica es que ofrece un modelo quirúrgico para todos los estudios que evalúan el injerto de grasa, la retención y la viabilidad.Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque es difícil contener el injerto de grasa en la posición correcta sobre el cuero cabelludo. La demostración visual de esta técnica es fundamental, ya que los pasos de injerto y reconstrucción son difíciles de aprender porque hay numerosas etapas en las que una pequeña desviación en la técnica puede alterar el resultado. Utilizando el procedimiento de Coleman, obtenga tejido adiposo humano de las regiones del abdomen, el flanco y el muslo de pacientes femeninas sanas que se someten a una liposucción electiva.Para procesar el lipo aspirado para el injerto, comience dejando que la grasa se asiente durante 30 minutos. El lipoaspirado generalmente se asienta en tres capas con aceite en la parte superior, grasa en el medio y sangre en la parte inferior. Aspire y deseche la capa superior de aceite seguida de la capa inferior de sangre.Para eliminar aún más cualquier líquido tumescente restante o restos de células, centrifugar la grasa durante cinco minutos a 350 g y cuatro grados centígrados. Después de la centrifugación, aspire la capa inferior de sangre y la capa superior de aceite. Para calcular la cantidad de grasa necesaria para el injerto como se describe en el protocolo de texto, para realizar el injerto de grasa, obtenga ratones machos homocigotos hembra CD uno desnudos.Para el estudio experimental, se eligieron ratones de entre ocho y 12 semanas de edad para inducir la anestesia. Coloque el ratón en una caja de extracción con una mezcla de oxígeno flúor al 2,5% a dos litros por minuto durante aproximadamente 10 minutos cuando la tasa de respiración del ratón haya disminuido. Confirme la sedación adecuada con un pellizco en el dedo del pie.Aplique ungüento oftálmico lubricante veterinario en ambos ojos del ratón y coloque la nariz del ratón en un cono nasal, suministrando una mezcla de oxígeno flúor ISO al 2,5% a uno o dos litros por minuto. A continuación, configure un campo estéril debajo del mouse. A continuación, esterilizar el cuero cabelludo con yodo de povidona al 2,5%, seguido de una solución de etanol al 70%.Repita la esterilización dos veces más. Cargue una jeringa de bloqueo de señuelo de un mililitro con un mililitro de grasa que se haya equilibrado a temperatura ambiente. Conecte una cánula de injerto de grasa de calibre 14 y ocho centímetros de largo al extremo de la jeringa.Prepare el sistema presionando el émbolo de la jeringa hasta que queden entre 200 y 400 microlitros de grasa en la jeringa. Mientras presiona el émbolo de la jeringa, confirme que la cánula se ha llenado completamente de grasa observando la grasa que sale del orificio distal de la cánula con pinzas finas. Levanta la piel dorsal en la línea media que recubre la parte más cercana del cráneo.Haz un corte de 1,5 milímetros en la piel con unas tijeras finas. Coloque una sutura de nailon de seis pulgadas en el centro del corte que luego se utilizará para unir los bordes de la herida. Después de realizar el injerto, no ate la sutura.A continuación, cree una bolsa subcutánea sobre el cráneo insertando la cánula a través de la incisión en la piel y pasando la cánula de un lado a otro en un patrón en forma de abanico sobre el cráneo para liberar cualquier unión del tejido conectivo a la piel suprayacente una vez que se haya creado la bolsa, coloque la cánula en la línea media del ratón directamente sobre el cráneo hasta que la punta quede en el aspecto theramos de la bolsa, que debe estar justo detrás de una línea trazada entre los ojos. Inyecte lentamente la grasa de forma retrógrada, haciendo avanzar el émbolo mientras tira de la cánula hacia atrás. Con fórceps, junte los bordes de la herida y levántelos para evitar que la grasa se escape de la bolsa.Ata la sutura que se colocó previamente, asegurándote de que el primer nudo quede ligeramente contra la piel. Haz tres nudos cuadrados más y corta la sutura con una cola de tres milímetros. Retire el mouse de la anestesia y proceda con la recuperación como se detalla en el protocolo de texto.Antes de realizar la primera exploración, calibre la micro tomografía computarizada con un maniquí de imágenes que distinga entre la intensidad del aire, el agua y los huesos. Después de la calibración. Coloque cuatro ratones en el escáner en posición ventral con dos ratones en la parte superior y dos en la parte inferior.Colóquelo sobre una cama de escaneo. Anteriormente construido a partir de jeringas de 60 mililitros para sostener el cuerpo del ratón y jeringas de 10 mililitros como conos nasales. Confirme con una imagen de exploración que se tomará una imagen de todo el cráneo del ratón, desde la nariz hasta la primera vértebra cervical y desde la parte superior del cráneo hasta la base del cráneo.Continúe con el escaneo como se detalla en el protocolo de texto. Abra las imágenes reconstruidas con un software de análisis de imágenes micro CT que permite la creación de regiones de interés o ROI mediante la selección de vóxeles utilizando umbrales para la intensidad de píxeles. Comience cargando las imágenes de TC reconstruidas en vistas bidimensionales, coronal, axial y sagital.Usando el corte axial como guía, navegue hasta el corte sagital que corresponde al aspecto más a la izquierda del injerto de grasa. Seleccione un umbral superior e inferior para la intensidad de píxeles que capture todos los vóxeles correspondientes al injerto de grasa, pero que excluya el tejido y el hueso circundantes. Definir un ROI en la vista sagital que corresponde al injerto de grasa.Utilizando umbrales de intensidad de píxeles previamente definidos, repita este procedimiento cada quinto corte sagital navegando hasta alcanzar el aspecto más a la derecha del injerto. A continuación, interpole los vóxeles seleccionados de todos los ROI 2D en un solo ROI 3D combinado, registre el volumen de ROI calculado por el software. Renderice la isosuperficie 3D para visualizar el volumen final del injerto de grasa.En el análisis posterior, asegúrese de mantener los valores de umbral máximo y mínimo de intensidad de píxeles iguales a los utilizados para el análisis de referencia después de que los ratones hayan sido escaneados durante el punto de tiempo de la semana ocho. Eutanasiar a los ratones como se describe en el protocolo de texto. Coloque el ratón en el campo operatorio con unas tijeras de tenotomía, abra con cuidado el bolsillo y las uniones de piel y tejido conectivo suprayacentes del injerto de grasa.En este punto, puede ser útil extirpar un parche de la piel dorsal suprayacente para ayudar a la extracción del injerto. Permanezca lo más cerca posible del injerto cuando realice la extirpación para minimizar el tejido conectivo que se extrae del injerto después de la extirpación del injerto. Mida la masa en una escala rasgada que tenga una precisión de al menos 0,01 gramos.Los injertos de grasa disminuyeron progresivamente en volumen a lo largo del estudio, lo que resultó en una supervivencia media del 62,2% en la octava semana. Al finalizar la exploración de la semana ocho, cada injerto de grasa se extrajo en una sola pieza. Se utilizó una prueba de suma de rangos de coxina WIL para comparar la diferencia entre las mediciones de volumen del injerto de grasa obtenidas por micro TC o calculadas a partir de la masa física.No se encontraron diferencias significativas entre estos dos métodos. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en dos horas por sesión si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar realizar las cirugías y reconstrucciones de la misma manera cada vez que siga este procedimiento.Se pueden realizar otros métodos, como la tinción inmunológica y Q-R-T-P-C-R, para responder a preguntas adicionales, como cómo influyen la vascularización y la expresión génica en los diferentes métodos de injerto. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo procesar el lipo aspirado para injertar en serie, los injertos de tomografía computarizada in vivo, evaluar la supervivencia del injerto y explanificar los injertos para la histología del peso y el análisis futuro después de su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la cirugía plástica exploraran el injerto de grasa en el modelo de espejo.

