Ensayo β-amiloide toxicidad con un transgénico C. elegans Modelo

El objetivo general del siguiente experimento es analizar la toxicidad del péptido beta amiloide en un sistema modelo InVivo. La reproducibilidad y la relativa simplicidad de este ensayo permiten realizar pruebas rápidas de fármacos, condiciones ambientales o modificaciones genéticas sobre la toxicidad de la beta amiloide. Un factor clave en el desarrollo de este ensayo es la generación de gusanos de Cl egan transgénicos con expresión del péptido beta amiloide inducible por temperatura específica del músculo.

Esta expresión sensible a la temperatura se diseña mediante la construcción de un transgén que contiene una región anormalmente larga de tres primos no traducidos, lo que hace que el ARNm del transgén sea un objetivo de la vigilancia del ARNm, por lo tanto, la expresión de este transgén es pobre en gusanos de tipo salvaje con un sistema de vigilancia de ARNm funcional debido a la degradación del ARNm del transgén. Si este transgén se introduce en un fondo genético que contiene una mutación en un componente esencial del sistema de vigilancia del ARNm, la expresión del transgén será significativamente mayor. Si el fondo genético contiene una mutación sensible a la temperatura en el sistema de vigilancia de ARNm, entonces la propagación de esta cepa trenchgénica a la temperatura no permisiva bloqueará la degradación del ARNm del gen de la trinchera y dará como resultado gusanos trenchgénicos de alta expresión génica de la trinchera que emplean este sistema para regular la expresión muscular de la pared corporal del cambio de temperatura del péptido beta amiloide de 16 grados Celsius a 25 grados Celsius. da lugar a una alta acumulación del péptido beta amiloide, disfunción de las células musculares y parálisis de los gusanos medición del tiempo.

Se necesita una población de estos gusanos trenchgénicos para quedar paralizada después de la temperatura. Upshift es un ensayo sensible para la toxicidad de la beta amiloide. Esto se logra mediante la fabricación de placas frescas de medios de crecimiento de nematodos para el ensayo de parálisis, lo que ayuda a minimizar las variables ambientales que pueden influir en las tasas de parálisis.

Como segundo paso, las poblaciones de gusanos trenchgénicos sincronizadas por edad o iniciadas, minimizan los efectos de la etapa de desarrollo sobre la expresión de transgenes. A continuación, las terceras larvas sincronizadas se desplazan hacia arriba de 16 grados Celsius a 25 grados Celsius, lo que aumenta la estabilidad del ARNm del transgén y conduce a la acumulación del péptido beta amiloide. La medición del tiempo desde el cambio ascendente hasta la parálisis de cada gusano captura la tasa de disfunción muscular, analizando así los efectos tóxicos de la acumulación de péptido beta amiloide. Se obtienen resultados que muestran el efecto de tratamientos específicos sobre la toxicidad del péptido beta amiloide expresado endógenamente.

Por lo tanto, la principal ventaja de nuestra técnica, a diferencia de utilizar modelos de ratón transgénicos para analizar la actividad de los fármacos, es que podemos hacer la nuestra mucho más rápidamente y de forma mucho menos costosa. La demostración visual de este método es fundamental. La puntuación de L cuatro gusanos en un ensayo de parálisis es muy difícil de aprender.

Por lo tanto, cuando se está marcando un gusano L 4 paralizado, lo que se quiere observar es el movimiento aislado del halo de la región de la cabeza del gusano. Una vez que se está moviendo y todo el cuerpo del gusano está paralizado, marcaríamos a ese gusano como paralizado. Los ensayos de parálisis se realizan en placas de medios de crecimiento de nematodos estándar o NGM utilizados habitualmente para la propagación y la genética de CL egan.

Para preparar las placas en autoclave, la solución de NGM que contiene cloruro de sodio, agar y péptido en un matraz erlenmeyer, luego agregue las cantidades adecuadas de las siguientes soluciones estériles que se pueden encontrar en el protocolo escrito adjunto. Alícuota de 10 mililitros de NGM líquido en cada placa de Petri de 60 milímetros por 15 milímetros. Deje que el NGM se solidifique durante la noche a temperatura ambiente.

Si se analizan los efectos de compuestos o extractos, alícuota el extracto en cada placa y use un esparcidor para distribuirlo uniformemente sobre la superficie de la placa. Deje que los platos se sequen durante la noche a temperatura ambiente. Los volúmenes superiores a un mililitro requerirán más tiempo para secarse.

