Name: Generación de transgénicos estable C. elegans con microinyección (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-08-15T12:12:00.000+00:00
Duration: 12 min 9 s
Description: Aprende a generar transgénicos estables en C. elegans mediante microinyección de plásmidos en la gónada. Este método permite visualizar proteínas fluorescentes in vivo y establecer líneas para estudios genéticos.

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Queremos reconocer el espíritu de cooperación de todos los miembros Caldwell laboratorio. Movimiento de investigación trastornos en el laboratorio ha sido apoyado por la distonía Bachmann-Strauss y la Fundación Parkinson, Reino Parkinson Foundation, American Parkinson Disease Association, Asociación de la Enfermedad de Parkinson de Alabama, la Fundación Michael J. Fox para la Investigación del Parkinson, y una investigación de pregrado.

Plásmido de expresión de construcción Dos plásmidos son necesarios: una para la expresión específica de tejido del gen de interés y un segundo como marcador de transformación seleccionables. Experimental plásmido <ol><li> Seleccione un promotor que se expresa en el tipo de tejidos / células de interés, por ejemplo, un nervio o músculo promotor específico. Si se va a expresar múltiples genes dentro del mismo tejido, un cassette promotor plásmido en el sistema de puerta de enlace (Invitrogen) se puede utilizar. Este enfoque permite la inserción de un gen de interés aguas abajo del promotor de 4 clonación de recombinación. En general, 2-5 kb de secuencias de aguas arriba es suficiente para tener una expresión correcta y exacta. </li><li> El cDNA del gen de interés puede ser clonado en dos formas: <ol><li> Clonación convencional con enzimas de restricción. </li><li> Para la clonación de puerta de enlace, que es amplificada por PCR utilizando los cebadores que contienen la puerta de enlace att secuencia B de recombinación. El cDNA amplificado se recombinan en la primera pDONR201 vector de donantes para crear el vector de entrada y luego se transformó en E. coli cepa DH5a. Después de la selección de recombinantes éxito y mini-prep aislamiento de ADN, el vector de entrada se recombina en el vector destino promotor que contiene para crear el plásmido de expresión. Detalles sobre la clonación de recombinación están disponibles, ya sea el manual de Invitrogen Gateway o en Caldwell et al. 5. </li></ol></li></ol> Marcador seleccionable plásmido Ejemplos de plásmidos marcador transgénicos incluyen rol-6 o el uso del promotor de la pared muscular del cuerpo unc-54 para dirigir la expresión de proteínas fluorescentes. Estos plásmidos marcadores suelen estar disponibles dentro de la comunidad de investigación bajo pedido. Microinyección de C. elegans Preparación <ol><li> Realizar el aislamiento del ADN de los dos plásmidos que se van a inyectar. Cuantificar ellos y se mezclan en una proporción de 1:1 de 50 ng / l cada uno. </li><li> Preparar pastillas de agar: <ol><li> Haga una solución al 2% de agarosa en el agua, el calor o en el microondas hasta que se disuelva. </li><li> Establecido varios 22 x 50 mm cubreobjetos en una mesa de trabajo. </li><li> Con una pipeta Pasteur, se coloca una gota de la agarosa derretida en una cubierta de vidrio y colocar inmediatamente una tapa de vidrio segundo a través de la caída en un ángulo de 90 a la primera. Repita este procedimiento para varios vasos de las demás. El diámetro del disco aplanado de agarosa debe estar entre 15-20 mm. </li><li> Después de la agarosa se ha solidificado (esto sólo se tarda un minuto), retire la tapa de vidrio y deje que el cojín de aire seco por completo (varias horas o toda la noche). </li><li> Tienda de las pastillas en una caja cubierta de vidrio a temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Hacer cargadores aguja para solución de ADN: Cargadores de aguja son creados a partir de 100 tubos capilares l que se calientan en el centro sobre una llama abierta y rápidamente sacó a sus aproximadamente el doble de longitud. Las dos mitades se rompió además una vez que el tubo capilar se enfría. 10-20 arsenal cargadores de aguja para la inyección. Guárdelo en posición vertical en un bastidor de tubo de microcentrífuga. Tenga cuidado de no atravesar a sí mismo en los puntos. </li><li> Hacen que las agujas de microinyección: La aguja está hecho de un tubo especial capilar que contiene un filamento de vidrio interior, este filamento sirve como mecha para la solución de ADN. Estos se extraen en una máquina de aguja-tirador. Utilizamos un Narishige PP-830 extractor con un ajuste de calor de 24,8. Varias agujas se tiran a la vez y se almacenan en una pequeña caja de plástico. Agujas múltiples pueden ser fácilmente &quot;montado&quot; en una tira de plastilina para almacenamiento a largo plazo. </li><li> Punta de la aguja &quot;interruptores&quot;: La punta de la aguja de microinyección se tira tan bien que en realidad es cerrado a fin, y debe ser rota abierta con pequeños fragmentos de cristal de la cubierta. Estos son preparados por el ajuste de un 18 x 18 mm cubierta de cristal en una toalla de papel y ejerciendo una suave presión hasta que se rompe en varios pedazos. Fragmentos de un tamaño útil es de aproximadamente 3 x 4 mm. </li><li> Crecen de forma silvestre tipo (N2) los gusanos a la etapa adulta temprana para la inyección mediante procedimientos estándar de 6. Preparar adecuadamente organizado cerca de 100 gusanos / construir inyectado. </li></ol> Procedimiento <ol><li> Abra la válvula principal en un tanque de helio que está conectado a un brazo de la aguja de microinyección y el soporte. Cierre la válvula de regulación para permitir que el gas para entrar en la línea, con lo que la presión a 35 psi. Tenga en cuenta que el gas puede ser liberado mediante un pedal. </li><li> Inserte un cargador de aguja en un tubo de la boca pipeteador estándar (que se encuentran en envases de tubos capilares) y la elaboración de una pequeña cantidad de la mezcla de plásmidos (~ 1 l). </li><li> El cargador de la aguja se coloca cuidadosamente en el extremo posterior de una aguja de