Name: Ensayo β-amiloide toxicidad con un transgénico C. elegans Modelo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-09T17:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 59 s
Description: Aprende a medir la toxicidad del péptido β-amiloide en C. elegans mediante un ensayo de parálisis inducido por temperatura. Este modelo permite evaluar rápidamente fármacos y modificaciones genéticas en enfermedades neurodegenerativas.

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Nos gustaría agradecer a los miembros actuales y anteriores del laboratorio de Enlace que ayudó a desarrollar los protocolos descritos aquí, particularmente de Gin Fonte, quien desarrolló el procedimiento original. Este trabajo ha sido apoyado por los premios de la NIH (AG12423) y la Asociación de Alzheimer (Premio Zenith) para CDL

1) Preparación de los nematodos medios de cultivo para el ensayo de placas de la parálisis. Los ensayos se llevan a cabo una parálisis en el estándar de crecimiento de los medios de nematodos (NGM) placas de procedimientos que para C. elegans propagación y la genética (Stiernagle, 2006). <ol><li> Autoclave la solución que contiene NaCl NGM, y Agar peptona en un erlenmeyer y añadir las cantidades adecuadas de estéril de CaCl2, uracilo, colesterol, 1M MgSO4 y 1M KPO 4. Alícuota de 10 ml de líquido en cada NGM 60 mm x 15 mm placa de Petri. Permitir NGM para solidificar la noche a temperatura ambiente. </li><li> Si la prueba de los efectos de los compuestos / extractos, alícuota del extracto en cada plato y el uso de un esparcidor para distribuir uniformemente el extracto sobre la superficie de la placa. Dejar que el extracto seco de la noche a temperatura ambiente. Volúmenes de más de 1 mL requerirá más tiempo para secarse. </li><li> Lugar cada placa con 250 l de E. OP5O coli cepa crecido en medio LB durante la noche para una densidad óptica de 0,4-0,6. Permitir que las bacterias que se seque durante la noche a temperatura ambiente. </li></ol> Variables relevantes La edad de las placas tiene un efecto significativo en el ensayo de la parálisis, como placas más viejas tienden a secarse. Use placas de vertido dentro de una semana de ensayo de la parálisis. Para resultados óptimos, verter en las placas de 3-4 días antes del inicio de las poblaciones de gusanos sincrónico [ver (2) más abajo]. Para cualquier experimento, sólo el uso de placas de vertido del mismo lote. La modificación del tamaño del césped (es decir, visto vs difusión) y / o el tipo de bacteria también modificar el comportamiento de los gusanos. Los ensayos de la parálisis se puede realizar utilizando la alternativa E. coli como fuente de alimento (por ejemplo, la cepa HT115 utilizado en experimentos de alimentación RNAi), pero esto puede cambiar la cinética de la parálisis, por lo que requieren controles internos apropiados. 2) Preparación de las poblaciones de gusanos edad síncrono Cepa CL4176 (SMG-1 (cc546 ts) I; dvIs27 [mio-3 / Aß minigene + rol-6 (su1006) gen marcador] X es más comúnmente utilizado para el ensayo de Aß la parálisis inducida por esta cepa y otros modelos transgénicos están disponibles. a los investigadores académicos por un precio nominal del Centro de Genética Caenorhabditis (http://www.cbs.umn.edu/CGC/). <ol><li> Para maximizar la sincronía edad de la población de prueba, es preferible comenzar con una generación de sincronizar los padres. Una semana antes del inicio de la prueba de la parálisis de la población de prueba, utilice un selector de gusano de platino para la transferencia de 20 a 30 adultos grávidas en varias placas de 10 cm NGM se extendió con OP50 por un huevo de dos horas estaba a 16 ° C (la temperatura permisiva para CL4176 ). Retire los adultos grávidas y permitir que la progenie de crecer durante 7 días, momento en el cual se "segundo día" adultos grávidas. </li><li> (Día 1) Los adultos días grávidas segundos se utilizan para preparar la prueba de las poblaciones de edad sincrónica. Para cada condición experimental el objeto es la generación de placas por triplicado, que contiene 50 a 75 años-sincrónica gusanos. Mediante un selector de gusano de platino, la transferencia de 10 a 12 del día 2 adultos grávidas en 60 mm (10 ml de