Uso de Caenorhabditis elegans como sistema modelo para estudiar la homeostasis de proteínas en un organismo multicelular

El objetivo general de los siguientes experimentos en el metazoo genéticamente tratable CENO R elegance es monitorear el mal plegamiento de proteínas en tres niveles, el organismo, las células y las proteínas. Los fenotipos conductuales, como la motilidad o la termorresistencia, funcionan como lecturas de los cambios en la homeostasis de las proteínas a nivel del organismo, sensibles a la temperatura o que ocurren de forma natural. Las proteínas meta estables se utilizan para seguir la localización de las proteínas, que puede estar asociada con el mal plegamiento de las proteínas.

Un ensayo de digestión parcial ex vivo monitorea directamente la estabilidad de las proteínas. Los resultados pueden mostrar cambios en la capacidad de proteostasis a diferentes temperaturas de cultivo en función del ensayo de termorresistencia, la microscopía de inmunofluorescencia y el análisis de sangre occidental. Estos procedimientos serán demostrados por estudiantes de posgrado en mi laboratorio.

El ensayo conductual será demostrado por ish ido y Shai demostrará la tinción inmunológica y el fallo de ANA y sheron demostrará la digestión parcial. Este protocolo para medir la tolerancia a la temperatura va acompañado de pasos preparatorios para la sincronización de los animales y un ensayo de movimiento. Ambos se describen en el protocolo de texto, comenzando por la recolección de réplicas que contienen al menos 20 animales sincronizados.

En 24 pozos bien explotados que contienen 450 microlitros de tampón de choque térmico. Suplementar cada pocillo con nueve microlitros de citoxina. Ahora transfiera el plato a un baño caliente.

El choque térmico, la temperatura y la duración dependen en gran medida de las condiciones de crecimiento. En particular, la temperatura de cultivo marca la supervivencia del animal mediante el seguimiento de su absorción de dados. Usando un estereoscopio fluorescente con un filtro TXR, los animales que toman el dado están muertos.

La principal ventaja de esta técnica de métodos existentes como el kine, la tolerancia por puntuación manual es el uso de la lectura visual de la mortalidad de los animales, lo que hace que este ensayo sea mucho más rápido y reproducible. En la etapa requerida, transfiera al menos 30 animales a un tubo de microcentrífuga que contenga tampón M nueve. Lave a los animales varias veces con M nine realizando pasos de centrifugación cortos y de baja velocidad y Resus suspendiéndolos en M nine.

A continuación, coloque los tubos en hielo durante unos minutos para que se enfríen. Una vez enfriado, retira el exceso de líquido e incuba los tubos. En 500 microlitros de aldehído helado, 4%PARAFORM aldehído.

El tiempo de incubación debe calibrarse para cada proteína examinada y debe ser de alrededor de cinco a 30 minutos a temperatura ambiente. Ahora, lavar los animales fijos tres veces con PBS tween a pH 7.2 por centrifugación. Las centrifugaciones siempre se realizan a 3000 RPM durante uno o dos minutos, a menos que se especifique lo contrario.

En la campana, retire la mayor parte del sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en un mililitro de solución de mercaptoetanol en barra. A continuación, incubar los animales a 37 grados centígrados durante la noche con un suave balanceo al día siguiente en la campana. Lavar a los animales tres veces con PBST por centrifugación y Resus.

Termine el lavado con 50 a 100 microlitros de PBST y elimine la mayor parte de este PBST después de otra centrifugación. A continuación, agregue de 100 a 150 microlitros de solución de colagenasa e incube a los animales a 37 grados centígrados con una fuerte agitación. Utilice una batidora térmica o una incubadora agitadora.

Después de cinco minutos, comience a realizar controles periódicos bajo un microscopio estereoscópico. Cuando una quinta parte de los animales estén rotos, detenga la reacción colocando el tubo sobre hielo. Este paso es muy sensible.

La duración del tratamiento depende de las condiciones de fijación y puede variar ampliamente entre cepas. Una incubación prolongada podría resultar en la degradación completa de los animales. Las condiciones deben calibrarse antes de cada lote de enzimas y la degradación debe controlarse cuidadosamente.

A continuación, lave a los animales dos veces en PBST. Recoja los animales por centrifugación y elimine la mayor parte del PBST. Luego agregue un mililitro de una solución de BA seguida de incubación con balanceo suave durante una hora a temperatura ambiente, recoja los animales por centrifugación y resuspenda en 200 microlitros de una solución de b, A. Ahora agregue el anticuerpo primario y comience una incubación durante la noche con un balanceo suave a temperatura ambiente.

Estos parámetros necesitan ser calibrados. A continuación, lavar a los animales por centrifugación. Vuelva a suspenderlos en un mililitro de a b, A e incubarlos con una mezcla suave durante 15 minutos a una hora a temperatura ambiente.