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Investigación

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Hemos desarrollado un enfoque quirúrgico novedoso para la administración intratraqueal de agentes bioactivos en el feto de ratón. La ruta de entrega es más eficiente en la orientación de los pulmones fetales de ratón que el comúnmente utilizado intraamniótica inyección. Este procedimiento hasta la fecha no se ha descrito en un modelo de ratón.

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Los modelos animales se utilizan con frecuencia para estudiar la metástasis del cáncer de hueso. En este protocolo vamos a describir dos métodos comunes de la inoculación del tumor para los estudios de metástasis óseas y describir brevemente algunos de los análisis utilizados para supervisar y cuantificar estos modelos.

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Un cáncer de cerebro modelo murino de metástasis de mama se establece con ultrasonido intracardiaco inyección guiada por imágenes de células MDA-MB231/Br-GFP. Desarrollo de las metástasis intracraneales multifocales ha sido supervisado longitudinalmente utilizando alta resolución 9.4 T MRI.

Guiada por imagen de ultrasonido de inyección intracardiaca de desarrollar un modelo de ratón de cáncer de mama metástasis cerebrales Seguido por Longitudinal MRI

Describimos un método para la detección del desarrollo de nódulos tumorales en los pulmones de un modelo de ratón con adenocarcinoma utilizando tomografía microcomputarizada y su uso para monitorear los cambios en el tamaño del nódulo a lo largo del tiempo y en respuesta al tratamiento. La exactitud de la evaluación se confirmó con la cuantificación histológica de punto final.

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Este artículo describe una metodología detallada del uso de un caucho de silicón radiopaco con base de plomo para inundar la vasculatura murina para la cuantificación del diámetro aórtico en un modelo murino de aneurisma aórtico y disección.

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Este protocolo utiliza la tomografía microcomputarizada para permitir la cuantificación rentable de la masa magra, incluido el músculo esquelético y el tejido visceral, el tejido adiposo y el tejido esquelético en animales pequeños. Distingue entre tejido magro y adiposo, lo que ofrece ventajas significativas para la investigación biomédica, particularmente en la investigación traslacional en animales pequeños.

Cuantificación no invasiva del músculo esquelético en pequeños animales mediante microtomografía computarizada

Este estudio se centra en la inducción subcutánea in vivo de células luminiscentes de cáncer colorrectal en un modelo murino y la posterior medición de la luminiscencia mediante un sistema de imagen. El procedimiento tiene como objetivo establecer un modelo de crecimiento tumoral reproducible para el seguimiento en tiempo real y la evaluación terapéutica.

Inyección subcutánea de células de cáncer colorrectal humano en ratones desnudos atímicos para evaluar la eficacia antitumoral

Análisis de contenido de grasa se realiza rutinariamente en los estudios que utilizan modelos murinos de obesidad. Métodos emergentes en pequeños animales y el análisis de imágenes de TC están proporcionando los detalles longitudinal rica análisis de contenido de grasa. A continuación le detallamos paso a paso los procedimientos para la realización de pequeños animales TAC, análisis y visualización.

La segmentación y la medición de los volúmenes de grasa en modelos murinos de obesidad Usando rayos X de tomografía computarizada

Aprende a evaluar la retención de injertos de grasa en ratones desnudos mediante micro-tomografía computarizada. Este método permite cuantificar objetivamente la viabilidad del injerto en múltiples puntos temporales sin sacrificar al animal.

Evaluación de la viabilidad de la inyección de grasa humana en ratones desnudos con micro-tomografía computarizada

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