volumen) NGM placas con manchas OP50. Permitir a los gusanos a poner huevos a los 16 ° C durante 2 horas, y luego escoger de los adultos y permitir que los huevos para incubar y crecer a 16 ° C. En este punto, lo mejor es tener a alguien que no será anotar las placas para el código, por lo que el marcador se ciega a las condiciones experimentales. </li></ol> Variables relevantes La etapa del desarrollo embrionario, cuando los huevos son puestos (~ la etapa de 26 células para los gusanos de tipo salvaje en condiciones óptimas) es una función de la edad adulta y la nutrición. Si los adultos grávidas utilizado para la preparación de la población de prueba son mayores o muerto de hambre, los huevos en una etapa posterior se establecerán, la reducción de la sincronía de la edad de la población y la reproducibilidad de la cinética de la parálisis. Es esencial que los mono-axénicos (es decir, sólo OP50 bacterias) los cultivos se utilizan (los contaminantes microbianos pueden afectar seriamente a este ensayo), y la reproducibilidad es mayor si las placas por triplicado tienen números similares de gusanos. 3) transgénica de inducción y de ensayo Parálisis <ol><li> (Día 3) placas de cambio ascendente a 25 ° C 48 horas después del final del huevo sincrónica laicos, los gusanos deben estar en la tercera etapa larvaria (L3). Las placas deben ser dispuestas sin apilar en una incubadora de 25 ° C para permitir que todas las placas hasta alcanzar los 25 ° C, al mismo tiempo. </li><li> (Día 4) Comience a anotar la paralización de los gusanos (cepa CL4176) a las 18-20 horas después del inicio del cambio ascendente. En este punto, todos los gusanos de la población debería haber llegado a la larva de cuarto (L4) el escenario. Continuar con calificaciones dentro de dos horas hasta que todos los incrementos de los gusanos en cada una de las placas se encuentran paralizados. Por razones desconocidas, la parálisis no es uniforme en toda la longitud del cuerpo: la región de la cabeza es la última parte del gusano dejan de moverse. Por lo tanto, wORM que recientemente han iniciado la parálisis no se puede traducir en la placa, pero se puede mover la cabeza, lo que se allanaba las bacterias en torno a su anterior y dejando un "halo" de las bacterias despejado. Estos gusanos siempre será completamente paralizado, y por lo tanto, los gusanos con halos se clasifican como paralizado. Algunos gusanos no tienen halos, pero tampoco mostrar un movimiento espontáneo, que son probados por pinchar con el selector de gusano. Si un gusano pinchó no pueden someterse a una propagación de onda completa en el cuerpo insistencia, también se anotó como paralizado. Para la puntuación eficiente, es más fácil mover los gusanos paralizados a un sector de la mancha de la placa para que no se involuntariamente rescored el período de puntuación siguiente. (Esto también permite que mal categorizado gusanos para demostrar el movimiento, lo que permite una corrección de puntuación). </li><li> Para generar una curva de la parálisis, en cada momento la fracción de los gusanos en cada plato que no se han paralizado se convierte en un porcentaje, y el promedio "unparalyzed" porcentaje en función del tiempo desde el inicio del cambio ascendente. (La razón para el trazado de esta manera es que la curva resultante es formalmente análoga a una curva de supervivencia, y por lo tanto pueden ser analizados usando estándares estadística no paramétrica de la supervivencia.) </li></ol> Variables relevantes El cambio ascendente de los gusanos transgénicos myo-3/Aβ debe ocurrir antes de que lleguen a la etapa de mediados de L4 para la parálisis que se inició, como el mio-3 es promotor de desarrollo regulado, y ha reducido significativamente su expresión en L4 tarde o gusanos adultos. Del mismo modo, la expresión de este transgén se bloquea si los gusanos se privan, por lo que es esencial que los gusanos están bien alimentados durante todo el experimento. Nunca hemos observado un gusano paralizada a recuperar en cualquier situación, y después de 12-16 horas de cambio ascendente, todos los gusanos CL4176 se paraliza, incluso si son downshifted a 16 ° C. En la cepa CL4176, upregulation suficiente de expresión de los transgenes a causa de la parálisis puede ocurrir a temperaturas más bajas (es decir, 20-25 ° C), aunque el tiempo de parálisis se verá alterada. La tasa de parálisis depende de la cepa específica de transgénicos utilizados (se han construido cepas myo-3/Aβ con tasas más rápido y más lento que CL4176), por lo que con otras cepas de la ventana de puntuación puede ser necesario ajustar. 