Name: La investigación de las proteínas priónicas, como la extensión y la toxicidad de Uso del Metazoan Organismo modelo C. elegans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 57 s
Description: Aprende a estudiar la propagación y toxicidad de proteínas tipo prión en C. elegans mediante microscopía de fluorescencia y cribado RNAi. Este método identifica modificadores de toxicidad para investigar enfermedades neurodegenerativas.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Agradecemos a Cindy Voisine y Yoko Shibata por su útil discusión y comentarios críticos sobre el manuscrito. Agradecemos al Laboratorio de Análisis de Alto Rendimiento (HTAL) y al Centro de Imágenes Biológicas (BIF) de la Universidad Northwestern por su ayuda. Este trabajo fue financiado por subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud (NIGMS, NIA, NINDS), la Fundación Médica Ellison y la Fundación Daniel F. y Ada L. Rice (a R.I.M.). C.I.N.-K. fue apoyado por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (KR 3726/1-1).

1. Seguimiento transcelular Difusión de proteínas priónicas-como por En Vivo Time-lapse de imágenes NOTA: Crecer C. elegans de tipo salvaje (WT) (N2) y las líneas transgénicas de acuerdo con métodos estándar y controlar cuidadosamente la temperatura de cultivo 47. <ol><li> Generar líneas transgénicas de C. elegans expresar la proteína prión como, etiquetados con la proteína fluorescente de color rojo monomérica (mRFP). Mira este video que muestra cómo utilizar la microinyección 48. Para más información y métodos que describen cómo integrar estas líneas extracromosómicos, ver 49. </li><li> Preparar poblaciones sincronizadas por la puesta de huevos o de blanqueo de acuerdo con métodos estándar 50. <ol><li> Sincronización de la puesta de huevos <ol><li> Transferencia 10-20 adultos grávidas en un plato y dejar que ellos ponen huevos por 1 - 2 horas. Retire los adultos de la placa y dejar que la progenie crecer hasta la edad deseada. </li></ol></li> &lt;li&gt; Sincronización por blanqueo <ol><li> Recoger una población no sincronizada de los adultos grávidas y blanquear con solución de hipoclorito alcalino (NaOH 250 mM y 1: 4 (v / v) dilución de lejía comercial en H 2 O). Lavar los huevos dos veces (218 g durante 1 min) con tampón M9 47 (21 MMNA 2 HPO 4 · 7H 2 O, 22 mMKH 2 PO 4, 86 mMNaCl, 1 mMMgSO 4 · 7H 2 O, agregue dH2O hasta 1 L). </li><li> Deje que se traman en tampón M9 con suave agitación O / N a 20 ° C. Desarrollo gusano arresto en la fase L1 en ausencia de una fuente de alimento, dejando una población sincronizada. Traslado L1s en crecimiento de Medios (NGM) placas fresco nematodos sembradas con OP50 E. bacterias coli y permiten la progenie se desarrolla hasta la edad de 47 años que desee. </li></ol></li></ol></li><li> Prepare 2% agarosa almohadillas (en H 2 O) en un portaobjetos de microscopio como se describe 50. <ol><li> Prepare dos millasdiapositivas croscope con la cinta de etiquetado se coloca sobre toda su longitud para ser utilizados como espaciadores. Coloque una tercera portaobjetos de microscopio entre ellos. </li><li> Disolver 2% de agarosa en H 2 O y una pipeta una gota sobre el portaobjetos limpio. </li><li> Coloque cuarto de diapositivas perpendicular a los otros tres se desliza sobre la parte superior de la caída de agar. Presione suavemente hacia abajo para aplanar la almohadilla en el mismo grosor que la cinta de etiquetar. </li><li> Deje que se seque durante 1 minuto antes de retirar los espaciadores y tirando suavemente de las diapositivas aparte. La almohadilla de agar se apegará a uno de ellos. </li></ol></li><li> Pipeta ~ 10 l anestésico (levamisol 2 mM en tampón M9) en la superficie y la transferencia de ~ 10 animales utilizando un pico alambre de platino. Cubra con una hoja de cubierta (~ 22 x 22 mm) y tomar imágenes dentro de 1 hora. </li><li> Alternativamente, para adquirir películas durante un período de tiempo más largo o para reducir aún más la posibilidad de cualquier movimiento de los animales, utilizar una combinación de anestésico y el talón de inmovilización 51. <ol><li> Preparar 10% agaalmohadillas rosas (en tampón M9) como se describe 51 y agregar gusanos a solución normas de tamaño nanoesfera 3 l (perlas de poliestireno, 100 nm), además de 3 l anestésicos (levamisol 4 mM en tampón M9). Cubra ligeramente con un cubreobjetos. Para evitar la desecación, sellar la hoja de la cubierta con valap (mezcla de cantidades iguales de vaselina, lanolina y cera de parafina). </li></ol></li><li> Image inmovilizado gusanos usando un microscopio confocal. Nota: Los resultados se obtienen utilizando un Spinning Disc AF Microscopio Confocal equipado con una cámara EM-CCD y un software de Microscopía Automatización y Análisis de imagen tales como MetaMorph y describen los detalles a continuación, pero otros sistemas de formación de imágenes confocal comparable también se pueden utilizar. <ol><li> Utilice el objetivo aceite 63X o 100X / 1.4NA y colocar el portaobjetos de microscopio que contiene gusanos en el soporte de portaobjetos de microscopio. </li><li> Abrir el software. Ajustar la potencia del láser y filtros para imágenes mRFP. Utilice el láser de 561 nm en el 10% de energía y la emisión de filtro&gt; 600 nm. </li><li&gt; Abrir &quot;MultiDimensional Adquisición&quot;. En la pestaña &quot;Principal&quot;, active las casillas de &quot;Timelapse&quot; y &quot;Run Journals&quot; (Hardware enfoque automático: desactivado). </li><li> Bajo la pestaña &quot;Saving&quot; seleccionar o crear la carpeta del directorio donde los archivos deben ser guardados. Asigne un nombre al archivo. </li><li> Bajo la pestaña &quot;Longitud de onda&quot;, seleccione la iluminación adecuada y ajustar la exposición y ganancia. Use &quot;YokoQuad Red&quot; (o una configuración de iluminación equivalente para formación de imágenes mRFP) con una exposición de entre 100 y 300 mseg y una ganancia de la cámara entre 100 y 300, dependiendo de la muestra individual (evaluado mediante el uso de la imagen en vivo). </li><li> Bajo la pestaña &quot;Timelapse&quot; seleccione &quot;Número de puntos de tiempo&quot; = 301 &quot;Duración&quot; = 5 min y &quot;Tiempo / Intervalo&quot; = 1 seg. </li><li> En el marco del &quot;Revistas&quot; pestaña seleccione Diario: &quot;AFC SET Z HOLD&quot; y &quot;AFC Volver a Z HOLD&quot;, Tipo: &amp;# 8220; Especial &quot;(dos veces), Punto inicial:&quot; Inicio de la hora punta &quot;y&quot; Fin de punto en el tiempo &quot;. Esta opción de enfoque automático es importante para la imagen de la misma sección durante un período de tiempo más largo. </li><li> Una vez finalizada la configuración, pulse &quot;Adquirir&quot;. El vídeo timelapse se safed como archivos TIFF independientes. </li><li> Abre todos los archivos .tiff de una serie de tiempo dada en ImageJ. Diríjase a &quot;Imagen&quot; → &quot;Stacks&quot; → &quot;Imágenes Stacks&quot;. Opcionalmente, ajustar el brillo y el contraste, añadir la barra de tamaño, etc. Exportar la película en &quot;Archivo&quot; → &quot;Guardar como&quot; → &quot;AVI ...&quot; (por ejemplo, ver video 1 y 2 correspondientes a la Figura 1). </li></ol></li></ol> 2. Usando sensores plegables y Reporteros Estrés encargado de investigar la célula autónoma y no de células Autónoma Afecto sobre Proteostasis y Toxicidad <ol><li> Generar líneas transgénicas que coexpresan un sensor de plegado o Reporte estrésr junto con la proteína prión-similares. Para los métodos sobre cómo establecer cruces o generar líneas transgénicas, consulte 48,49,52. Ver Tabla 1 para una lista de C. elegans cepas que se pueden utilizar. </li><li> Preparar poblaciones sincronizados de animales transgénicos y crecer hasta la edad deseada como se describió anteriormente (sección 1.2) 50. </li><li> El uso de un microscopio estereoscópico, examine el respectivo fenotipo del sensor de plegado o reportero estrés. <ol><li> Para el sensor de plegado, determinar el número de animales que albergan agregados de cada día después de la sincronización (por ejemplo, véase la Figura 2E y F). </li><li> Para el reportero estrés, prueba si la coexpresión de las proteínas priónicas resultados similares en un aumento de fluorescencia del informador (por ejemplo, véase la Figura 3). </li></ol></li></ol> 3. Pantalla de todo el genoma para la supresión de la toxicidad inducida por priones en C. elegans<img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52321/52321fig4highres.jpg" /> Figura 4. Representación esquemática del protocolo de cribado RNAi. Vea la sección protocolo 3 para una descripción detallada de los pasos individuales. <ol><li> Sincronización de C. gusanos elegans y la duplicación de RNAi biblioteca <ol><li> Para la pantalla de RNAi, utilizar la biblioteca Ahringer RNAi (o la biblioteca Vidal RNAi) 53,54. Rearray la biblioteca RNAi desde el formato de pozo original 384 en placas de 96 pocillos llenando las placas con 100 l de medios LB-Amp (50 mg / ml de ampicilina en LB) suplementado con 10% de glicerol y inocular utilizando un replicador de 96 pines. Crece a 37 ° CO / N con agitación y se almacena a -80 ° C. </li><li> Mantener C. elegans WT y líneas transgénicas a 20 ° C en NGM placas sembradas con OP50 E. bacterias coli de acuerdo con métodos estándar 47. </li><li>Sincronizar transgénico dominio prión y WT (control) nematodos por el blanqueamiento (ver sección 1.2). </li><li> El mismo día que los gusanos se blanquean, preparar medio LB suplementado con 50 mg / ml de ampicilina. Utilice un dispensador de reactivos automatizado para dispensar (o una pipeta manual) 65 l de los medios de comunicación LB-amp en cada pocillo de una placa de 96 pocillos. </li><li> Retire 96 y placas de biblioteca Ahringer RNAi de -80 ° C y llevarlos a una campana estéril forrada con papel de cocina. Retire inmediatamente la junta cinta manteniendo la placa boca abajo mientras que las placas todavía están congelados, teniendo cuidado de evitar la contaminación de hielo en el exterior de las placas. Reinvertir las placas y dejar que se descongelen durante aproximadamente 30 minutos. </li><li> Sumerja una estéril replicador de 96 pines en una placa RNAi biblioteca, y luego en una placa LB-amp fresco. Use un replicador estéril nueva para cada plato. Selle todas las placas con cinta de papel adhesivo y devolver las placas de biblioteca a -80 ° C. Los replicadores pueden ser remojados en lejía, enjuagarse,y en autoclave para ser utilizado de nuevo. </li><li> Permitir a las placas de RNAi duplicados para crecer O / N en una incubadora a 37 ° C y 300 rpm. Para utilizar HT115 E. coli bacterias que albergan el vector vacío (L4440) como un control, que crecen por separado en un tubo de cultivo y después de pipetear 65 l de cultivo con una pipeta multicanal en un cuarto de dos placas de 96 pocillos. </li></ol></li><li> La inducción de la producción bacteriana dsRNA y la adición de gusanos <ol><li> Diluir isopropil-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) a una concentración 5 mM en ddH 2 O. Utilice una estación de trabajo automatizado con una cabeza multicanal para dispensar (o pipeta manualmente) 10 l de IPTG diluido en cada pocillo de las bacterias RNAi y las placas de control. Volver a sellar y colocar las placas de nuevo en la incubadora. Deja que sacuden durante 3 horas a 37 ° C. </li><li> Mientras que las bacterias están temblando, preparar los gusanos. Mezclar el / suspensión gusano M9 bien, y la pipeta una muestra pequeña (~ 5-10 l) a un portaobjetos de vidrio. Contarel número de gusanos bajo un microscopio estereoscópico y calcular el número de gusanos por l. </li><li> Utilizando una técnica estéril, preparar una solución de M9 suplementado (M9 +) con las siguientes concentraciones finales: 0,20 mg / ml de IPTG, 8,0 g / ml de colesterol, 50 mg / ml de ampicilina, 9,6 g / ml de tetraciclina, 0.0835 g / ml de Fungizone, y 15 gusanos por 50 l. <ol><li> Haga soluciones separadas para transgénico dominio prión y gusanos WT. El volumen final de la solución gusano M9 + necesaria dependerá del número de placas de RNAi copiados (ver más abajo), además de ~ 30 ml de volumen