Name: Uso de Caenorhabditis elegans como sistema modelo para estudiar la homeostasis de proteínas en un organismo multicelular (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-18T14:15:00.000+00:00
Duration: 12 min 38 s
Description: Aprende a estudiar la homeostasis de proteínas en Caenorhabditis elegus mediante ensayos de termorresistencia, inmunofluorescencia y digestión parcial ex vivo. Este método permite analizar el plegamiento proteico a nivel orgánico, celular y molecular.

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Todas las cepas de nematodos utilizadas en este trabajo fueron proporcionadas por el Centro de Genética de Caenorhabditis, que está financiado por el Centro Nacional de Recursos de Investigación (NCRR) de los NIH. Los anticuerpos monoclonales desarrollados por H.F. Epstein se obtuvieron del Banco de Hibridomas de Estudios del Desarrollo desarrollado bajo los auspicios del NICHD y mantenido por el Departamento de Biología de la Universidad de Iowa. N. Shemesh contó con el apoyo del premio Fay y Bert Harbour. A.B.-Z. contó con el apoyo de una beca Alon del Consejo Israelí para la Educación Superior, una beca Marie Curie para la Reintegración Internacional y subvenciones de la Fundación Binacional de Ciencias y la Fundación Israelí de Ciencias (Subvención Nº 91/11).

Uso de ensayos de comportamiento para monitorear el plegamiento de proteínas en un organismo vivo
1. Sincronización de animales para ensayos de comportamiento
<ol>
	<li>Siga los métodos estándar para el mantenimiento de C. elegans36, incluida la preparación de medios y placas, la preparación de alimentos y las condiciones de crecimiento del animal. Controle cuidadosamente las condiciones de cultivo, incluida la temperatura (15-25 °C), el tamaño de la población y la disponibilidad de alimentos. Deseche cualquier placa que muestre contaminación bacteriana o fúngica.</li>
	<li>Elija de 15 a 30 embriones, transfiéralos a nuevas placas y crezca a la temperatura deseada (15-25 °C) durante la duración del experimento. Alternativamente, coloque de 10 a 20 adultos grávidos en un plato, déjelos poner huevos durante 30 a 60 minutos y luego retírelos del plato. Tanto la selección directa de los embriones como la formación de adultos grávidos darán cierta variabilidad en la edad (±6 horas). Para reducir esta variabilidad, elija embriones en una etapa específica, por ejemplo, en etapa de coma, o establezca de 10 a 20 adultos que recién comienzan a poner huevos (día 2 de la edad adulta). Evite la sincronización por blanqueo siempre que sea posible, dado que este tratamiento es estresante y puede afectar a la proteostasis.</li>
	<li>Elija los animales sincronizados, transfiéralos a una placa de ensayo para marcarlos y luego deséchelos.</li>
</ol>
2. Ensayo de movimiento
Elija los animales sincronizados y transfiéralos a una placa limpia a la temperatura deseada para la puntuación de movimiento (15-25 °C). Para cada réplica biológica, marque >20 animales y repita el ensayo al menos 3 veces por condición experimental. Utilice la prueba de suma de rangos de Wilcoxon Mann-Whitney para comparar dos condiciones experimentales independientes.