4) Los resultados representativos Se muestra en la Figura 1 es un gráfico de una curva de la parálisis de CL4176, tanto sin tratar y se expone a 6,27 mM de cafeína (concentración final en la placa de NGM). Este tratamiento da como resultado un retraso estadísticamente significativa en la parálisis de aproximadamente 4 horas, lo que se interpreta como indicativo de la supresión de la toxicidad del Aß en este modelo. Muestra en la Figura 2 es un experimento independiente analizando los efectos de cafestol, otro compuesto que se encuentra en el café. Este gráfico es típico de los tratamientos que no afectan la toxicidad Aß. Tenga en cuenta que en ambos experimentos alrededor de la mitad de la población no tratada CL4176 están paralizadas a las 24 horas, y la parálisis es completa por 28 horas. Estos son los plazos típicos de la parálisis de control CL4176 poblaciones. Desviaciones significativas de este momento son indicativos de alteración de las condiciones ambientales o la eliminación espontánea de copias del transgén. (CL4176 contiene una amplia transgénicos cromosómicamente integrado con varias copias del transgén myo-3/Aβ. A pesar de esta variedad transgénica suele ser bastante estable, la propagación de la deformación a temperaturas&gt; 16 ° C se selecciona para los gusanos raros que han sufrido un eliminación espontánea de los transgenes, resultando en variantes que se han reducido expresión Aß y más lento resultados parálisis). <img src="/files/ftp_upload/2252/2252fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Curva de la parálisis de la cepa CL4176 gusanos tratados o expuestos a la cafeína 6,27 mM (Sigma). Los tiempos indicados son desde el inicio del cambio ascendente de la temperatura. Las barras de error = SEM <img src="/files/ftp_upload/2252/2252fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Curva de la parálisis de CL4176 gusanos expuestos a 0,48 mm cafestol (Sigma). Las barras de error = SEM

<ol><li>Arya, U., Dwivedi, H., Subramaniam, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reserpine+ameliorates+Abeta+toxicity+in+the+Alzheimer%27s+disease+model+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Gerontol%22%5BJournal%5D)">Reserpine ameliorates Abeta toxicity in the Alzheimer's disease model in Caenorhabditis elegans.</a> Exp Gerontol. 44, 462-466 (2009).</li>
<li>Cohen, E., Bieschke, J., Perciavalle, R. M., Kelly, J. W., Dillin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposing+activities+protect+against+age-onset+proteotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Opposing activities protect against age-onset proteotoxicity.</a> Science. 313, 1604-1610 (2006).</li>
<li>Dosanjh, L. E., Brown, M. K., Rao, G., Link, C. D., Luo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+phenotyping+of+a+transgenic+C.+elegans+expressing+neuronal+amyloid-beta%5BTitle%5D)+AND+%22J+Alzheimers+Dis%22%5BJournal%5D)">Behavioral phenotyping of a transgenic C. elegans expressing neuronal amyloid-beta.</a> J Alzheimers Dis. , (2009).</li>
<li>Drake, J., Link, C. D., Butterfield, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+precedes+fibrillar+deposition+of+Alzheimer%27s+disease+amyloid+beta-peptide+%281-42%29+in+a+transgenic+Caenorhabditis+elegans+model%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Aging%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress precedes fibrillar deposition of Alzheimer's disease amyloid beta-peptide (1-42) in a transgenic Caenorhabditis elegans model.</a> Neurobiol Aging. 24, 415-4120 (2003).</li>
<li>Fay, D. S., Fluet, A., Johnson, C. J., Link, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+aggregation+of+beta-amyloid+peptide+variants%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">In vivo aggregation of beta-amyloid peptide variants.</a> J Neurochem. 71, 1616-1625 (1998).</li>