inyección y se inserta suavemente todo el camino a través de la longitud dela aguja hasta que sienta resistencia. Expulsar a la solución de ADN por soplando suavemente, a continuación, retire el cargador. </li><li> Insertar la aguja en el brazo de la microinyección, teniendo cuidado de colocarla dentro de la junta de goma interno pequeño. </li><li> Coloque un trozo de aguja rotura de cristal de la cubierta en un borde de una plataforma de agar. Cubrir el fragmento, así como toda la superficie de la almohadilla de agar, con aceite de halocarbonos. Coloque la almohadilla de agar en el escenario de un microscopio invertido. </li><li> Posición de la aguja en el centro del campo de visión con el objetivo de 4X y la iluminación de campo claro, pero aún no se baja en el aceite. Además, la posición del borde interior de la astilla de cristal de la cubierta en el centro, a continuación, centrarse en él (aún con el objetivo 4X). Bajar la aguja en el aceite, con lo que en el mismo plano focal que el trozo de cubierta de vidrio. Levante la ampliación por el cambio con el objetivo de 40X. Centrarse en el borde del casco y la posición de la punta de la aguja, si es necesario. </li><li> La apertura de la punta de la aguja de inyección, suavemente empujar la aguja en el borde de la tapa de vidrio fragmento, mientras que al mismo tiempo la aplicación de un pulso corto de gas a través del pedal. La aguja se rompe lo suficientemente abierta cuando pequeñas gotas de líquido escapar del extremo de la aguja. Exceso de flujo de líquido debido a una abertura muy grande no es deseable, ya que matar a los animales. </li><li> Retire la almohadilla de agar a partir de la etapa de aumento de la aguja hacia arriba, pero no cambiar la posición de X o Y-eje. Deslice la etapa de debajo de la aguja, retire la almohadilla agar y colocarlo en un microscopio de disección. La transferencia de un gusano en la almohadilla, debajo de la superficie del aceite. Si el gusano se retuerce, frotar suavemente hasta que haga contacto con la almohadilla de agar. El gusano húmedos deben adherirse a los secos de agarosa. </li><li> Inyección <ol><li> Coloque rápidamente la parte de atrás pad agar en el escenario, centrando el gusano en el campo de visión. </li><li> Baje la aguja en el mismo plano de enfoque como el gusano. </li><li> Cambie el filtro de Hoffman Iluminación (un tipo de filtro de contraste). Esto permite que los detalles morfológicos del gusano a ser visible. Si Nomarski / DIC óptica están disponibles en el ámbito invertida que funciona tan bien. Utilizando el objetivo 40X, se centran en el &quot;grano&quot; centro sincitial de las gónadas del gusano, por debajo del &quot;nido de abeja&quot;, patrón de los núcleos germinales (elegir la gónada se coloca en el lado de la lombriz frente a la aguja). </li><li> Afinar la posición de la aguja hasta que la punta está también en el foco (el mismo plano que la gónada &quot;grano&quot;). </li><li> Suavemente inserte la aguja en el centro de la gónada y aplicar un breve pulso de la presión del gas para expulsar a una gota o dos de ADN en el brazo de las gónadas. Usted debe observar una ola de expansión de líquido a través de la gónada distal. No asuma más líquido es mejor, ya que un exceso de líquido puede fluir en la curva proximal del brazo de las gónadas, lo que puede detener la producción de ovocitos. Si es posible, dependiendo de la posición del gusano, se inyecta el brazo gonadal otros de la misma manera. </li><li> Es importante trabajar con rapidez, mientras que la inyección de un gusano, ya que puede secarse. La decisión de inyectar el brazo gonadal segundo depende de la rapidez con que puede volver a la posición de la aguja y el gusano. Todo el proceso lo ideal sería que en menos de 1-2 minutos. </li></ol></li><li> Quite la cubierta de vidrio desde el escenario y colóquelo en una microscopio de disección. Aplicar 1μl de buffer M9 (22 mm de KH 2 PO 4, 42 mm de Na 2 HPO 4, 85 mm de NaCl, 1 mM MgSO 4) directamente sobre el gusano inyecta (esto podría implicar sumergir la punta de la pipeta por debajo de la superficie del aceite de halocarbonos). El tampón debe rehidratar el gusano, sino que se va a flotar fuera de la superficie de la placa de agarosa. La transferencia de la lombriz en un plato normal con un pico del gusano. La almohadilla de agarosa puede ser reutilizado varias veces más hasta que se ha convertido en demasiado saturado con tampón y los gusanos ya no se adhieren. </li></ol> Selección de transgénicos <ol><li> Gusanos se inyecta, la generación P 0, se transfieren a platos individuales fresco, sin semillas con bacterias (60 mm) y les permite reproducirse. Por lo general, los animales inyectados se incuban a 20 ° C durante 2-3 días hasta que las crías aparecen. </li><li> La F 1 se observa la evidencia del marcador de transgénicos (como la fluorescencia), utilizando un microscopio estereoscópico fluorescente. Cada portador fluorescentes, F 1, los animales clonados por separado en un plato nuevo (ya que la descendencia de cada F 1 se considera una línea distinta). La F 1 hermafroditas se les permite reproducirse. De nuevo, esto se realiza normalmente en menos de 20 ° C durante 2-3 días hasta que las crías aparecen. </li><li> La generación F 2 se observa en los animales transgénicos así. F 2 animales que han heredado y expresan la variedad transgénica se consideran &quot;estable&quot; de línea. NOTA: En la F 1 deedad, puede haber muchos animales transgénicos, pero no son estables. La mayoría de los animales transgénicos F 1 no se propagarán en F 2 líneas estables. NOTA: Para el control de la variabilidad en el número de copias del gen, generar un mínimo de tres líneas independientes estables por la construcción de inyección. </li><li> Cada línea estable independiente debe mantenerse como una línea separada de los gusanos. Cada línea se puede propagar mediante la transferencia de varios animales transgénicos para una nueva placa en cada generación, lo que debe llevarse a cabo utilizando un microscopio estereoscópico fluorescente si el marcador de selección es fluorescente. </li></ol>