muerto que permanecerá en el depósito, si se utiliza un dispensador automatizado. </li></ol></li><li> Después de la inducción 3 h de producción bacteriana dsRNA, tome las placas de la incubadora y dejar que se enfríe a temperatura ambiente (~ 30 min) para evitar el calor perturbe a los animales. </li><li> Dispensar 50 l M9 + dominio prión solución gusano transgénico a cada pocillo de las placas de RNAi y una de las placas de control de vector vacío. HacerAsegúrese de mezclar la solución gusano antes de cada paso como los animales tienden a sedimentar al fondo del depósito. </li><li> Prescindir gusanos WT en la segunda placa de control. Deje las placas sin sellar para permitir la aireación. Para mantener el cultivo líquido se evapore, apilar 4-5 platos juntos y envolver con una toalla de papel húmeda y papel de aluminio. Incubar a 200 rpm a 20 ° C durante 4 días. </li></ol></li><li> Tanteo NOTA: Después de 4 días en la incubadora, los gusanos estarán en el segundo día de la edad adulta y están listos para defender. Deje que los animales se adaptan a condiciones no sacuden durante 30 minutos antes de cribado para asegurar golear sin ser molestados. <ol><li> Utilizando una cámara Falcon 4M60 conectado a un ordenador con una pantalla del monitor visual para aumentar la thrashing en comparación con tratados con el control de dominio prión animales transgénicos. </li><li> Compilar una lista de éxitos preliminares confirmar utilizando wrMTrck (véase la sección siguiente). </li></ol></li></ol> 4. Confirmación de preliminarPantalla Golpea <ol><li> Ensayo de la motilidad en placas sólidas <ol><li> Preparar placas con NGM suplementadas con 100 g / ml de ampicilina, 12,5 mg / ml de tetraciclina y 1 mM IPTG, de acuerdo con métodos estándar 47. Si es posible, utilice una máquina de placa de vertido para asegurar todas las placas tienen la misma altura de los medios de comunicación, lo que permitirá un proceso de adquisición de vídeo más ágil. </li><li> Cultivar las diferentes clones RNAi en ~ 1 ml de LB + 50 mg / ml de ampicilina, O / N a 37 ° C y 250 rpm. </li><li> El día siguiente, inducir la expresión de la dsRNA con 1 mM IPTG durante 3 horas. Sembrar las placas con 150 l de cada clon bacteriano RNAi, que se distribuyen en una capa delgada. Deje que las bacterias secas durante 2 días a temperatura ambiente en la oscuridad. Preparar 3 planchas por RNAi clon. </li><li> Sincronizar la población de gusanos por blanqueo de acuerdo con los métodos estándar 50 (ver sección 1.2), y dejar que los huevos eclosionan O / N en M9 medios. </li><li> Tomar una muestra de la suspensión de gusano y determinar la cantidad de nematodes por l en el microscopio estereoscópico. Entonces, pipetear el volumen adecuado de M9 más gusanos en cada placa experimental para que contenga de 25 - 30 gusanos L1. Crecer los nematodos a 20 ° C durante 4 días hasta que los gusanos alcanzan día 2 de la edad adulta. </li></ol></li><li> El análisis cuantitativo de la motilidad gusano con el plugin wrMTrck para ImageJ NOTA: Los videos fueron grabados utilizando un microscopio estereoscópico a 10 aumentos con un Hamamatsu Orca-R2 cámara digital C10600-10B y el software de imágenes PCI simple Hamamatsu. <ol><li> Encienda la cámara y el software de imágenes PCI simple. Haga clic en &quot;Live&quot; para permitir el ajuste de las condiciones de la imagen. </li><li> Configurar las condiciones de vídeo de la siguiente manera: Ganancia = 0; Modo Luz = Alta; Velocidad Índice = 1; Intervalos = 2. Haga clic en &quot;Auto Expose&quot; y luego ajustar las condiciones de luz, mover los espejos de microscopio y los diales de brillo y contraste. NOTA: El video tiene que tener un alto contraste sin ser Sobreexpcerradas de la, por lo que los animales aparecen como formas negras sobre un fondo brillante. </li><li> Haga clic en &quot;Scan Time&quot; y seleccione una carpeta y un nombre de archivo. Ajuste &quot;Delay Campo&quot; a 20 ms y &quot;Parada en el tiempo&quot; a 30 seg. Presione &quot;Revisión Live&quot; con el fin de elegir el área de la placa para grabar (donde la mayoría de los gusanos son). Toque en la placa de 3 o 4 veces en el escenario, de forma rápida confirmar su posición en el campo de visión y presione &quot;Start&quot;. </li><li> Después de la película termine de grabar, haga clic derecho sobre la imagen y selecciona &quot;Exportar Montaje Secuencia&quot; para exportar la película a partir de un formato .cxd a un .avi. </li></ol></li><li> El análisis de los vídeos de la motilidad <ol><li> Abra el software ImageJ, vaya a la pestaña &quot;Plugins&quot;, luego &quot;wrmtrck&quot; y selecciona &quot;Lote wrMTrck&quot;. Seleccione el directorio que contiene todos los archivos a analizar. </li><li> En la ventana de entrada principal de wrMTrck_Batch, cargue los valores de entrada como se detalla en Figure 5C. Explicación para cada uno de los parámetros se puede encontrar en las instrucciones que acompañan el plugin. Haga clic en &quot;Aceptar&quot; y dejar que el análisis del movimiento de ejecución. </li><li> El comisariado de los resultados y confirmar que todas las pistas detectadas son de real C. elegans y eliminar los artefactos, se abren cada uno de los archivos .txt creados para cada película y copiar la información a un archivo de software de análisis de datos. Abra el &quot;*&quot; _labels.zip archivos creados y ejecutar el resultante &quot;* _labels.tif&quot; para comprobar y eliminar pistas falsas gusano manualmente. </li></ol></li></ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Los métodos descritos aquí ayudan a ilustrar la difusión y la toxicidad celular autónoma la célula compleja autónomos y no de las proteínas priones similares. Recientemente hemos descubierto que un dominio citosólico prión agregación propensos se recoge en vesículas de membrana en un proceso de autofagia relacionados. Un subconjunto específico de estas vesículas transporta el dominio prión dentro de y entre las células y los tejidos 40. La clave para controlar su movimiento en el animal vivo es que la proteín...

