Generación de transgénicos estable C. elegans con microinyección

Sea elegance es un organismo modelo increíblemente útil tanto por el conocimiento de sus linajes celulares como por la gran cantidad de información producida por haber secuenciado y analizado todo su genoma. En este video, demostramos el proceso de micro inyección de plásmidos en el mar elegance y la selección de descendencia transgénica utilizando microscopía fluorescente como un animal transparente y multicelular, sea elegance es ideal para visualizar transgenes que expresan proteínas marcadas con fluorescencia in vivo. Hola, mi nombre es Laura Berkowitz y soy investigadora asociada en el Laboratorio Caldwell en el Departamento de Ciencias Biológicas de la Universidad de Alabama.

Y yo soy Adam Knight, también del Laboratorio Calwell de la Universidad de Alabama. Hoy les mostraré cómo prepararse y realizar la microinyección de plasmina para generar elegancia marina transgénica, y les mostraré cómo seleccionar y mantener las líneas de elegancia del sello transgénico. Así que comencemos.

Antes de comenzar la microinyección, tenemos algunos pasos de preparación, que te mostraré ahora. En primer lugar, preparar el ADN plasmídico que se va a inyectar, se requieren dos plásmidos, uno que codifique la expresión específica del tejido de nuestro gen de interés, y el segundo que proporcione un marcador de transformación seleccionable. Mezcle los plásmidos en una proporción de uno a uno de 50 nanogramos por microlitro.

Cada uno de los siguientes, prepare almohadillas de barrena, que se utilizarán para inmovilizar los gusanos para la inyección. Para hacer las almohadillas de barrena, primero coloque varios cubreobjetos de 22 por 50 milímetros en la mesa de trabajo. Con una pipeta de pasto, coloque una gota de 2%agros derretidos en un cubreobjetos e inmediatamente coloque un segundo cubreobjetos sobre la gota en un ángulo de 90 grados con respecto al primero.

Deje que el aero se solidifique durante unos segundos y luego retire la cubierta superior del vidrio. El diámetro del disco aplanado de aerodinámica debe estar entre 15 y 20 milímetros. Al igual que una mascota, deje que la almohadilla se seque completamente al aire durante varias horas o toda la noche.

Una vez que estén secas, guarde las almohadillas en una caja de vidrio a temperatura ambiente. A continuación, prepare los cargadores de agujas para la solución de ADN. Para hacer esto, tome un tubo capilar de cien microlitros y caliéntelo en medio de una llama abierta y tire rápidamente hasta aproximadamente el doble de su longitud.

Una vez que el tubo capilar se enfríe, separa las dos mitades. Acopie de 10 a 20 cargadores de agujas para inyección. Puede almacenarlos en posición vertical en un tubo de microcentrífuga.

Brack, ten cuidado. Las puntas del cargador de agujas son muy afiladas. Ahora haga las agujas de micro inyección.

Estas agujas están hechas de un tubo capilar especial que contiene un filamento de vidrio interno. Este filamento sirve como mecha para la solución de ADN. Para hacer las agujas utilizamos una Niki PP eight 30 Polar con un ajuste de calor de 24.8, se tiran varias agujas a la vez para su almacenamiento.

Se pueden montar varias agujas en una tira de arcilla para modelar. Se usarán pequeños fragmentos de cubreobjetos para abrir la punta de la aguja extraída. Estos fragmentos se preparan envolviendo un cubreobjetos de 18 por 18 milímetros en una toallita Kim y aplicando una suave presión hasta que se rompa en varios pedazos.

Utilice fragmentos de aproximadamente tres por cuatro milímetros de tamaño. Además de preparar el ADN y las agujas, prepare entre 50 y 100 debidamente preparadas. Dos gusanos de tipo salvaje para cada construcción de vector de expresión que se va a inyectar.

Ahora estamos listos para configurar el microscopio de microinyección. Para comenzar a configurar el microscopio, abra la válvula principal del tanque de helio que está conectada al brazo y al soporte de la aguja de microinyección. Cierre el regulador para permitir que el gas ingrese a la línea.

Llevando la presión a 35 PSI, el gas se puede liberar con un pedal. A continuación, inserte un cargador de agujas en un tubo de pipeteo bucal estándar y deje caer una pequeña cantidad de la mezcla de plásmidos de aproximadamente un microlitro. Ahora inserte suavemente el cargador a través de la aguja de microinyección hasta que se sienta resistencia.

Expulse la solución de ADN soplando suavemente y luego retire el cargador. Una vez cargado el ADN, inserte la aguja en el brazo de microinyección, teniendo cuidado de colocarla dentro de la pequeña junta de goma interna y luego sujetela al brazo del manipulador. A continuación, coloque un fragmento de cubreobjetos que rompe la aguja en un borde de una almohadilla de barrena.