<ol><li>Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrachromosomal+DNA+transformation+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Extrachromosomal DNA transformation of Caenorhabditis elegans.</a> Mol. Cell. Biol. 5, 3484-3496 (1985).</li>
<li>Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+in+C.elegans%3A+extrachromosomal+maintenance+and+integration+of+transforming+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences.</a> EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).</li>
<li>Kelly, W. G., Xu, S., Montgomery, M. K., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+requirements+for+somatic+and+germline+expression+of+a+generally+expressed+Caenorhabditis+elegans+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Distinct requirements for somatic and germline expression of a generally expressed Caenorhabditis elegans gene.</a> Genetics. 146, 227-238 (1997).</li>
<li>Cao, S., Gelwix, C. C., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Torsin-mediated+neuroprotection+from+cellular+stresses+to+dopaminergic+neurons+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Torsin-mediated neuroprotection from cellular stresses to dopaminergic neurons of C. elegans.</a> J Neurosci. 25, 3801-3812 (2005).</li>
<li>Caldwell, G. Integrated Genomics: A Discovery-Based Laboratory Course. , John Wiley and Sons. West. Sussex, England. (2006).</li>
<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li>
</ol>

Cuando se realiza este procedimiento, es importante recordar lo siguiente: - Inyectar directamente en el centro de la gónada - No inyectar demasiado líquido - Trabajar con rapidez para evitar la desecación. Si llegas a tener problemas con la aguja, como se rompe demasiado grande, lo mejor es rehacer una aguja nueva, en lugar de tratar de inyectar con una aguja de menos de ideal. La generación de gusanos transgénicos tiene muchas aplicaciones, tales como: - La identificación de genes mutantes, en e...