<ol>
	<li>Para determinar si hay un deterioro leve del movimiento, coloque de 5 a 7 animales juntos en el centro de un césped bacteriano limpio y permita que los animales se muevan en el plato durante 2 minutos. Este intervalo de tiempo se determinó en función del tiempo que tardó el 90% de los animales de tipo salvaje en despejar un círculo de 1 cm.</li>
	<li>Cuente el número de animales que no superaron un círculo de 1 cm (por ejemplo, que permanecieron dentro de un radio de 1 cm desde el punto en el que se colocaron) dentro de 2 minutos como descoordinados.</li>
	<li>Para determinar si hay un deterioro grave del movimiento, coloque a los animales en un césped bacteriano limpio.</li>
	<li>Fotografíe varios animales en el tiempo cero (t=0) y de nuevo 5 min más tarde (t=5). Puntúe a los animales que no se movieron una longitud del cuerpo después de 5 minutos como paralizados.</li>
</ol>
3. Termorresistencia
<ol>
	<li>Elija >20 animales sincronizados y transfiéralos a una placa de 24 pocillos que contenga 450 μl de tampón de choque térmico (HS) (Tabla 1). Para cada réplica biológica, marque >20 animales y repita el ensayo al menos 4 veces por condición experimental.</li>
	<li>Transfiera la placa de 24 pocillos a un baño caliente. La temperatura y la duración del HS dependen en gran medida de las condiciones de crecimiento, en particular, de la temperatura de cultivo.</li>
	<li>Complemente el tampón HS con 9 μl de naranja SYTOX.</li>
	<li>Evalúe la supervivencia de los animales mediante el control de la absorción de colorantes, utilizando un estereoscopio fluorescente con un filtro TXR. Los animales que absorbieron el tinte están muertos. Utilice la prueba de suma de rangos de Wilcoxon Mann-Whitney para comparar dos condiciones experimentales independientes.</li>
</ol>
Uso de inmunotinción y proteínas marcadas para monitorear el plegamiento de proteínas en células específicas
4. Monitorizar la localización de proteínas mediante inmunotinción
<ol>
	<li>En la etapa requerida, transfiera al menos 30 animales a un tubo Eppendorf que contenga tampón M936.</li>
	<li>Lave a los animales varias veces con tampón M9 realizando un paso de centrifugación corto a baja velocidad (3.000 rpm/900 x g, 2 min) y resuspendiéndolos.</li>
	<li>Coloque los tubos sobre hielo durante unos minutos para que se enfríen.</li>
	<li>Retire el exceso de líquido e incube con 500 μl de solución helada de paraformaldehído al 4% (Tabla 2). El tiempo de incubación debe calibrarse para cada proteína examinada y debe ser de alrededor de 5-30 minutos a temperatura ambiente. También se puede realizar una incubación prolongada a 4 °C, pero esto puede afectar la permeabilización de la muestra.</li>
	<li>Lavar animales fijos 3 veces con tampón PBS-Tween (pH 7,2) por centrifugación (3.000 rpm, 1-2 min). Los animales pueden almacenarse en esta etapa a 4 °C durante algunas semanas.</li>
	<li>Recoger los animales por centrifugación (3.000 rpm, 1-2 min).</li>
	<li>En la campana, retire la mayor parte del sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 1 ml de solución de β-mercaptoetanol (β-ME) (Tabla 2).</li>
	<li>Incubar a 37 °C durante la noche con un suave balanceo en un nutator.</li>
	<li>En la capucha, lave a los animales 3 veces con tampón PBS-Tween (pH 7,2).</li>
	<li>Vuelva a suspender los animales en 50-100 μl de PBS-Tween (pH 7,2). Los animales pueden almacenarse en esta etapa a 4 °C durante algunas semanas.</li>
	<li>Recoja los animales por centrifugación (3.000 rpm, 1-2 min) y elimine la mayor parte del tampón PBS-Tween.</li>
	<li>Añadir 100-150 μl de solución de colagenasa a cada tubo e incubar a 37 °C con una fuerte agitación (utilizando un termomezclador o una incubadora agitadora).</li>
	<li>Examine a los animales frecuentemente bajo un microscopio estereoscópico, comenzando después de 5 minutos de incubación. Cuando el 20% de los animales estén rotos, detenga la reacción colocando el tubo sobre hielo. ¡Este paso es muy sensible! La duración del tratamiento depende de las condiciones de fijación y puede variar ampliamente entre cepas. Una incubación prolongada podría resultar en la degradación completa de los animales. Las condiciones deben calibrarse para cada lote de enzimas utilizado y la degradación debe controlarse cuidadosamente.</li>
