La investigación de las proteínas priónicas, como la extensión y la toxicidad de Uso del Metazoan Organismo modelo C. elegans

El objetivo general de los siguientes experimentos es examinar la propagación y la toxicidad compleja de las proteínas similares a PreOn utilizando el organismo modelo de Metazoos C elegance. Esto se logra mediante el monitoreo del transporte intra e intracelular de vesículas que contienen la proteína similar a PreOn, utilizando microscopía de fluorescencia de lapso de tiempo. A continuación, sensores de plegamiento específicos de tejido y estrés expresado de forma ubicua.

Los reporteros se utilizan para evaluar los efectos autónomos y no autónomos de las células en la aptitud celular. A continuación, se realiza un cribado de ARNi de todo el genoma para identificar nuevos modificadores de la toxicidad inducida por PreOn. El cribado se realiza en cultivo líquido utilizando el thrashing como lectura de la toxicidad.

Por último, el worm tracker, un plugin para la imagen J se utiliza para cuantificar el movimiento de la elegancia C en combinación. Estos métodos permiten desentrañar las vías genéticas implicadas en el movimiento intercelular de las proteínas similares a PreOn y su toxicidad no celular autónoma. Después de preparar el control sincronizado de la elegancia del mar y las líneas transgénicas de dominio PreOn y las almohadillas 10%agros, de acuerdo con el protocolo de texto adjunto, pipetee tres microlitros de 100 nanogramos de perlas de poliestireno y tres microlitros de limassol de cuatro milimolares en la almohadilla agros.

Usando un pico de alambre de platino, transfiera los gusanos a la edad deseada de una placa a la solución y use un cubreobjetos para cubrir y obtener imágenes de los gusanos a nivel subcelular. Coloque un portaobjetos en el soporte de portaobjetos del microscopio de un microscopio confocal y utilice un objetivo de aceite de 63 x o 100 x 1,4 NA. A continuación, abra METAMORPH y seleccione adquisición multidimensional.

Y en la pestaña principal, marque las casillas de lapso de tiempo y diarios de ejecución. En la pestaña de guardado, seleccione o cree la carpeta del directorio para guardar archivos y asigne un nombre al archivo En la pestaña de longitud de onda, utilice Yoko quad red o una iluminación equivalente de imágenes MRFP y ajuste la exposición a entre 100 y 300 milisegundos y la ganancia de la cámara a entre 100 y 300. A continuación, en la pestaña Lapso de tiempo, establezca el intervalo de tiempo en un segundo, la duración en cinco minutos y el número de puntos de tiempo en 301.

En la pestaña de diarios. Para el diario, seleccione Un conjunto de FC, Z de retención y A FC de retorno a Z de retención para el tipo seleccione especial dos veces y para el punto inicial, seleccione el punto de inicio y el punto de fin del tiempo. Una vez finalizada la configuración, presione adquirir Siguiendo este procedimiento, se pueden utilizar otros métodos, como las aplicaciones de seguimiento de partículas, para medir las propiedades dinámicas de las muestras.

Después de sincronizar el dominio priónico transgénico transgénico y mientras se tipifican los nematodos y copiar las placas de la biblioteca de ARN inger de acuerdo con el protocolo de texto, incube las placas de ARNi duplicadas a 37 grados Celsius y 300 RPM para usar la bacteria HT uno 15 E coli que alberga el vector vacío L 4 4 4 0 como control. Cultive por separado en un tubo de cultivo y luego use una pipeta multicanal para transferir 65 microlitros del cultivo a un cuarto de los pocillos de 2 96. Placas de pocillos con una estación de trabajo automatizada que contiene un cabezal multicanal dispensado.

10 microlitros de cinco, milimolares de IPTG diluido en cada pocillo de las bacterias ARNi y placas de control. Vuelva a sellarlos antes de incubarlos durante tres horas mientras se incuban las bacterias. Mezcle el control de tipo silvestre sincronizado y las larvas transgénicas L uno y el pocillo tampón M nine y pipetee de cinco a 10 microlitros en un microscopio de vidrio.

Desliza el deslice el conteo de los gusanos y calcule el número de gusanos por microlitro. Después de las tres horas de incubación bacteriana, retire las placas de la incubadora y deje que alcancen la temperatura ambiente para evitar que el calor estrese a los gusanos. A continuación, complemente el tampón M nine con colesterol IPTG y antibióticos de acuerdo con el protocolo de texto.

Y agregue el volumen apropiado de solución de gusano transgénico de dominio PreOn a una concentración final de 15 gusanos por mezcla de microlitro para distribuir uniformemente. A continuación, dispense 50 microlitros en cada pocillo de las placas de ARNi y en los pocillos de una de las placas de control de vectores vacías. Dispense la solución de gusano de tipo salvaje en la segunda placa de control.

A continuación, deje todas las placas sin sellar para permitir la aireación y evitar que el cultivo líquido se evapore apilando cuatro o cinco placas juntas, envolviéndolas con una toalla de papel húmeda seguida de papel de aluminio. Incubar las placas a 20 grados centígrados y 200 RPM durante cuatro días. Para las placas, use una cámara Falcon 4 M 60 conectada a una computadora con un monitor para detectar visualmente un aumento de la paliza en comparación con los animales transgénicos de dominio PreOn tratados con control.

La principal ventaja de utilizar una estación de trabajo automatizada de manejo de líquidos para dispensar los gusanos en las placas de ARNi R es que reduce en gran medida la variabilidad y el número de gusanos por pocillo. Para realizar un ensayo de motilidad en placas sólidas y validar los clones candidatos de ARNi, crecen bacterias de ARNi durante la noche de acuerdo con el protocolo de texto. A continuación, utilice un milimolar de IPTG para inducir la expresión de DS RNA durante tres horas.