<table><tbody><tr><td>Agarosa</td><td>Ultrapura</td><td>Invitrogen</td><td>15510-027</td><td></td></tr><tr><td>Aceite de halocarburo, Voltalef</td><td>Hulle 10S</td><td>elfatochem, Francia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos 18x18 mm</td><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-A</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos 20x30 mm</td><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-5A</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos 22x50 mm</td><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-E</td><td></td></tr><tr><td>Capilar de 100 µl</td><td></td><td>VWR international</td><td>53432-921</td><td></td></tr><tr><td>Capilar de vidrio para agujas</td><td>&quot;Kwik-Fil&quot;</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td>Extractor de agujas</td><td>Herramienta</td><td>Narishige International</td><td>Modelo PP-830</td><td></td></tr><tr><td>Sistema microINJECTOR</td><td></td><td>Tritech Research, Inc.</td><td>MINJ-1000</td><td>Microscopio, platina, manipulador</td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico, con fluorescencia</td><td>Microscopio</td><td>Nikon Instruments</td><td>SMZ800</td><td></td></tr><tr><td>Estereoscópico</td><td>Microscopio</td><td>Nikon Instruments</td><td>SMZ645</td><td></td></tr></tbody></table>

generación de transgénicos estable c. elegans con microinyección

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgénicos Caenorhabditis elegans pueden ser fácilmente creados a través de la microinyección de una solución de ADN plásmido en la gónada 1. El ADN del plásmido se reorganiza para formar concatamers extracromosómico que son heredados de forma estable, aunque no con la misma eficacia que los cromosomas actual 2. Un gen de interés es co-inyectados con un marcador fenotípico obvias, tales como rol-6 o las buenas prácticas agrarias, para permitir la selección de animales transgénicos con un microscopio de disección. El gen exógeno se puede expresar a partir de su promotor nativo para los estudios de localización celular. Por otra parte, el transgén puede ser impulsado por un promotor de diferentes tejidos específicos para evaluar la función del producto del gen en esa célula o tejido en particular. Esta técnica de manera eficiente las unidades de la expresión génica en todos los tejidos de C. elegans, excepto para el embrión o principios de la línea germinal 3. La creación de animales transgénicos es ampliamente utilizado para una variedad de paradigmas experimentales. Este video muestra el procedimiento de microinyección para generar gusanos transgénicos. Además, la selección y mantenimiento de líneas transgénicas estables C. elegans se describe.

Este video muestra la técnica de microinyección en la gónada de C. elegans para crear animales transgénicos.

Generación de transgénicos estable C. elegans con microinyección

Los ejemplares transgénicos de Caenorhabditis elegans pueden crearse fácilmente mediante la microinyección de una solución de plásmido de ADN en la gónada 1. El ADN plasmídico se reorganiza para ...