<li>Florez-McClure, M. L., Hohsfield, L. A., Fonte, G., Bealor, M. T., Link, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+insulin-receptor+signaling+promotes+the+autophagic+degradation+of+beta-amyloid+peptide+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Decreased insulin-receptor signaling promotes the autophagic degradation of beta-amyloid peptide in C. elegans.</a> Autophagy. 3, 569-580 (2007).</li>
<li>Fonte, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+in+vivo+beta-amyloid+peptide+toxicity+by+overexpression+of+the+HSP-16.2+small+chaperone+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Suppression of in vivo beta-amyloid peptide toxicity by overexpression of the HSP-16.2 small chaperone protein.</a> J Biol Chem. 283, 784-7891 (2008).</li>
<li>Hassan, W. M., Merin, D. A., Fonte, V., Link, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AIP-1+ameliorates+beta-amyloid+peptide+toxicity+in+a+Caenorhabditis+elegans+Alzheimer%27s+disease+model%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">AIP-1 ameliorates beta-amyloid peptide toxicity in a Caenorhabditis elegans Alzheimer's disease model.</a> Hum Mol Genet. 18, 2739-2747 (2009).</li>
<li>Link, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+human+beta-amyloid+peptide+in+transgenic+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Expression of human beta-amyloid peptide in transgenic Caenorhabditis elegans.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 9368-9372 (1995).</li>
<li>Link, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+analysis+in+a+transgenic+Caenorhabditis+elegans+Alzheimer%27s+disease+model%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Aging%22%5BJournal%5D)">Gene expression analysis in a transgenic Caenorhabditis elegans Alzheimer's disease model.</a> Neurobiol Aging. 24, 397-413 (2003).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1-11 (2006).</li>
<li>Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid-beta-induced+pathological+behaviors+are+suppressed+by+Ginkgo+biloba+extract+EGb+761+and+ginkgolides+in+transgenic+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Amyloid-beta-induced pathological behaviors are suppressed by Ginkgo biloba extract EGb 761 and ginkgolides in transgenic Caenorhabditis elegans.</a> J Neurosci. 26, 13102-13113 (2006).</li>
</ol>

El protocolo que hemos descrito puede ser utilizado con eficacia para analizar los efectos de los compuestos sobre la toxicidad de Aß. Ejemplos publicados incluyen los efectos de los componentes de extracto de Ginkgo biloba (Wu et al. 2006) y la reserpina (Arya et al. 2009). Compuestos que han sido de protección contra la toxicidad del Aß en otros sistemas también han demostrado tener un efecto protector en este modelo (por ejemplo, la memantina, nuestros resultados no publicados). Una razón importante para el establecimiento de este modelo es que las herramientas bien desarrolladas genéticos y moleculares disponibles en C. elegans pueden ser utilizados para investigar los mecanismos de toxicidad de Aß. Por lo tanto, las mutaciones de los efectos específicos sobre la toxicidad de Aß se puede probar (por ejemplo, el efecto de la reducción de la insulina como la señalización mediante la introducción de un daf-2 la pérdida de la función de la mutación, Florez-McClure et al. 2007), y este modelo también se puede se utiliza para examinar los efectos de los transgenes sobre-expresión (Fonte et al. 2008). Recientemente hemos hecho un amplio uso de este modelo para examinar los efectos sobre la toxicidad de una sola sustitución de aminoácido en Aß (datos no publicados). El modelo transgénico se describe aquí el efecto de los ensayos de expresión Aß agudos sobre la función de las células musculares. En el momento de las células musculares y parálisis de sus sarcómeros están intactos, el fenotipo de la parálisis no es el resultado de la muerte de las células musculares. Sin embargo, después de la parálisis (~ 48 horas después del cambio ascendente inicial) se produce una ruptura de la integridad del músculo y la eventual muerte de los gusanos. No hemos investigado el efecto aguas abajo de expresión Aß o lo han utilizado como un