En este punto, se puede agregar una adición opcional de tinte fluorescente. A continuación, repita el lavado con tampón BA tres veces más y finalice los lavados con Resus suspendiendo en 100 microlitros de BA con el anticuerpo secundario marcado con fluorescencia adecuado en una dilución de uno a 100. Incubar las muestras meciéndolas durante varias horas a temperatura ambiente, protegidas de la luz para despejar las secundarias.

Realice tres lavados con a, b, a. A continuación, monte los animales en portaobjetos con Resus primero, suspendiéndolos en 10 microlitros de a b, a, y luego utilizando una pipeta de diámetro ancho para transferir uno o dos microlitros de la muestra a cada portaobjetos, añada un volumen igual de medio de montaje y cubra el portaobjetos. Sella suavemente el portaobjetos con esmalte de uñas.

Los portaobjetos se pueden almacenar a menos 20 grados centígrados durante períodos prolongados. Por lo general, las personas nuevas en este protocolo tendrán dificultades porque el protocolo es largo e incluye muchos pasos que pueden afectar su eficiencia, lo que dificulta la resolución de problemas. Comience recogiendo los animales de placas de unos 1560 milímetros en uno o dos mililitros de tampón M nine.

Los animales no deben estar hacinados. Lavar los animales unas cuantas veces con tampón M nine centrifugando y resus suspendiendo a los animales. Después del centrifugado final, resus suspende a los animales en 100 microlitros de tampón M nueve.

A continuación, congele rápidamente los animales y, con un mortero y un taladro refrigerados, muela la muestra mientras está en hielo. Se detiene con frecuencia para comprobar si los animales están suficientemente molidos. Una vez que los animales estén completamente triturados, estime el volumen del extracto de lombriz.

A continuación, añada un volumen igual de dos x solución de lisis de lombriz e incube la muestra en hielo durante 15 minutos. A continuación, elimine los residuos mediante un ciclo de centrifugación enfriado y transfiera el sobrenadante a un tubo de microfuga limpio. Después de un ensayo de Bradford, diluya la muestra a tres a 3,5 miligramos de proteína por mililitro.

Luego agregue una solución fría de tripsina de camuflaje recién preparada en una proporción de uno a 1200. En este punto, configure la muestra para incubar durante una hora. Durante la incubación, tome periódicamente 20 alícuotas de microlitros y mézclelas inmediatamente con tampón SDS, seguido de cinco minutos a 96 grados centígrados.

Ejecute las muestras y siga con un análisis de sangre occidental para determinar la estabilidad relativa de la proteína. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que no debe agregar un cóctel de inhibidores de proteasa a la muestra de digestión y, en cambio, mantendremos las muestras en hielo rápidamente. La mutación E 781 K ts en la chaperona muscular en 45 afecta fuertemente el plegamiento y ensamblaje de la miosina y, por lo tanto, afecta la motilidad animal.

Cuando estos mutantes crecieron a temperaturas superiores a los 20 grados centígrados, quedaron completamente paralizados, pero no a 15 grados centígrados. Cuando los animales de tipo salvaje criados a 25 grados centígrados fueron sometidos a un choque térmico prolongado, la mayoría sobrevivió. Mientras que solo el 30% sobrevivió si se elevó a 15 a 20 grados Celsius para monitorear los modificadores efectivos en la respuesta al choque térmico, las condiciones de estrés de control se elevaron a una tasa de supervivencia del 70% para los animales de tipo salvaje.

Los animales fueron expuestos a un choque térmico de 37 grados centígrados durante seis horas. En el primer día de la edad adulta, la supervivencia se ensayó mediante el ensayo de absorción de naranja cyt. Los animales muertos se indican con flechas blancas y los animales vivos con flechas amarillas.

La localización de varias proteínas metaestables se visualizó utilizando anticuerpos específicos. Por ejemplo, los parámetros se localizan en conjuntos policristalinos en lugar de en sarcómeros musculares en condiciones restrictivas. Del mismo modo, la miosina TS forma filamentos desorganizados en lugar de las estructuras filamentosas altamente ordenadas a la temperatura restrictiva.

Animales que expresan varias proteínas mutantes TS coexpresadas con miotres. La GFP mostró un rápido deterioro en la organización del miofilamento, como se detectó mediante el seguimiento de la GFP, los cambios en la miosina confirmaron que pueden reflejar cambios en la capacidad de plegamiento de las células musculares. El patrón de fragmentación proteolítica de la cadena pesada de miosina, coexpresado con UNC 45 Ts, muestra características distintas en comparación con el perfil de digestión de la miosina de animales salvajes, lo que respalda la afirmación de que el plegamiento de la miosina se ve afectado por UNC 45.

Pérdida de la función. Aunque este método puede proporcionar información sobre la regulación de la proteostasis en la elegancia marina, también se puede aplicar en otros sistemas, como diferentes organismos modelo.