Muchas de las enfermedades neurodegenerativas, como la enfermedad de Alzheimer (EA), enfermedad de Parkinson (EP), la esclerosis lateral amiotrófica (ELA), y las encefalopatías espongiformes transmisibles (EET), se asocian con proteínas de agregación propensos y están, por tanto, colectivamente conocidos como proteínas misfolding trastornos (PMD ). EET o enfermedades priónicas constituyen una clase única de PMD en que pueden ser infecciosas en seres humanos y animales 1. A nivel molecular, los priones se replican mediante el reclutamiento y la conversión-rica α-hélice PrP celular codificada por el hospedador monomérico (PrP C) en el rico en β-hoja de PrP Sc conformación patológica 2,3. Agregados de proteínas autopropagante también se han identificado en los hongos, que comparten características importantes con priones mamíferos 4,5. Además, priones mamíferos son capaces de pasar de célula a célula e infectan células de los animales 6,7. Mientras PMD other de EET no son infecciosas, comparten un principio patógena común con las enfermedades priónicas 8,9. Aunque las proteínas vinculadas a cada uno de los PMD no están relacionadas en estructura o función, que todos los agregados formulario a través de un proceso de cristalización como llaman nucleado o polimerización sembraron; Además semillas proteicas crecen mediante la contratación de sus isoformas solubles 2,10,11. La eficiencia a la auto-propagan in vivo varía, dependiendo de las propiedades intrínsecas de la proteína, que junto con factores celulares adicionales, tales como chaperones moleculares en última instancia determinan las tasas de nucleación agregada, la siembra, la fragmentación y la difusión de 12-15. Por lo tanto, debe existir un equilibrio entre estos factores que permiten la propagación eficiente de la agregación de proteínas. Esto también podría explicar por qué sólo algunos agregados amiloidogénicos albergan las características de un prión, y por lo tanto no todos los PMD son infecciosos. Los priones parecen representar o &#39;top artistas intérpretes o ejecutantesfa amplio espectro de agregados proteicos auto-replicantes, que los convierte en una poderosa herramienta para estudiar PMD 8,13. Curiosamente, la toxicidad asociada con los agregados relacionados con la enfermedad tiene a menudo un componente autónomo no celular 16,17. Esto significa que afectan a las células vecinas que no expresan el gen correspondiente, en contraste con un efecto de célula autónoma estrictamente, lo que implica que sólo las células que expresan el gen de la exposición fenotipo específico. Esto fue convincentemente demostrado por la expresión específica de tejido o derribar las respectivas proteínas en numerosos modelos de enfermedades neurodegenerativas 18-26. Diversos mecanismos se han sugerido como una base para esta toxicidad autónoma no celular en PMD, incluyendo el suministro de nutrientes disminuido, el desequilibrio en la señalización neuronal, excitotoxicidad del glutamato, y la neuroinflamación 16,27,28. Además, un movimiento de priones como de agregados de enfermedades vinculadas entre las células Might contribuyen a este aspecto 29,30. La evidencia creciente sugiere que las inclusiones proteína distinta de priones pueden transmitir de célula a célula, lo que puede explicar la característica de propagación de la patología observado en muchos PMD 30-36. Sin embargo, aún no se ha determinado si existe una clara relación causal entre el movimiento intercelular de proteínas de la enfermedad y el efecto tóxico sobre las células vecinas. Por lo tanto, una mejor comprensión de las vías celulares que subyacen a la transmisión de célula a célula y la toxicidad celular autónomo no es necesario y esencial para el desarrollo de nuevas terapias. Sin embargo, muchos aspectos de priones como la difusión y celulares factores que influyen en la transmisión de célula a célula de proteínas mal plegadas en metazoos no se conocen bien, en particular a nivel del organismo. El nematodo Caenorhabditis elegans tiene varias ventajas que ofrecen el potencial de descubrir nuevas facetas de priones como spreading en metazoos 17. Es transparente, lo que permite el seguimiento in vivo de las proteínas fluorescentemente marcadas en el organismo vivo. Además, muchos procesos celulares y fisiológicas afectadas por la enfermedad se conservan de gusanos para la salud humana, y C. elegans también es susceptible a una amplia variedad de manipulaciones genéticas y análisis moleculares y bioquímicos 37-39. Exactamente 959 células somáticas conforman el adulto hermafrodita con un plan de cuerpo simple que todavía tiene varios tipos de tejidos distintos, incluyendo los músculos, neuronas y delgado. Para establecer un nuevo modelo de prión en C. elegans, se optó por expresar de forma exógena la glutamina / asparagina bien caracterizado (Q / N) ricos en priones dominio NM de la proteína priónica de levadura citosólica Sup35, ya que no hay proteínas priónicas endógenos conocidos gusanos 4,40. Los priones de levadura han sido invaluables en la aclaración de los mecanismos básicos de la replicación de priones 41-44. Además, Nuevo México es el abetocitosólica proteína prión como st que se ha demostrado para recapitular el ciclo de vida completo de un prión en cultivos celulares de mamíferos 45,46. Del mismo modo, cuando se expresa en C. elegans, el dominio prión Sup35 adoptado notablemente bien a los diferentes requisitos para la propagación en células de metazoos en comparación con células de levadura y de las características clave de la biología expuestas prión agregación 40. NM se asoció con una profunda fenotipo tóxicos, incluyendo la interrupción de la integridad mitocondrial y la apariencia de diversas vesículas autofagia relacionados en el nivel celular, así como la detención embrionario y larval, retraso del desarrollo, y una alteración generalizada del medio ambiente plegamiento de la proteína en el nivel del organismo. Sorprendentemente, el dominio prion celular exhibe toxicidad celular autónoma y no autónoma, que afecta a los tejidos vecinos en la que no se expresó el transgén. Además, el transporte vesicular del dominio prión dentro de y entre las células se monitoriza en tiempo real &lt;em&gt; in vivo 40. Aquí se describe cómo examinar difusión-prión como en C. elegans. Vamos a explicar cómo supervisar el transporte intra e intercelular de vesículas que contienen el dominio de priones usando microscopía de fluorescencia de lapso de tiempo. Haremos hincapié en el uso de sensores de plegado específicos de tejido y de expresión ubicua reporteros de estrés para evaluar los teléfonos celulares efectos autónomas autónomas y no sobre la aptitud celular. Por último, vamos a describir el procedimiento de una pantalla recientemente realizado genoma amplia ARN de interferencia (RNAi) para identificar nuevos modificadores de la toxicidad inducida por priones. En combinación, estos métodos pueden ayudar a desmenuzar las vías genéticas implicadas en el movimiento intercelular de proteínas y su toxicidad autónoma no celular.