marcador de toxicidad. El modelo de expresión inducible Aß se describe aquí no es apropiado para la investigación de tratamientos que modulan la formación de β-amiloide en sí. Aunque los gusanos transgénicos con forma de expresión constitutiva depósitos de amiloide Aß fácilmente detectables (Fay et al, 1998;.. Link et al 2001), los gusanos transgénicos con expresión inducible Aß rara vez tienen los depósitos de amiloide y el fenotipo de la parálisis parece independiente de la deposición de amiloide (Drake et al. 2003). Nuestros resultados son consistentes con la opinión de que la toxicidad aguda inducida por los resultados de Aß expresión de la acumulación de Aß oligómeros solubles, no el depósito de amiloide.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reactivos </td><td> Quantity/2L </td><td> Compañía / Catálogo # </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 6g </td><td> Sigma-Aldrich / S9888 </td><td></td></tr><tr><td> Agar </td><td> 40g </td><td> Sigma-Aldrich / A7002 </td><td></td></tr><tr><td> Peptona </td><td> 5g </td><td> Sigma-Aldrich / P0556 </td><td></td></tr><tr><td> ddH2O </td><td> 2L </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1M CaCl2 </td><td> 2 ml </td><td></td><td> 147.02mg/mL en ddH2O </td></tr><tr><td> Uracilo </td><td> 2 ml </td><td></td><td> 2mg/ml en ddH2O </td></tr><tr><td> Colesterol </td><td> 2 ml </td><td></td><td> 5mg/mL en etanol (no autoclave) </td></tr><tr><td> 1M MgSO4 </td><td> 2 ml </td><td></td><td> 246.5mg/mL en ddH2O </td></tr><tr><td> 1M KPO 4 </td><td> 50 ml </td><td></td><td> 98mg KH 2 PO 4. ML, 48mg K2HPO4/mL en ddH2O, pH </td></tr><tr><td> Erlenmeyer </td><td></td><td> VWR </td><td></td></tr></tbody></table>

ensayo β-amiloide toxicidad con un transgénico c. elegans modelo

Assaying &beta;-amyloid Toxicity using a Transgenic C. elegans Model

La acumulación del péptido β-amiloide (Aß) que generalmente se cree que ser central en la inducción de la enfermedad de Alzheimer, pero el mecanismo correspondiente (s) de toxicidad aún no están claros. Aß también se deposita por vía intramuscular en miositis cuerpos de inclusión, una miopatía grave en el hombre. El estudió intensamente nematodo Caenorhabditis elegans gusano puede ser transgénica para expresar Aß humanos. Dependiendo del tejido o momento de la expresión Aß, gusanos transgénicos pueden tener fenotipos fácilmente mensurables que sirven como una lectura de la toxicidad del Aß. Por ejemplo, los gusanos transgénicos con expresión Aß pan-neuronal tienen defectos es el aprendizaje asociativo (Dosanjh y otros, 2009.), Mientras que los gusanos transgénicos con los músculos específicos de expresión constitutiva muestran un progresivo, dependiente de la edad fenotipo parálisis (Link, 1995; Cohen et al . 2006). Uno particularmente útil C. elegans modelo emplea una mutación sensible a la temperatura en el sistema de vigilancia de ARNm para el ingeniero de la temperatura muscular de expresión inducible de un transgén Aß, lo que resulta en un fenotipo parálisis reproducible en cambio ascendente de la temperatura (Link et al. 2003). Tratamientos que la toxicidad contra Aß en este modelo [por ejemplo, la expresión de un transgén de protección (Hassan et al. 2009) o la exposición a los extractos de Ginkgo biloba (Wu et al. 2006)] reproducible alterar la tasa de parálisis muscular causada por cambios ascendentes temperaturas de estos transgénicos gusanos. A continuación se describe el protocolo para la medición de la tasa de parálisis en el C. transgénicos modelo elegans, con especial atención a las variables experimentales que pueden influir en esta medición.

El nematodo estudiado intensamente gusano<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Puede ser transgénica para expresar lo humano β-amiloide (Aß). Indujo la expresión de Aß en<em&gt; C. elegans</emMuscular&gt; conduce a un fenotipo rápido, parálisis reproducible que puede ser usado para monitorear los tratamientos que modulan la toxicidad de Aß.

Ensayo β-amiloide toxicidad con un transgénico C. elegans Modelo

Se cree generalmente que la acumulación del péptido $\beta$-amiloide (A$\beta$) es fundamental para la inducción de la enfermedad de Alzheimer, pero los...