Cubra el fragmento y toda la superficie de la almohadilla de la barrena con aceite de carbón sagrado. A continuación, coloque la almohadilla de la barrena en la platina de un microscopio invertido. Una vez que la almohadilla de la barrena esté en su lugar, coloque la aguja en el centro del campo de visión utilizando el objetivo de Forex y la iluminación de campo brillante, pero aún no la baje en el aceite.

A continuación, coloque el borde interior del fragmento de cubreobjetos en el centro y, a continuación, concéntrelo. Sumerge la aguja en el aceite, colocándola en el mismo plano focal que el fragmento de cubreobjetos. Aumente el aumento cambiando al objetivo de 40x, luego vuelva a enfocar el borde del fragmento y vuelva a colocar la punta de la aguja si es necesario.

Ahora rompa Abra la punta de la aguja de inyección. Empuje suavemente la aguja contra el borde del fragmento de cubreobjetos, mientras aplica un breve pulso de gas a través del pedal. La aguja estará lo suficientemente abierta.

Cuando pequeñas gotas de líquido escapan del extremo de la aguja por el exceso de flujo de líquido debido a que es demasiado grande, no es deseable una abertura, ya que matará a los animales. Una vez que la aguja está lista, comenzamos la microinyección. A continuación, retire la almohadilla de la barrena de la plataforma levantando la aguja hacia arriba.

Pero no cambie la posición de los ejes X o Y. Desliza la platina hacia afuera por debajo de la aguja. Retire la almohadilla de la barrena y colóquela en un microscopio de disección.

Transfiera una palabra a la almohadilla debajo de la superficie del aceite. Si el gusano se retuerce, lo acaricia suavemente hasta que entre en contacto con la almohadilla de la barrena, el gusano húmedo debe adherirse al agro seco. Vuelva a colocar rápidamente la almohadilla de la barrena en el escenario, centrando el tornillo sin fin en el campo de visión.

A continuación, baje la aguja al mismo plano de enfoque que el gusano. Cambie los filtros del visor invertido a la iluminación Hoffman. Este filtro de contraste permite que los detalles morfológicos del gusano se hagan visibles.

Usando el objetivo 40x, concéntrese en el centro sensorial granulado de la gónada del gusano debajo del patrón de panal de los núcleos germinales. Elija la gónada que esté colocada en el lado del gusano frente a la aguja. Multa. Ajuste la posición de la aguja hasta que la punta también esté enfocada.

Inserte suavemente la aguja en el centro de la gónada y aplique un breve pulso de presión de gas para expulsar una o dos gotas de ADN en el brazo de la gónada. Debes observar una ola de líquido esparcida por el aguijón distal con mucha práctica y habilidad. Puedes golpear el centro de aguijón cada vez.

Tenga en cuenta que es importante trabajar rápidamente mientras inyecta un gusano. Ya que se puede desecar fácilmente. Lo ideal es que todo el proceso dure menos de uno o dos minutos.

Una vez completada la inyección, retire la almohadilla de la barrena de la platina y colóquela en un endoscopio de disección. Aplique un microlitro de tampón M nine directamente sobre el gusano inyectado. Esto podría implicar sumergir la punta de la pipeta por debajo de la superficie del aceite de carbohidrato halo.

El tampón debe rehidratar el gusano y luego flotará fuera de la superficie de la almohadilla aeros, transferirá el gusano a un plato normal con un pico de gusano. Ahora le entregaré los gusanos inyectados a Adán y él nos mostrará la selección y el mantenimiento de las líneas transgénicas. Los gusanos inyectados se transfieren a placas individuales de 60 milímetros recién sembradas y se les permite reproducirse.

Estos gusanos representan la generación P cero. Por lo general, los animales inyectados se incuban a 20 grados centígrados durante dos o tres días hasta que aparecen las crías. Una vez que aparecen las crías, estamos listos para comenzar la detección de gusanos transgénicos.

Se observa a los descendientes F1 en busca de evidencia del marcador transgénico. En este caso, el marcador seleccionable es fluorescente, por lo que podemos realizar el cribado mediante un microscopio estereoscópico fluorescente. Cada animal portador de fluorescencia F1 se clona por separado en una nueva placa.

El P cero inyectado solo puede producir de uno a cinco descendientes fluorescentes entre todos sus F1. Permita que los hermafroditas F1 se reproduzcan a 20 grados durante dos o tres días hasta que aparezcan las crías. Una vez que la generación F dos está lista, también se observan para animales transgénicos. F dos animales que han heredado y expresado un marcador transgénico se consideran una línea estable.

Cada línea estable independiente debe mantenerse, ya que una línea separada de gusanos propaga cada línea transfiriendo varios animales transgénicos a una nueva placa en cada generación. Esto debe realizarse con un microscopio estereoscópico fluorescente. Si el marcador seleccionable es fluorescente para controlar la variabilidad en el número de copias del gen, genere un mínimo de tres líneas estables independientes por constructo inyectado.

Acabamos de mostrarte cómo microinyectar expresión, construcciones vectoriales y ver elgan y seleccionar líneas estables. Así que eso es todo. Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.