	<li>Lave a los animales dos veces en PBS-Tween (pH 7.2) y luego recoja los animales por centrifugación (3,000 rpm, 1-2 min) y elimine la mayor parte del tampón PBS-Tween.</li>
	<li>Añadir 1 ml de solución de AbA (Tabla 2) e incubar con un suave balanceo durante 1 hora a temperatura ambiente. Los animales pueden almacenarse en esta etapa a 4 °C durante algunas semanas.</li>
	<li>Recoger los animales por centrifugación (3.000 rpm, 1-2 min) y resuspender en 200 μl de AbA.</li>
	<li>Agregue el anticuerpo primario diluido a 1:100-1:1,000 en solución de AbA e incube con un balanceo suave. La temperatura y la duración de la incubación pueden variar entre los anticuerpos y deben calibrarse para cada proteína examinada. Comenzamos con una incubación nocturna a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavar a los animales por centrifugación (3.000 rpm, 1-2 min).</li>
	<li>Añadir tampón AbA (1 ml) e incubar mezclando suavemente durante 15-60 min a temperatura ambiente. Los animales pueden almacenarse en esta etapa a 4 °C durante algunas semanas.</li>
	<li>Opcional: La muestra también se puede teñir con tintes fluorescentes. Para ello, añada el colorante (por ejemplo, DAPI (2 mg/ml) o Phalloidin (1:100)) a 200 μl de AbA e incube con un suave balanceo durante un máximo de 1 hora. Este paso se puede realizar durante uno de los pasos para lavar el anticuerpo secundario.</li>
	<li>Lave a los animales 3 veces repitiendo los pasos 4.18-4.19.</li>
	<li>Añadir 100 μl de AbA con el anticuerpo secundario adecuado marcado con fluorescencia, diluido 1:100.</li>
	<li>Mantenga las muestras cubiertas (o en un tubo oscuro) e incube con balanceo durante varias horas a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavar a los animales 3 veces incubándolos en tampón AbA (1 ml) con una mezcla suave durante 15-60 min a temperatura ambiente seguido de centrifugación (3.000 rpm, 1-2 min). Los animales pueden almacenarse en esta etapa a 4 °C durante algunas semanas.</li>
	<li>Para montar animales en portaobjetos, retire todo el líquido y vuelva a suspender en 10 μl del mismo tampón.</li>
	<li>Corte el extremo de la punta de la pipeta para evitar el corte de los animales y transfiera 1-2 μl de la muestra a un portaobjetos.</li>
	<li>Agregue medio de montaje en una proporción de 1:1.</li>
	<li>Cubra el portaobjetos suavemente con un cubreobjetos y séllelo con esmalte de uñas. Si el portaobjetos no se supervisa inmediatamente, los portaobjetos pueden almacenarse a -20 °C durante un período prolongado de tiempo.</li>
</ol>
5. Monitorizar la localización de proteínas marcadas
<ol>
	<li>En la etapa requerida, recoja al menos 15 animales en una gota de 10 ml de tampón M9 en un portaobjetos.</li>
	<li>Con un "palillo de gusano", mueva a los animales a una gota de 10 ml de solución de paraformaldehído (4%) (Tabla 2) y espere hasta que todos los animales dejen de moverse (aproximadamente 5 min).</li>
	<li>Con un "palillo de gusano", coloque a los animales en una gota de 2 ml de tampón M9 y medio de montaje (1:1) (Tabla 2).</li>
	<li>Cubra suavemente a los animales con un cubreobjetos y séllelos con esmalte de uñas.</li>
</ol>
Uso de ensayos ex vivo para monitorizar el plegamiento y la estabilidad de las proteínas
6. Digestión parcial
<ol>
	<li>Lave los animales de 15 platos (60 mm) con 1-2 ml de tampón M9 en un tubo de microfuga. Tenga en cuenta que los animales no deben estar abarrotados y que debe haber suficiente comida disponible durante todo el experimento.</li>
	<li>Lavar los animales unas cuantas veces con tampón M9 centrifugando (3.000 rpm, 2 min) y resuspendiendo los animales.</li>
	<li>Después del centrifugado final, vuelva a suspender a los animales en tampón M9 de 100 μl.</li>
	<li>Congelación instantánea en líquido N2. Las muestras se pueden almacenar a -80 °C.</li>