La elegancia marina es un organismo modelo increíblemente útil debido tanto a nuestro conocimiento de sus linajes celulares como a la gran cantidad de información obtenida al secuenciar y analizar todo su genoma. En este video, demostramos el proceso de microinyección de plásmidos en la elegancia marina y la selección de descendencia transgénica utilizando microscopía de fluorescencia. Al ser un animal transparente y multicelular, la elegancia marina es ideal para visualizar transgenes que expresan proteínas marcadas con fluorescencia in vivo. Hola, mi nombre es Laura Berkowitz y soy investigadora asociada en el Laboratorio Caldwell, del Departamento de Ciencias Biológicas de la Universidad de Alabama.Y yo soy Adam Knight, también del Laboratorio Calwell en la Universidad de Alabama. Hoy les mostraré cómo prepararse y realizar la microinyección de plasmina para generar ejemplares transgénicos de *C. elegans*, y también cómo seleccionar y mantener líneas transgénicas de *C. elegans*. Comencemos.Antes de comenzar la microinyección, tenemos algunos pasos de preparación que les mostraré ahora. Primero, prepare el ADN plasmídico que se va a inyectar; se requieren dos plásmidos, uno que codifique la expresión específica del tejido de nuestro gen de interés y un segundo que proporcione un marcador de transformación seleccionable. Mezcle los plásmidos juntos en una proporción uno a uno de 50 nanogramos por microlitro.A continuación, prepare almohadillas de tornillo, que se utilizarán para inmovilizar los gusanos durante la inyección. Para fabricar las almohadillas de tornillo, coloque primero varias cubreobjetos de 22 por 50 milímetros sobre la superficie de trabajo. Con una pipeta Pasteur, coloque una gota de agarosa al 2% fundida sobre un cubreobjetos y, de inmediato, coloque un segundo cubreobjetos sobre la gota formando un ángulo de 90 grados respecto al primero.Deje que el aero se solidifique durante unos segundos y luego retire el cubreobjetos superior. El diámetro del disco aplanado de aero debe estar entre 15 y 20 milímetros. Como si fuera una mascota, deje que la almohadilla se seque al aire por completo durante varias horas o durante la noche.Una vez que estén secos, almacene las placas en una caja de cubreobjetos a temperatura ambiente. A continuación, prepare las cargas para aguja con la solución de ADN. Para ello, tome un tubo capilar de cien microlitros y cálientelo en la mitad con una llama abierta, luego estírelo rápidamente hasta aproximadamente el doble de su longitud.Una vez que el tubo capilar se enfríe, sepárelo en dos mitades con un movimiento brusco. Acumule de 10 a 20 cargadores de aguja para la inyección. Pueden almacenarse en posición vertical dentro de un tubo de microcentrífuga.Brack, tenga cuidado. Los extremos del cargador de agujas son muy afilados. Ahora fabrique las agujas de microinyección.Estas agujas están hechas de un tubo capilar especial que contiene un filamento interno de vidrio. Este filamento sirve como mecha para la solución de ADN. Para fabricar las agujas, utilizamos una Niki PP ocho 30 Polar con un ajuste de calor de 24,8, y se extraen varias agujas a la vez para su almacenamiento.Pueden montarse múltiples agujas sobre una tira de arcilla para modelar. Se utilizarán pequeños fragmentos de cubreobjetos para romper la punta de la aguja estirada. Estos fragmentos se preparan envolviendo un cubreobjetos de 18 por 18 milímetros en una toalla Kim y aplicando presión suavemente hasta que se rompa en varias piezas.Utilice fragmentos de aproximadamente tres por cuatro milímetros de tamaño. Además de preparar el ADN y las agujas, prepare alrededor de 50 a 100 ejemplares adecuadamente estadiados. Dos gusanos de tipo silvestre por cada construcción de vector de expresión que se vaya a inyectar.Ahora estamos listos para configurar el microscopio de microinyección. Para comenzar la configuración del microscopio, abra la válvula principal del tanque de helio que está conectado al brazo y soporte de la aguja de microinyección. Cierre el regulador para permitir que el gas entre en la línea.Llevando la presión a 35 PSI, el gas puede liberarse utilizando un pedal de pie. A continuación, inserte un cargador de aguja en un tubo de pipeta de boca estándar y coloque una pequeña cantidad de la mezcla de plásmido, aproximadamente un microlitro. Ahora, inserte suavemente el cargador completamente a través de la aguja de microinyección hasta sentir resistencia.Expele la solución de ADN mediante soplido suave y luego retire el cargador. Una vez cargado el ADN, inserte la aguja en el brazo de microinyección, teniendo cuidado de colocarla dentro de la pequeña junta de goma interna y luego sujétela al brazo del manipulador. A continuación, coloque un fragmento de vidrio de cubreobjetos para romper agujas en un borde de la almohadilla de tornillo sin fin.Cubra el fragmento, así como toda la superficie de la almohadilla de auga, con aceite de carbono hueco. Luego, coloque la almohadilla de auga sobre la platina de un microscopio invertido. Una vez que la almohadilla de auga esté