El objetivo general del siguiente experimento es evaluar la toxicidad del péptido beta amiloide en un sistema modelo InVivo. La reproducibilidad y la relativa simplicidad de este ensayo permiten la prueba rápida de fármacos, condiciones ambientales o modificaciones genéticas sobre la toxicidad del beta amiloide. Un factor clave en el desarrollo de este ensayo es la generación de gusanos transgénicos de cl egan's con expresión inducible por temperatura específica en el músculo del péptido beta amiloide.Esta expresión sensible a la temperatura se diseña mediante la construcción de un transgén que contiene una región no traducida tres prima anormalmente larga, haciendo que el ARNm del transgén sea un objetivo del sistema de vigilancia de ARNm. La expresión de este transgén es por lo tanto deficiente en gusanos silvestres con un sistema de vigilancia de ARNm funcional, debido a la degradación del ARNm del transgén. Si este transgén se introduce en un fondo genético que contiene una mutación en un componente esencial del sistema de vigilancia de ARNm, la expresión del transgén será significativamente mayor. Si el fondo genético contiene una mutación sensible a la temperatura en el sistema de vigilancia de ARNm, entonces el cultivo de esta cepa transgénica a la temperatura no permisiva bloqueará la degradación del ARNm del transgén y dará como resultado una alta expresión del transgén. Los gusanos transgénicos que emplean este sistema para regular la expresión en el músculo de la pared corporal del péptido beta amiloide, al aumentar la temperatura de 16 grados Celsius a 25 grados Celsius, presentan una alta acumulación del péptido beta amiloide, disfunción de las células musculares y parálisis de los gusanos. Medición del tiempo.Se requiere una población de estos gusanos trenchgénicos para que se paralicen tras el aumento de temperatura. La prueba de sensibilidad al incremento térmico es un ensayo sensible para la toxicidad de beta amiloide. Esto se logra preparando placas frescas de medio de crecimiento para nematodos destinadas al ensayo de parálisis, lo cual ayuda a minimizar las variables ambientales que podrían influir en las tasas de parálisis.Como segundo paso, se utilizan poblaciones de gusanos transgénicos sincronizadas por edad, lo que minimiza los efectos del estadio de desarrollo sobre la expresión del transgén. A continuación, los estadios larvales tercero sincronizados se transfieren de 16 grados Celsius a 25 grados Celsius, aumentando así la estabilidad del ARNm del transgén y provocando la acumulación del péptido beta amiloide. Medir el tiempo desde el cambio de temperatura hasta la parálisis de cada gusano permite captar la tasa de disfunción muscular, evaluando de este modo los efectos tóxicos de la acumulación del péptido beta amiloide; los resultados obtenidos muestran el efecto de tratamientos específicos sobre la toxicidad del péptido beta amiloide expresado endógenamente.Por lo tanto, la principal ventaja de nuestra técnica, en comparación con el uso de modelos de ratones transgénicos para evaluar la actividad de fármacos, es que podemos realizarla mucho más rápidamente y a un costo mucho menor. La demostración visual de este método es fundamental. La calificación de gusanos L4 en un ensayo de parálisis es muy difícil de aprender.Por lo tanto, cuando se evalúa un gusano paralizado en L4, lo que debe observarse es el movimiento aislado en halo de la región cefálica del gusano. Una vez que esta zona se mueve y todo el cuerpo del gusano está paralizado, se considerará que el gusano está paralizado. Los ensayos de parálisis se realizan en placas con medio estándar de crecimiento para nematodos o NGM, comúnmente utilizados para la propagación y estudios genéticos de C. elegans.Para preparar las placas, autoclavar la solución de NGM que contiene cloruro de sodio, agar y péptido en un matraz erlenmeyer, luego añadir las cantidades adecuadas de las siguientes soluciones estériles que se encuentran en el protocolo escrito adjunto. Aliquotar 10 mililitros de NGM líquido en cada placa de Petri de 60 milímetros por 15 milímetros. Dejar solidificar el NGM durante la noche a temperatura ambiente.Si se prueban los efectos de compuestos o extractos, alícuote el extracto en cada placa y utilice un espátula para distribuirlo uniformemente sobre la superficie de la placa. Deje las placas secar durante la noche a temperatura ambiente. Los volúmenes superiores a un mililitro