<table><tbody><tr><td>Reactivo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Patrones de tamaño de nanosfera 100 nm</td><td>ThermoScientific</td><td>3100A</td><td></td></tr><tr><td>Levamisol</td><td>Sigma</td><td>L-9756</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma</td><td>15502-10G</td><td></td></tr><tr><td>Ahringer Biblioteca de ARNi</td><td>Fuente: BioScience LifeSciences&nbsp;</td><td></td><td>http://www.lifesciences.sourcebioscience .com/productos-clones/no-mamíferos/c-elegans/c-elegans-rnai-library/</td></tr><tr><td>Equipo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga refrigerada Sorvall Legend XTR, 120VAC</td><td>ThermoScientific</td><td>75004521</td><td>http://www.coleparmer.com/Product/Thermo_Scientific_Sorvall_Legend_ XTR_Refrigerated_Centrifuge_120 VAC/EW-17707-60</td></tr><tr><td>Replicador de 96 pines&nbsp;</td><td>Scionomix&nbsp; &nbsp;</td><td></td><td>http://www.scinomix.com/all-products/96-pin-replicator/</td></tr> <tr><td>Agitador de incubación de alta capacidad HiGro&nbsp;</td><td>Digilab</td><td></td><td>http://www.digilabglobal.com/higro</td></tr><tr><td>Dispensador de reactivos combinado multigota&nbsp;</td>Estación de <td></td>trabajo <td>automatizada Titertrek</td><td></td></tr><tr><td>http://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/titertek.htm Biomek FX AP96&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>http://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/biomek_multi.htm</td></tr><tr><td>agitador Innova44</td><td>New Brunswick</td><td></td><td>http://www.eppendorf.com/int///index.php?sitemap=2.3&pb=d78efbc05310ec 04& acción=productos& contentid=1& catalognode=83389</td></tr><tr><td>M205 FA&nbsp;</td><td>Leica</td><td></td><td>http://www.leica-microsystems.com/de/produkte/stereomikroskope-makroskope/fluoreszenz/details/product/leica-m205-fa/</td></tr> <tr><td>ORCA-R2 C10600-10BDiscopio CCD http://www.hamamatsu.com/jp/en/community/life_science_camera/product/search/C10600-10B/index.html</td><td>Hamamatsu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spinning Disc AF Microscopio Confocal&nbsp;</td><td>Leica</td><td></td><td>http://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/life-science-research/fluorescence-microscopes/details/product/leica-sd-af/</td></tr> <tr><td>Cámara Falcon 4M60&nbsp;</td><td>Teledyne Dalsa&nbsp;</td><td></td><td>http://www.teledynedalsa.com/imaging/products/cameras/area-scan/falcon/PT-41-04M60/</td></tr> <tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MetaMorph Microscopy Automation & Software de análisis de imágenes</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>http://www.moleculardevices.com/products/software/meta-imaging-series/metamorph.html</td></tr><tr><td>Hamamatsu SimplePCI Software de análisis de imágenes</td><td>Meyer Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>http://meyerinst.com/imaging-software/hamamatsu/index.htm ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html</td></tr><tr><td>wrMTrck plugin para ImageJ</td><td></td><td></td><td>http://www.phage.dk/plugins/wrmtrck.html</td></tr><tr><td>C. elegans cepas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N2 (WT)</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td></td><td>http://www.cgc.cbs.umn.edu/strain.php?id=10570</td></tr><tr><td>AM815&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; rmIs323[myo-3p::sup35(r2e2)::rfp]</td>Laboratorio <td></td> de <td>Morimoto</td><td>disponible en nuestro laboratorio&nbsp;</td></tr><tr><td>Consulte la tabla 1 para obtener una fuente de deformaciones</td><td></td><td></td><td></td> del sensor de plegado y del indicador de tensión</tr></tbody></table>