	<li>Usando un mortero refrigerado y un taladro motorizado (también se puede usar un taladro de cultivo de tejidos manual), muela la muestra. Mantenga la muestra en hielo y evite el sobrecalentamiento.</li>
	<li>Examine a los animales con frecuencia bajo un microscopio estereoscópico para determinar si la molienda está completa. Si quedan animales intactos, repita el procedimiento.</li>
	<li>Calcule el volumen pipeteando el extracto de lombriz.</li>
	<li>Agregue una proporción de 1:1 de (2x) solución de lisis de lombrices (Tabla 3). No use inhibidores de la proteasa de ningún tipo.</li>
	<li>Incubar en hielo durante 15 min.</li>
	<li>Eliminar los residuos por centrifugación (1.000 x g durante 2 min) en una centrífuga preenfriada (4 °C).</li>
	<li>Transfiera el sobrenadante a un tubo de microfuga limpio. Las muestras pueden utilizarse directamente o almacenarse a -80 °C.</li>
	<li>Prepare la solución de quimotripsina (Tabla 3) y manténgala en hielo hasta su uso.</li>
	<li>Determine la concentración total de proteínas utilizando el ensayo de Bradford.</li>
	<li>Diluir la muestra, si es necesario, de modo que la concentración total de proteínas sea de 3-3,5 mg/ml.</li>
	<li>Añadir solución de quimotripsina al lisado total de proteínas (1:1.200).</li>
	<li>Para determinar el tiempo de incubación, incube la muestra con quimotripsina durante 60 min. Retire 20 μl de alícuotas de la muestra en diferentes puntos de tiempo (por ejemplo, 0, 5, 20, 40 y 60 min), mezcle inmediatamente con el tampón de muestra SDS y hierva durante 5 min a 96 °C. * Alternativamente, incube la muestra con diferentes concentraciones de quimotripsina y detenga la reacción después de un tiempo específico agregando tampón de muestra SDS y hirviendo durante 5 min a 96 °C.</li>
	<li>Ejecute muestras en un gel SDS-PAGE.</li>
	<li>Realizar el análisis de Western blot utilizando los anticuerpos adecuados para determinar la estabilidad relativa de la proteína.</li>
	<li>Determine las condiciones óptimas (concentración de quimotripsina y tiempo de digestión) que muestran cambios significativos entre muestras y utilice estas condiciones para futuros experimentos.</li>
	<li>Determine la intensidad de diferentes productos de digestión (fragmentos de menor peso molecular) utilizando software de densitometría, como el módulo de gel de imagen de los NIH.</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Las sondas de la capacidad de proteostasis celular deben ser altamente sensibles a los cambios en el entorno de plegamiento y ser fácilmente monitoreadas para proporcionar una evaluación en tiempo real de las capacidades de control de calidad del plegamiento de proteínas. Utilizando proteínas metaestables como sondas de capacidad de proteostasis, monitoreamos los cambios en el fenotipo, la localización de proteínas subcelulares y la conformación de proteínas. Los protocolos presentados aquí se centran en los fenotipos as...

La interacción de los diversos pasos de la biosíntesis de proteínas, como la transcripción, el procesamiento y la traducción del ARNm, así como el plegamiento, la translocación y el ensamblaje/desensamblaje de proteínas, determina la carga de proteínas metaestables que dependen de los mecanismos de control de calidad de las proteínas celulares para su función1. La ausencia o mal funcionamiento de los mecanismos de control de calidad de las proteínas puede, por lo tanto, resultar en el deterioro funcional de diversos tipos de maquinarias celulares y en la aparición de enfermedades de mal plegamiento de proteínas2-7. Cuando la capacidad de las maquinarias de plegamiento y eliminación de proteínas se equilibra con la carga de proteínas metaestables, se logra la homeostasis de las proteínas (proteostasis), un estado que en última instancia evita la acumulación de proteínas mal plegadas y la agregación dentro de las células6. Se cree que la acumulación de proteínas mal plegadas es la señal que activa los factores de transcripción inducibles por estrés, como el factor de choque térmico (HSF-1), y da lugar a la activación de respuestas citoprotectoras al estrés6,8.