requerirán más tiempo para secarse.A continuación, coloque en cada placa 250 microlitros de la cepa de E. coli OP50 cultivada en medio LB durante la noche hasta una densidad óptica de 0,4 a 0,6, y deje secar las bacterias durante la noche a temperatura ambiente. La edad de la placa tiene un efecto significativo en la tasa de parálisis, y las placas más antiguas tienden a deshidratarse. Las placas deben prepararse no más de una semana antes del ensayo de parálisis.Idealmente, se deben usar placas que hayan sido preparadas de tres a cuatro días antes. Las placas con huevos sincronizados utilizadas en cualquier experimento deben provenir todas del mismo lote. Modificar el tamaño del césped bacteriano y/o la cepa bacteriana también alterará el comportamiento de los gusanos. Los ensayos de parálisis pueden realizarse utilizando cepas alternativas de E. coli. Por ejemplo, HT115 se utiliza en experimentos de RNAi. Sin embargo, esto podría modificar la cinética del ensayo de parálisis.Por lo tanto, debe utilizar controles internos que sean cepas adecuadas. CL 476 es la más utilizada comúnmente para ensayar una parálisis inducida por beta. Esta cepa y otros modelos transgénicos están disponibles para investigadores académicos por una tarifa nominal en el Centro Genético Saint Ahadi.Para maximizar la sincronía de edad de la población de prueba, es preferible comenzar con una generación parental sincronizada. Una semana antes de iniciar el ensayo de parálisis de la población de prueba, utilice un aplicador de lombrices de platino para transferir de 20 a 30 adultos jóvenes a varias placas de NGM de 10 centímetros.Extender con OP 50 para un periodo de puesta de huevos de dos horas a 16 grados Celsius, que es la temperatura permisiva para CL 4 1 76. Retirar los adultos GR y permitir que la descendencia crezca durante siete días, tiempo en el cual alcanzarán la etapa de adultos de segundo día. Segundo día de gravedad.Los adultos se utilizan para preparar poblaciones de prueba sincronizadas por edad para cada condición experimental. El objetivo es generar placas por triplicado que contengan entre 50 y 75 gusanos sincronizados por edad, utilizando un aplicador de gusanos de platino. Transfiera 10 a 12 adultos de dos días de edad a placas NGM de 60 milímetros con manchas de OP50. Deje que los gusanos depositen huevos a 16 grados Celsius durante dos horas, luego retire los adultos y permita que los huevos eclosionen y crezcan a 16 grados Celsius.En este momento, lo mejor es que una persona que no vaya a puntuar las placas las codifique, de modo que la evaluación sea ciega respecto a las condiciones experimentales. La fase del desarrollo embrionario en la que se ponen los huevos, que es aproximadamente la fase de 26 células para gusanos de tipo salvaje en condiciones óptimas, depende de la edad y la nutrición de los adultos. Si los adultos de gravedad utilizados para la puesta de huevos son más viejos o están privados de alimento, se pondrán huevos en fases más avanzadas y no se logrará una población sincrónica, lo que afectará la cinética del ensayo de parálisis.Es esencial utilizar cultivos bacterianos monogénicos como e coli, OP 50, ya que cualquier contaminación bacteriana puede afectar gravemente este ensayo. La reproducibilidad es mayor si sus placas triplicadas tienen un número similar de gusanos para inducir el transgén y llevar a cabo el ensayo de parálisis. Eleve las placas a 25 grados Celsius.48 horas después del final de la puesta sincrónica de huevos, los gusanos deben estar en la tercera etapa larval. Las placas deben colocarse sin apilar en un incubador a 25 grados Celsius para permitir que alcancen esta temperatura. Al mismo tiempo, comience a evaluar la parálisis de los gusanos entre 18 y 20 horas después de que se haya iniciado el aumento de temperatura.En este momento, todos los gusanos de la población deberían haber alcanzado la cuarta etapa larval; continúe evaluando en incrementos de dos horas hasta que todos los gusanos en cada placa estén paralizados. Por razones desconocidas, la parálisis no es uniforme a lo largo de la longitud del cuerpo. La región cefálica es la última parte del gusano en dejar de moverse.Por lo tanto, los gusanos que han iniciado recientemente la parálisis no pueden desplazarse a través de la placa, pero pueden mover sus cabezas, despejando así las bacterias alrededor de su extremo anterior y dejando un halo de bacterias eliminadas. Estos gusanos