colocada, posicione la aguja en el centro del campo de visión utilizando el objetivo Forex y la iluminación de campo claro, pero aún no la baje hasta el aceite.A continuación, coloque el borde interno del fragmento de cubreobjetos en el centro y enfoque sobre él. Baje la aguja dentro del aceite, llevándola al mismo plano focal que el fragmento de cubreobjetos. Aumente el aumento cambiando al objetivo de 40 x, luego vuelva a enfocar el borde del fragmento y reposicione la punta de la aguja si es necesario.Ahora rompa la punta del aguja de inyección. Empuje suavemente la aguja contra el borde del fragmento de cubreobjetos, mientras al mismo tiempo aplica un breve pulso de gas mediante el pedal. La aguja quedará suficientemente abierta.Cuando pequeñas gotas de líquido escapan por el extremo de la aguja debido a un flujo excesivo provocado por una abertura demasiado grande, esto no es deseable ya que matará a los animales. Una vez que la aguja esté lista, comenzamos la microinyección. A continuación, retire la almohadilla del husillo del platino elevando la aguja.Pero no cambie la posición de los ejes X o Y. Deslice la platina desde debajo de la aguja. Retire la almohadilla helicoidal y colóquela bajo un microscopio de disección.Transfiera una palabra al pad debajo de la superficie del aceite. Si el gusano se retuerce suavemente, acaríciele hasta que haga contacto con el pad del sacabocados; el gusano húmedo debe adherirse al agro seco. Coloque rápidamente el pad del sacabocados de nuevo sobre la platina, centrando el gusano en el campo de visión.Luego baje la aguja hasta el mismo plano de enfoque que el gusano. Cambie los filtros del microscopio invertido a iluminación Hoffman. Este filtro de contraste permite que los detalles morfológicos del gusano sean visibles.Utilizando el objetivo de 40 x, enfoque el centro sensorial granular de la gónada del gusano debajo del patrón de panal de los núcleos germinales. Elija la gónada que esté situada en el lado del gusano que mira hacia la aguja. Ajuste finamente la posición de la aguja hasta que la punta también esté enfocada.Inserte suavemente la aguja en el centro del gonada y aplique un breve pulso de presión de gas para expulsar una o dos gotas de ADN dentro del brazo del gonada. Con mucha práctica y habilidad, debería observar una onda de líquido extendiéndose a través del gonada distal. Puede impactar el centro del gonada cada vez.Tenga en cuenta que es importante trabajar rápidamente al inyectar un gusano, ya que puede desecarse fácilmente. Todo el proceso debería tardar idealmente menos de uno a dos minutos.Una vez finalizada la inyección, retire la almohadilla del tornillo sinfín del portaobjetos y colóquela bajo un microscopio estereoscópico. Aplique un microlitro de tampón M nueve directamente sobre el gusano inyectado. Esto podría requerir sumergir la punta de la pipeta por debajo de la superficie del aceite de halo carburo.El tampón debe rehidratar al gusano y este entonces flotará sobre la superficie del disco de aeros; transfiera el gusano a una placa convencional utilizando un punzón para gusanos. Ahora entregaré los gusanos inyectados a Adam, y él nos mostrará la selección y el mantenimiento de líneas transgénicas. Los gusanos inyectados se transfieren a placas individuales de 60 milímetros con siembra fresca y se les permite reproducirse.Estos gusanos representan la generación P cero. Por lo general, los animales inyectados se incuban a 20 grados Celsius durante dos o tres días hasta que aparezcan los descendientes. Una vez que aparecen los descendientes, estamos listos para comenzar a seleccionar gusanos transgénicos.Se observan los descendientes F1 en busca de evidencia del marcador transgénico. En este caso, el marcador seleccionable es fluorescente, por lo que podemos realizar el tamizaje utilizando un microscopio estereoscópico de fluorescencia. Cada animal portador fluorescente de la generación F1 se clona por separado en una placa nueva.El P cero inyectado puede producir solo de uno a cinco descendientes fluorescentes entre todos sus F1. Deje que los hermafroditas F1 se reproduzcan a 20 grados durante dos o tres días hasta que aparezca la descendencia. Una vez que la generación F2 esté lista, también se observa la presencia de animales transgénicos. Los animales F2 que han heredado y expresado un marcador transgénico se consideran una línea estable.Cada línea estable independiente debe mantenerse como una línea separada de gusanos; propague cada línea transfiriendo varios animales transgénicos a una nueva placa en cada generación. Esto debe realizarse utilizando un microscopio estereoscópico fluorescente. Si el marcador seleccionable es fluorescente, para controlar la variabilidad en el número de copias del gen, genere al menos tres líneas estables independientes por cada constructo inyectado.Acabamos de mostrarle cómo microinyectar vectores de expresión, construcciones vectoriales y ver elgan, y cómo seleccionar líneas estables. Eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.

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