Nuestra comprensión de las funciones de las redes de proteostasis en los metazoos se ha derivado principalmente de estudios de reconstitución in vitro y de observaciones realizadas con células de cultivo de tejidos y organismos unicelulares9. Por ejemplo, la investigación sobre las chaperonas moleculares que previenen y resuelven el daño de las proteínas se ha centrado en estudios bioquímicos y biológicos celulares de los mecanismos de plegamiento, desagregación y translocación de proteínas mediadas por chaperonas10-13. En comparación, solo se dispone de información limitada sobre la función integrada de varios componentes de la proteostasis en las diferentes células y tejidos de los metazoos en condiciones de crecimiento "normales" y en respuesta al estrés11. El descubrimiento de que en C. elegans, el control de la calidad de las proteínas celulares también puede ser regulado por las células de forma no autónoma, como se refleja en los experimentos que muestran que las mutaciones en las dos neuronas que perciben la temperatura pueden bloquear la activación de la respuesta de choque térmico y reducir la termotolerancia, demostró la necesidad de estudiar la regulación de la proteostasis en organismos pluricelulares14-17. Lo que falta, sin embargo, es una imagen cohesiva de cómo funcionan las redes de proteostasis, como las diversas familias de chaperonas moleculares, en los tejidos de un metazoo intacto y qué tan dinámicas son estas redes durante el desarrollo y el envejecimiento. Para cumplir este objetivo, se necesitan sensores fiables para monitorizar el mantenimiento del proteoma en animales vivos con el fin de determinar la capacidad proteostática de diferentes células de un organismo multicelular durante el curso del desarrollo y el envejecimiento.
Para que una proteína dada funcione como un sensor de proteostasis celular, debe responder a los cambios en el entorno de plegamiento celular mientras interfiere mínimamente con el plegamiento de proteínas no relacionadas en la célula. Para explorar el mantenimiento y la recuperación de la proteostasis celular en un organismo vivo, se pueden adoptar dos enfoques complementarios que dependen de los sensores de plegamiento. El primero se basa en sensores de plegamiento diseñados, basados en proteínas metaestables identificadas experimentalmente que se sabe que dependen de la maquinaria de proteostasis, como la luciferasa de luciérnaga18-20 o GFP marcada con un degron21-24. En el segundo enfoque, se rastrean las proteínas metaestables endógenas, como las proteínas agregantes sensibles a la temperatura o dependientes de la edad que responden a cambios incrementales en el entorno celular25-27. Los sensores plegables diseñados no cumplen ninguna función biológica esencial, pero ofrecen la ventaja de ser detectables mediante potentes ensayos de notificación, como las proteínas marcadas con GFP, y pueden emplearse con muchos modelos celulares y animales diferentes18. Sin embargo, debido a que la introducción de una sola proteína extraña puede afectar el entorno de plegamiento27, tales polipéptidos pueden sobrecargar la maquinaria de proteostasis celular. Alternativamente, los sensores de plegamiento diseñados que no son nativos de la célula sobre la que informan pueden no verse afectados por los cambios en la capacidad de proteostasis de la célula. Por ejemplo, un sustrato reportero de proteasoma marcado con GFP requirió que ~90% del proteasoma fuera inhibido antes de que se pudiera detectar un fenotipo23. Por el contrario, las proteínas metaestables endógenas que dependen de los mecanismos de proteostasis de la célula ofrecen la ventaja de estar dentro del rango de sensibilidad celular. Sin embargo, la pérdida de función asociada con el mal plegamiento de dichas proteínas también puede afectar la función celular y la viabilidad del organismo. Aquí, nos centraremos en el uso de sensores de plegamiento endógenos de C. elegans.