la investigación de las proteínas priónicas, como la extensión y la toxicidad de uso del metazoan organismo modelo<em&gt; c. elegans</em

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Los priones son partículas proteicas no convencionales que se autopropagan, desprovistas de cualquier ácido nucleico codificante. Estas semillas proteicas sirven como molde para la conversión y replicación de su isoforma celular benigna. La evidencia acumulada sugiere que muchos agregados de proteínas pueden actuar como plantillas que se propagan por sí mismos y corromper el plegamiento de proteínas afines. Aunque los agregados pueden ser funcionales en ciertas circunstancias, este proceso a menudo conduce a la interrupción de la homeostasis de la proteína celular (proteostasis), lo que finalmente conduce a enfermedades devastadoras como la enfermedad de Alzheimer (EA), la enfermedad de Parkinson (EP), la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) o las encefalopatías espongiformes transmisibles (EET). Los mecanismos exactos de propagación de priones y de célula a célula de los agregados de proteínas siguen siendo objeto de una intensa investigación. Para avanzar en este conocimiento, recientemente se ha establecido un nuevo modelo de metazoo en Caenorhabditis elegans, para la expresión del dominio priónico de la proteína priónica de levadura citosólica Sup35. Este modelo de prión ofrece varias ventajas, ya que permite la monitorización directa del dominio priónico marcado con fluorescencia en animales vivos y facilita los enfoques genéticos. Aquí se describen métodos para estudiar el comportamiento de los agregados de proteínas similares a los priones y para identificar los modificadores de la toxicidad inducida por priones utilizando C. elegans.

Monitoreo intercelular propagación de proteínas priónicas como in vivo por time-lapse Transgénicos C. elegans líneas que expresan el dominio de priones son particularmente adecuados para el análisis de ciertos aspectos de proteínas priónicas-como, por ejemplo, la transmisión de célula a célula y la toxicidad no autónoma de la célula. La transparencia de los animales permite el seguimiento de fluorescencia proteínas etiquetadas desde dentro del orga...

priones de 'jove_content ha surgido recientemente como implicada en muchas enfermedades neurodegenerativas. El objetivo de este protocolo es describir cómo utilizar el nematodo C. elegans como sistema modelo para monitorear la propagación de proteínas e investigar fenómenos similares a los priones.

La investigación de las proteínas priónicas, como la extensión y la toxicidad de Uso del Metazoan Organismo modelo<em&gt; C. elegans</em

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for ...