Utilice 150 microlitros de cada clon bacteriano de ARNi para sembrar placas de NGM previamente preparadas que se extienden en una capa delgada. Deje que las bacterias se sequen durante dos días a temperatura ambiente en la oscuridad bajo un microscopio estereoscópico. Determine la cantidad de lombrices sincronizadas y suspensión como se describió anteriormente y agregue de 25 a 30 L una larva en cada placa experimental.

Incubar los nematodos a 20 grados centígrados durante cuatro días hasta que lleguen los gusanos. Segundo día de la edad adulta para cuantificar la motilidad de los gusanos, encienda la cámara y el sencillo software de imágenes PCI. Haga clic en el icono de la cámara para habilitar el ajuste de las condiciones de imagen.

A continuación, configure la condición de imagen de la siguiente manera. Establezca la ganancia en cero, el modo de luz en el índice de alta velocidad en uno y el agrupamiento en dos. A continuación, haga clic en vivo y exponga automáticamente y ajuste las condiciones de iluminación moviendo los espejos del microscopio y los diales de brillo y contraste.

Haga clic en tiempo, escanee y escriba en una carpeta y un nombre de archivo, establezca el retraso del campo en 20 milisegundos y el tiempo de detención en 30 segundos. Presione revisión en vivo para elegir el área de la placa para grabar. A continuación, golpea la placa tres o cuatro veces en el escenario.

Confirme rápidamente su posición en el campo de visión y presione iniciar después de que la película termine de grabarse, haga clic derecho en la imagen y elija exportar secuencia de montaje para exportar la película de un formato CXD a un archivo A VI. Para analizar los videos de motilidad, abra la imagen J elija la pestaña de complementos, luego elija worm tracker y seleccione Worm Tracker batch, y seleccione el directorio que contiene todos los archivos a analizar en la ventana de entrada principal de Worm Tracker cargue por lotes los valores de entrada como se detalla aquí. Una explicación para cada uno de los parámetros se puede encontrar en las instrucciones que acompañan al plugin.

Haga clic en Aceptar y permita que se ejecute el análisis de movimiento. Por último, para seleccionar los resultados, confirme que todas las huellas detectadas sean de la elegancia marina real y elimine los artefactos. Abra los archivos TXT creados para cada película y copie la información en un archivo de software de análisis de datos.

Abra los archivos zip de etiquetas creados y ejecute las etiquetas TIFF resultantes para verificar y eliminar manualmente las pistas de gusanos falsos. Yesper Peterson, un ex postdoc en el laboratorio, tuvo por primera vez la idea del rastreador de gusanos como sustituto de nuestra evaluación manual del móvil CL Elegance, que es una lectura de la toxicidad. El rastreador de gusanos nos permite realizar estos experimentos de forma automatizada sin sesgos por parte del usuario, al tiempo que evaluamos más condiciones en menos tiempo mediante imágenes de lapso de tiempo.

La RFP etiquetada como R dos y E dos, que se acumula en vesículas tubulares, se observó transportada dentro y entre las células mediante coex que expresa un sensor de plegamiento o un indicador de estrés. Junto con la célula proteica similar a PreOn, se pueden evaluar los efectos autónomos y no celulares. La expresión de R dos E dos en las células musculares conduce a un inicio más temprano de la agregación de Q 44 en el intestino, lo que revela que R dos E dos tiene efectos autónomos no celulares sobre la proteostasis, la coexpresión de R dos E dos Con el SOD tres PGFP El reportero de estrés oxidativo transcripcional conduce a la regulación positiva del reportero en diferentes tejidos, demostrando que el dominio PreOn induce una respuesta de estrés oxidativo no celular de forma autónoma siguiendo el cribado de todo el genoma.

Esta película demuestra que las imágenes de alta resolución y la visualización en la pantalla de la computadora permiten la proyección de un cuarto de una placa simultáneamente Una vez dominado, ese protocolo de detección se puede realizar en 12 rondas de 25 placas por sesión. Si se realizan dos sesiones por semana, se puede analizar toda la biblioteca de ARNi en un plazo de seis semanas. El rastreador de gusanos se utilizó para cuantificar la motilidad de la elegancia C, como se ve aquí.

Worm Tracker convierte un vídeo original en formato binario y a cada gusano se le asigna una pista. Los videos procesados se pueden ver con pistas superpuestas para eliminar manualmente cualquier artefacto. El parámetro de longitudes del cuerpo por segundo se normaliza para las posibles diferencias de tamaño. Nematodos.

Este método identificó 35 supresores de la toxicidad inducida por PreOn que aumentaron el fenotipo de motilidad hasta al menos un 133% y hasta un 256% en comparación con los gusanos tratados con control. Al arrendar el rastreador de gusanos, es importante recordar verificar manualmente las huellas de gusanos obtenidas. El software hace un gran trabajo en la identificación de los gusanos, pero a veces el fondo aún puede identificarse erróneamente como un animal.

Por lo tanto, recuerde verificar sus videos después de ejecutar el rastreador de gusanos en ellos. Estos métodos pueden ayudar a responder preguntas clave en el campo de las enfermedades neurodegenerativas, como si una determinada proteína de enlace de enfermedad es capaz de propagarse de célula a célula, de forma similar, o si existe un vínculo entre la transmisión intercelular y la toxicidad compleja de estas proteínas. Niños.