A continuación, coloque cada placa con 250 microlitros de E. coli cepa OP 50 cultivada en medios LB durante la noche hasta una densidad óptica de 0,4 a 0,6, deje que las bacterias se sequen durante la noche a temperatura ambiente. La edad de la placa tiene un efecto significativo en la tasa de parálisis y, como tal, las placas más viejas tienden a secarse. Las placas deben servirse dentro de una semana después de la prueba de parálisis.

Lo ideal es utilizar platos que se hayan vertido tres o cuatro días antes de la puesta de huevos sincrónica, los platos utilizados en cualquier experimento deben provenir todos del mismo lote, lo que altera el tamaño del césped y/o las bacterias también alterarán el comportamiento de los gusanos. Los ensayos de parálisis se pueden realizar utilizando cepas alternativas de E. coli. Por ejemplo, HT one 15 se utiliza en experimentos de ARNi. Sin embargo, esto puede cambiar la cinética del ensayo de parálisis.

Por lo tanto, hay que utilizar controles internos que sean apropiados para la deformación. CL 476 se usa más comúnmente para analizar una parálisis inducida por beta. Esta cepa y otros modelos transgénicos están disponibles para los investigadores académicos por una tarifa simbólica en el Centro Genético de Saint Ahadi.

Para maximizar la sincronía de edad de la población de prueba, es preferible. Comience con una generación parental sincronizada. Una semana antes de iniciar el ensayo de parálisis de la población de prueba, utilice un recogedor de gusanos de platino para transferir de 20 a 30 adultos graves a varias placas de NGM de 10 centímetros.

Untar con OP 50 durante dos horas poner huevos a 16 grados centígrados, que es la temperatura permisiva para CL 4 1 76. Retire los adultos GR y permita que la progenie crezca durante siete días, momento en el cual serán adultos de tumba en el segundo día. Segundo día gravedad.

Los adultos se utilizan para preparar las poblaciones de pruebas sincrónicas por edad para cada condición experimental. El objetivo es generar placas triplicadas que contengan gusanos sincrónicos de 50 a 75 años utilizando un recogedor de gusanos de platino Transfiera de 10 a 12 del día, dos adultos más graves a placas NGM de 60 milímetros manchadas con OP 50. Permita que los gusanos pongan huevos a 16 grados centígrados durante dos horas, luego retire a los adultos y permita que los huevos eclosionen y crezcan a 16 grados centígrados.

En este punto, es mejor tener a alguien que no marque las placas para codificarlas de modo que la puntuación sea ciega a las condiciones experimentales. La etapa del desarrollo embrionario cuando se ponen los huevos, que es aproximadamente la etapa de 26 células para los gusanos de tipo salvaje en condiciones óptimas, es una función de la edad adulta y la nutrición. Si los adultos por gravedad utilizados para la puesta de huevos son mayores o están hambrientos, se pondrán huevos en etapas más tardías y no se logrará la población sincrónica, lo que afectará la cinética del ensayo de parálisis.

Es esencial que se utilicen cultivos bacterianos monogénicos como E. coli, OP 50, ya que la contaminación bacteriana de cualquier tipo puede afectar gravemente a este ensayo. La reproducibilidad es mayor si sus placas triplicadas tienen un número similar de gusanos para inducir el transgén y llevar a cabo el ensayo de parálisis. Placas de cambio ascendente a 25 grados centígrados.

48 horas después del final de la puesta sincrónica de huevos, el gusano debe estar en la tercera etapa larvaria. Las placas deben colocarse sin apilar en una incubadora de 25 grados centígrados para permitir que las placas alcancen esta temperatura. Al mismo tiempo, comience a marcar la parálisis de los gusanos a las 18 a 20 horas después de que se haya iniciado el cambio ascendente.

En este punto, todos los gusanos de la población deberían haber alcanzado la cuarta etapa larvaria, continuar anotando en incrementos de dos horas hasta que todos los gusanos en cada una de las placas estén paralizados. Por razones desconocidas, la parálisis no es uniforme en toda la longitud del cuerpo. La región de la cabeza es la última parte del gusano en dejar de moverse.