El objetivo general de los siguientes experimentos es examinar la propagación y la toxicidad compleja de las proteínas similares a PreOn utilizando el organismo modelo de Metazoos C elegance. Esto se logra mediante el monitoreo del transporte intra e intracelular de vesículas que contienen la proteína similar a PreOn, utilizando microscopía de fluorescencia de lapso de tiempo. A continuación, sensores de plegamiento específicos de tejido y estrés expresado de forma ubicua.Los reporteros se utilizan para evaluar los efectos autónomos y no autónomos de las células en la aptitud celular. A continuación, se realiza un cribado de ARNi de todo el genoma para identificar nuevos modificadores de la toxicidad inducida por PreOn. El cribado se realiza en cultivo líquido utilizando el thrashing como lectura de la toxicidad.Por último, el worm tracker, un plugin para la imagen J se utiliza para cuantificar el movimiento de la elegancia C en combinación. Estos métodos permiten desentrañar las vías genéticas implicadas en el movimiento intercelular de las proteínas similares a PreOn y su toxicidad no celular autónoma. Después de preparar el control sincronizado de la elegancia del mar y las líneas transgénicas de dominio PreOn y las almohadillas 10%agros, de acuerdo con el protocolo de texto adjunto, pipetee tres microlitros de 100 nanogramos de perlas de poliestireno y tres microlitros de limassol de cuatro milimolares en la almohadilla agros.Usando un pico de alambre de platino, transfiera los gusanos a la edad deseada de una placa a la solución y use un cubreobjetos para cubrir y obtener imágenes de los gusanos a nivel subcelular. Coloque un portaobjetos en el soporte de portaobjetos del microscopio de un microscopio confocal y utilice un objetivo de aceite de 63 x o 100 x 1,4 NA. A continuación, abra METAMORPH y seleccione adquisición multidimensional.Y en la pestaña principal, marque las casillas de lapso de tiempo y diarios de ejecución. En la pestaña de guardado, seleccione o cree la carpeta del directorio para guardar archivos y asigne un nombre al archivo En la pestaña de longitud de onda, utilice Yoko quad red o una iluminación equivalente de imágenes MRFP y ajuste la exposición a entre 100 y 300 milisegundos y la ganancia de la cámara a entre 100 y 300. A continuación, en la pestaña Lapso de tiempo, establezca el intervalo de tiempo en un segundo, la duración en cinco minutos y el número de puntos de tiempo en 301.En la pestaña de diarios. Para el diario, seleccione Un conjunto de FC, Z de retención y A FC de retorno a Z de retención para el tipo seleccione especial dos veces y para el punto inicial, seleccione el punto de inicio y el punto de fin del tiempo. Una vez finalizada la configuración, presione adquirir Siguiendo este procedimiento, se pueden utilizar otros métodos, como las aplicaciones de seguimiento de partículas, para medir las propiedades dinámicas de las muestras.Después de sincronizar el dominio priónico transgénico transgénico y mientras se tipifican los nematodos y copiar las placas de la biblioteca de ARN inger de acuerdo con el protocolo de texto, incube las placas de ARNi duplicadas a 37 grados Celsius y 300 RPM para usar la bacteria HT uno 15 E coli que alberga el vector vacío L 4 4 4 0 como control. Cultive por separado en un tubo de cultivo y luego use una pipeta multicanal para transferir 65 microlitros del cultivo a un cuarto de los pocillos de 2 96. Placas de pocillos con una estación de trabajo automatizada que contiene un cabezal multicanal dispensado.10 microlitros de cinco, milimolares de IPTG diluido en cada pocillo de las bacterias ARNi y placas de control. Vuelva a sellarlos antes de incubarlos durante tres horas mientras se incuban las bacterias. Mezcle el control de tipo silvestre sincronizado y las larvas transgénicas L uno y el pocillo tampón M nine y pipetee de cinco a 10 microlitros en un microscopio de vidrio.Desliza el deslice el conteo de los gusanos y calcule el número de gusanos por microlitro. Después de las tres horas de incubación bacteriana, retire las placas de la incubadora y deje que alcancen la temperatura ambiente para evitar que el calor estrese a los gusanos. A continuación, complemente el tampón M nine con colesterol IPTG y antibióticos de acuerdo con el protocolo de texto.Y agregue el volumen apropiado de solución de gusano transgénico de dominio PreOn a una concentración final de 15 gusanos por mezcla de microlitro para distribuir uniformemente. A continuación, dispense 50 microlitros en cada pocillo de las placas de ARNi y en los pocillos de una de las placas de control de vectores vacías. Dispense la solución de gusano de tipo salvaje en la segunda placa de control.A continuación, deje todas las placas sin sellar para permitir la aireación y evitar que el cultivo líquido se evapore apilando cuatro o cinco placas juntas, envolviéndolas con una toalla de papel húmeda seguida de papel de aluminio. Incubar las placas a 20 grados centígrados y 200 RPM durante cuatro días. Para las placas, use una cámara Falcon 4 M 60 conectada a una computadora con un monitor para detectar visualmente un aumento de la paliza en comparación con los animales transgénicos de dominio PreOn tratados con control.La principal ventaja de utilizar una estación de trabajo automatizada de manejo de líquidos para dispensar los gusanos en las placas de ARNi R es que reduce en gran medida la variabilidad y el número de gusanos por pocillo. Para realizar un ensayo de motilidad en placas sólidas y validar los clones candidatos de ARNi, crecen bacterias de ARNi durante la noche de acuerdo con el protocolo de texto. A continuación, utilice un milimolar de IPTG para inducir la expresión de DS RNA durante tres horas.Utilice 150 microlitros de cada clon bacteriano de ARNi para sembrar placas de NGM previamente preparadas que se extienden en una capa delgada. Deje que las bacterias se sequen durante dos días a temperatura ambiente en la oscuridad bajo un microscopio estereoscópico. Determine la cantidad de lombrices sincronizadas y suspensión como se describió anteriormente y agregue de 25 a 30 L una larva en cada placa experimental.Incubar los nematodos a 20 grados centígrados durante cuatro días hasta que lleguen los gusanos. Segundo día de la edad adulta para cuantificar la motilidad de los gusanos, encienda la cámara y el sencillo software de imágenes PCI. Haga clic en el icono de la cámara para habilitar el ajuste de las condiciones de imagen.A continuación, configure la condición de imagen de la siguiente manera. Establezca la ganancia en cero, el modo de luz en el índice de alta velocidad en uno y el agrupamiento en dos. A continuación, haga clic en vivo y exponga automáticamente y ajuste las condiciones de iluminación moviendo los espejos del microscopio y los diales de brillo y contraste.Haga clic en tiempo, escanee y escriba en una carpeta y un nombre de archivo, establezca el retraso del campo en 20 milisegundos y el tiempo de detención en 30 segundos. Presione revisión en vivo para elegir el área de la placa para grabar. A continuación, golpea la placa tres o cuatro veces en el escenario.Confirme rápidamente su posición en el campo de visión y presione iniciar después de que la película termine de grabarse, haga clic derecho en la imagen y elija exportar secuencia de montaje para exportar la película de un formato CXD a un archivo A VI. Para analizar los videos de motilidad, abra la imagen J elija la pestaña de complementos, luego elija worm tracker y seleccione Worm Tracker batch, y seleccione el directorio que contiene todos los archivos a analizar en la ventana de entrada principal de Worm Tracker cargue por lotes los valores de entrada como se detalla aquí. Una explicación para cada uno de los parámetros se puede encontrar en las instrucciones que acompañan al plugin.Haga clic en Aceptar y permita que se ejecute el análisis de movimiento. Por último, para seleccionar los resultados, confirme que todas las huellas detectadas sean de la elegancia marina real y elimine los artefactos. Abra los archivos TXT creados para cada película y copie la información en un archivo de software de análisis de datos.Abra los archivos zip de etiquetas creados y ejecute las etiquetas TIFF resultantes para verificar y eliminar manualmente las pistas de gusanos falsos. Yesper Peterson, un ex postdoc en el laboratorio, tuvo por primera vez la idea del rastreador de gusanos como sustituto de nuestra evaluación manual del móvil CL Elegance, que es una lectura de la toxicidad. El rastreador de gusanos nos permite realizar estos experimentos de forma automatizada sin sesgos por parte del usuario, al tiempo que evaluamos más condiciones en menos tiempo mediante imágenes de lapso de tiempo.La RFP etiquetada como R dos y E dos, que se acumula en vesículas tubulares, se observó transportada dentro y entre las células mediante coex que expresa un sensor de plegamiento o un indicador de estrés. Junto con la célula proteica similar a PreOn, se pueden evaluar los efectos autónomos y no celulares. La expresión de R dos E dos en las células musculares conduce a un inicio más temprano de la agregación de Q 44 en el intestino, lo que revela que R dos E dos tiene efectos autónomos no celulares sobre la proteostasis, la coexpresión de R dos E dos Con el SOD tres PGFP El reportero de estrés oxidativo transcripcional conduce a la regulación positiva del reportero en diferentes tejidos, demostrando que el dominio PreOn induce una respuesta de estrés oxidativo no celular de forma autónoma siguiendo el cribado de todo el genoma.Esta película demuestra que las imágenes de alta resolución y la visualización en la pantalla de la computadora permiten la proyección de un cuarto de una placa simultáneamente Una vez dominado, ese protocolo de detección se puede realizar en 12 rondas de 25 placas por sesión. Si se realizan dos sesiones por semana, se puede analizar toda la biblioteca de ARNi en un plazo de seis semanas. El rastreador de gusanos se utilizó para cuantificar la motilidad de la elegancia C, como se ve aquí.Worm Tracker convierte un vídeo original en formato binario y a cada gusano se le asigna una pista. Los videos procesados se pueden ver con pistas superpuestas para eliminar manualmente cualquier artefacto. El parámetro de longitudes del cuerpo por segundo se normaliza para las posibles diferencias de tamaño. Nematodos.Este método identificó 35 supresores de la toxicidad inducida por PreOn que aumentaron el fenotipo de motilidad hasta al menos un 133% y hasta un 256% en comparación con los gusanos tratados con control. Al arrendar el rastreador de gusanos, es importante recordar verificar manualmente las huellas de gusanos obtenidas. El software hace un gran trabajo en la identificación de los gusanos, pero a veces el fondo aún puede identificarse erróneamente como un animal.Por lo tanto, recuerde verificar sus videos después de ejecutar el rastreador de gusanos en ellos. Estos métodos pueden ayudar a responder preguntas clave en el campo de las enfermedades neurodegenerativas, como si una determinada proteína de enlace de enfermedad es capaz de propagarse de célula a célula, de forma similar, o si existe un vínculo entre la transmisión intercelular y la toxicidad compleja de estas proteínas. Niños.