inevitablemente se paralizarán por completo y, por lo tanto, los gusanos con halos se clasifican como paralizados. Algunos gusanos no tendrán halos, pero tampoco mostrarán movimiento espontáneo.Estos se prueban presionándolos con el recolector de gusanos. Si un gusano presionado no puede realizar la propagación completa de ondas corporales tras la presión, también se califica como paralizado para facilitar la puntuación. Es más sencillo mover los gusanos paralizados a un sector sin manchas del plato para que no sean recalificados accidentalmente en el siguiente período de puntuación.Esto también permite que los gusanos mal clasificados muestren movimiento, lo que posibilita una corrección en la puntuación para generar una curva de parálisis. En cada punto temporal, la fracción de gusanos en cada placa que no han sido paralizados se convierte en un porcentaje, y el porcentaje promedio no paralizado se grafica frente al tiempo a partir del momento en que se inició el cambio de temperatura. La curva resultante es formalmente análoga a una curva de supervivencia y, por lo tanto, puede analizarse utilizando estadísticas estándar no paramétricas de supervivencia.El cambio a temperatura elevada de los gusanos transgénicos myo tres A beta debe realizarse a mediados del estadio L cuatro para que se inicie la parálisis. El promotor Myo tres está regulado durante el desarrollo. Una vez que los gusanos han alcanzado el estadio L cuatro tardío o la edad adulta, el nivel de expresión ha disminuido significativamente.La expresión del transgénico se bloquea si los gusanos se privan de alimento, por lo que es muy esencial que los gusanos estén bien alimentados durante todo el experimento. Nunca hemos observado que un gusano paralizado se recupere bajo ninguna condición. Después de 12 a 16 horas de aumento de temperatura, CL 41 76 quedará paralizado, independientemente de si se reduce la temperatura a 16 grados; en la cepa CL 41 76, la sobreexpresión de la expresión del transgénico que causa la parálisis puede ocurrir a temperaturas más bajas.Sin embargo, tenga en cuenta que la tasa de parálisis se verá afectada en cuanto a su momento. La tasa de parálisis depende de la cepa transgénica específica utilizada. Hemos construido tres cepas de myo A beta que presentan una tasa de parálisis más rápida y más lenta que la CL 41 76, y por lo tanto, debe ajustar su ventana de puntuación para el ensayo de parálisis en consecuencia.Se muestra aquí un gráfico de una curva de parálisis para CL 4 1 76, tanto sin tratar como expuesto a cafeína 6,27 milimolar. Este tratamiento provoca un retraso altamente significativo desde el punto de vista estadístico en la parálisis de aproximadamente cuatro horas, lo que interpretamos como indicativo de una supresión de la toxicidad beta. En este modelo, este experimento evaluó los efectos de ol, otro compuesto presente en el café.El gráfico es típico para tratamientos que no afectan la toxicidad beta. Obsérvese que en ambos experimentos, aproximadamente la mitad de las poblaciones no tratadas de CL 4 1 76 están paralizadas a las 24 horas y la parálisis es completa a las 28 horas. Estos son los plazos típicos para la parálisis del control.Las poblaciones CL 4 1 7 6 presentan desviaciones significativas respecto a este momento, lo que indica condiciones ambientales alteradas o la eliminación espontánea de copias del transgén. Consulte el protocolo adjunto para obtener información adicional sobre la cepa CL 4 1 76. Al realizar este procedimiento, es importante tener en cuenta la edad de las placas, el estadio de la población de gusanos y la capacidad de cuantificar la tasa de parálisis de los gusanos.Después de ver este video, debería tener una buena idea de cómo utilizar este sistema de gusanos marinos para evaluar cuidadosamente la toxicidad de beta amiloide. Debería ser capaz de detectar efectos bastante sutiles sobre esta toxicidad provocados por diversos tratamientos ambientales o farmacológicos. Las variables que hemos mencionado son importantes para tenerlas en cuenta, ya que le permitirán realizar el ensayo de manera muy reproducible y con una cinética de parálisis consistente.Esto es realmente muy importante si desea comparar sus resultados obtenidos en su laboratorio en diferentes momentos y por diferentes personas, o si desea comparar sus resultados con los de otros investigadores que utilizan este sistema de modelo.

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