Por lo tanto, los gusanos que han iniciado recientemente la parálisis no pueden trasladarse a través de la placa, pero pueden mover sus cabezas, eliminando así las bacterias alrededor de su parte anterior y dejando un halo de bacterias eliminadas. Estos gusanos invariablemente se paralizarán por completo y, por lo tanto, los gusanos con halos se caracterizan por estar paralizados. Algunos gusanos no tendrán halos, pero tampoco mostrarán movimiento espontáneo.

Estos se prueban pinchándolos con el recogedor de gusanos. Si un gusano pinchado no puede someterse a la propagación de ondas de cuerpo completo al pinchar, también se puntúa como paralizado para una puntuación eficiente. Es más fácil mover los gusanos paralizados a un sector no manchado del plato para que no se vuelvan a anotar involuntariamente en el próximo período de puntuación.

Esto también permite que los gusanos mal categorizados demuestren movimiento, lo que permite que una corrección de puntuación genere una curva de parálisis. En cada punto de tiempo, la fracción de gusanos en cada placa que no han sido paralizados se convierte en un porcentaje, y el porcentaje promedio sin paralelo se traza contra el tiempo desde el momento en que se inició el cambio ascendente. La curva resultante es formalmente análoga a una curva de supervivencia y, por lo tanto, puede analizarse utilizando estadísticos de supervivencia no paramétricos estándar.

El cambio ascendente de los gusanos transgénicos myo three A beta debe realizarse a mediados de la etapa L 4 para que se inicie la parálisis. El promotor Myo three está regulado por el desarrollo. Una vez que los gusanos han alcanzado la edad adulta tardía, el nivel de expresión ha disminuido significativamente.

La expresión del transgén se bloquea si los gusanos están hambrientos, por lo que es muy esencial que los gusanos estén bien alimentados durante todo el experimento. Nunca hemos observado que un gusano paralizado se recupere bajo ninguna condición. Después de 12 a 16 horas de cambio ascendente, CL 41 76 se paralizará, independientemente de si lo reduce a 16 grados de tensión, la regulación positiva de CL 41 76 de la expresión del transgén que causa la parálisis puede ocurrir a temperaturas más bajas.

Sin embargo, tenga en cuenta que la tasa de parálisis se verá afectada en su tiempo. La tasa de parálisis depende de la cepa transgénica específica utilizada. Hemos construido myo tres cepas beta A que tienen una tasa de parálisis más rápida y más lenta que la CL 41 76 y, como tal, debe ajustar su ventana de puntuación para el ensayo de parálisis en consecuencia.

Aquí se muestra un gráfico de una curva de parálisis para CL 4 1 76, tanto sin tratar como expuestos a 6,27 milimolares de cafeína. Este tratamiento da lugar a un retraso estadísticamente significativo de la parálisis de aproximadamente cuatro horas, lo que interpretamos como indicativo de supresión de una toxicidad beta. En este modelo, este experimento ensayó los efectos de otro compuesto que se encuentra en el café.

La parcela es típica para tratamientos que no afectan a una toxicidad beta. Obsérvese que en ambos experimentos, aproximadamente la mitad de las poblaciones de CL 4 1 76 no tratadas quedan paralizadas a las 24 horas y la parálisis se completa a las 28 horas. Estos son plazos típicos de la parálisis del control.

Las desviaciones significativas de las poblaciones de CL 4 1 7 6 con respecto a este momento son indicativas de condiciones ambientales alteradas o de deleción espontánea de copias transgénicas. Consulte el protocolo adjunto para obtener información adicional sobre la cepa CL 4 1 76. Al intentar este procedimiento, es importante tener en cuenta la edad de las placas, la etapa de la población de gusanos y la capacidad de anotar la tasa de parálisis de los gusanos.

Después de ver este video, debería tener una buena idea de cómo usar este sistema de elgan marino para analizar cuidadosamente la toxicidad de la beta amiloide. Debería ser capaz de detectar efectos bastante sutiles sobre esta toxicidad de una variedad de tratamientos ambientales o farmacológicos. Es importante prestar atención a las variables de las que hemos hablado porque esto le permitirá realizar el ensayo de forma muy reproducible y con una cinética de parálisis consistente.

En realidad, esto es muy importante si desea comparar los resultados obtenidos en su laboratorio en diferentes momentos por diferentes personas, o comparar sus resultados con los de otros investigadores que utilizan este sistema modelo.