investigating-spreading-toxicity-prion-like-proteins-using-metazoan

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Ensayo β-amiloide toxicidad con un transgénico C. elegans Modelo

Este video muestra el procedimiento para la obtención de imágenes in vivo de C. elegans que expresan proteínas similares a priones marcadas con proteína fluorescente roja. El protocolo consiste en inmovilizar nematodos en una almohadilla de agarosa para la microscopía confocal de lapso de tiempo, revelando la agregación y el transporte de proteínas dentro y entre las células. Esta técnica es crucial para estudiar la agregación de proteínas relacionadas con enfermedades neurodegenerativas.

Imágenes de lapso de tiempo para monitorear la propagación transcelular de proteínas similares a priones en nematodos transgénicos

Se describen métodos para estudiar los aspectos de la amylopathies en el...

La<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Sistema Modelo para el Estudio Amylopathy

Aquí, presentamos el nematodo Caenorhabditis elegans como modelo para estudiar la interacción microbiana host versátil.

El nematodo Caenorhabditis Elegans - un modelo versátil en Vivo para el estudio de las interacciones huésped-microbio

Aquí, presentamos un protocolo para el aislamiento simple de grupos específicos de células neuronales vivas que expresan proteína fluorescente verde de líneas transgénicas de Caenorhabditis elegans.  Este método permite una variedad de estudios ex vivo centrados en neuronas específicas y tiene la capacidad de aislar las células para el cultivo a corto plazo.

Aislamiento de poblaciones de neuronas específicas de Roundworm Caenorhabditis elegans

Aquí, introducimos y describimos metodologías ampliamente accesibles que utilizan algunos modelos versátiles de nematodos, incluyendo necrosis inducida por canales de iones hiperactivados y neurotoxicidad inducida por agregados de proteínas, para monitorear y diseccionar los fundamentos celulares y moleculares de las enfermedades neurodegenerativas asociadas a la edad.

Modelar enfermedades neurodegenerativas asociadas a la edad en Caenorhabditis elegans

Aquí, presentamos un protocolo para evaluar las actividades neuroprotectoras de los compuestos de prueba en Caenorhabditis elegans, incluida la agregación de poliglutamina, la muerte neuronal y el comportamiento de quimioavoidencia, así como una integración ejemplar de múltiples fenotipos.

Caenorhabditis elegans como sistema modelo para descubrir compuestos bioactivos contra la neurotoxicidad mediada por poliglutamina

Aquí, se presenta un método para el análisis de la cinética de agregación de proteínas en el nematodo Caenorhabditis elegans. Los animales de una población sincronizada por edad se visualizan en diferentes puntos de tiempo, seguidos de un recuento de inclusión semiautomatizado en CellProfiler y se ajustan a un modelo matemático en AmyloFit.

Monitoreo de la cinética de agregación de proteínas in vivo mediante el conteo automatizado de inclusión en Caenorhabditis elegans

Este video muestra la técnica de microinyección en la gónada de C. elegans para crear animales transgénicos.

Generación de transgénicos estable C. elegans con microinyección

Aplicación de la electrofisiología de las sinapsis accesibles proporciona una medida cuantificable de la actividad sináptica, útil en el análisis de mutantes sinápticos. Este artículo describe un método de disección utilizado para exponer la uniones neuromusculares (UNM)...

Disección y de grabación de la unión neuromuscular C. Elegans

Aprende a estudiar la propagación y toxicidad de proteínas tipo prión en C. elegans mediante microscopía de fluorescencia y cribado RNAi. Este método identifica modificadores de toxicidad para investigar enfermedades neurodegenerativas.

La investigación de las proteínas priónicas, como la extensión y la toxicidad de Uso del Metazoan Organismo modelo

Explorar más videos