C. elegans es un modelo de metazoos bien establecido para el estudio tanto del desarrollo como del envejecimiento que utiliza muchas vías biológicas conservadas y se puede utilizar para seguir el plegamiento de proteínas en la célula, utilizando una combinación de biología celular, enfoques bioquímicos y genéticos. Empleamos proteínas metaestables como sondas de capacidad proteostática mediante el seguimiento de cambios en su fenotipo, localización y estabilidad. Además, se puede estudiar una variedad de funciones de proteínas mediante un simple análisis del comportamiento. Del mismo modo, se produce una mala localización sustancial de las proteínas cuando las redes de control de calidad de las proteínas celulares no se ajustan a las demandas celulares. Las proteínas se pueden visualizar fácilmente en células de animales vivos utilizando proteínas marcadas con fluorescencia o mediante inmunotinción. Por último, utilizando métodos ex vivo, es posible monitorizar la expresión y la estabilidad de las proteínas. Esto permite un cribado rápido y sencillo de los cambios conductuales y fisiológicos, junto con un análisis en profundidad de la localización y la estabilidad de las proteínas, lo que permite el seguimiento de los modificadores de la proteostasis. Al combinar estos diferentes métodos, se puede obtener una visión amplia del entorno de plegamiento de proteínas de una célula. De hecho, esta estrategia se ha utilizado con éxito para monitorear la perturbación de la proteostasis en C. elegans, levaduras, cultivos de tejidos y bacterias15,25-35.

<table><tbody><tr><td>Paraformaldehído de</td> <td>anticuerpo y fiaxación</td><td>Merc 8187151000</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1706531</td><td></td></tr><tr><td>Colgenasa Sigma</td><td></td><td>C5138-100MG</td><td></td></tr><tr><td>DABCO</td><td>Merc</td><td>8034560100</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Alfa Aesar</td><td>A16046</td><td></td></tr><tr><td>&beta; -ME</td><td>Sigma</td><td>8057400250</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Di Cam</td><td>000-40-100</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Resumen parcial&nbsp;</td><td>Quimotripsina</td><td>Sigma</td><td>C4129-250MG</td></tr><tr><td>Termorresistencia</td><td>SYTOX</td><td>Naranja Invitrogen</td><td>S11368</td></tr><tr><td>Colesterol</td><td>Amaresco</td><td>0433-250G</td><td></td></tr> EQUIPO <tr><td>M165 FC Estereoscopio</td><td></td><td></td>fluorescente Leica <td></td> TXR filter EXi</tr> Cámara <tr><td></td> de microscopía de fluorescencia azul QImaging EXI-BLU-R-F-M-14-C <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocal ConfoCor 3/510 META</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Granullet Majles</td><td>Sigma</td><td>Z359947-100EA</td><td></td></tr><tr><td>Granullet Mortle Motor Inalámbrico</td><td>Kontes</td><td>K749540-0000</td><td></td></tr><tr><td>MicroCL 17 Microcentrífuga Serie</td><td>Termo 75002455</td><td></td><td>Refrigerada, , 230 V 50/60 Hz, incluye 24x rotor de 1,5/2,0 ml con tapa de biocontención ClickSeal</td></tr></tbody></table>

uso de caenorhabditis elegans como sistema modelo para estudiar la homeostasis de proteínas en un organismo multicelular

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

El plegamiento y ensamblaje de las proteínas es esencial para la función de las proteínas, la salud a largo plazo de la célula y la longevidad del organismo. Históricamente, la función y regulación del plegamiento de proteínas se ha estudiado in vitro, en células aisladas de cultivo de tejidos y en organismos unicelulares. Estudios recientes han descubierto vínculos entre la homeostasis de las proteínas (proteostasis), el metabolismo, el desarrollo, el envejecimiento y la detección de la temperatura. Estos hallazgos han llevado al desarrollo de nuevas herramientas para monitorear el plegamiento de proteínas en el organismo metazoario modelo Caenorhabditis elegans. En nuestro laboratorio, combinamos ensayos de comportamiento, imágenes y enfoques bioquímicos utilizando proteínas metaestables sensibles a la temperatura o que se producen naturalmente como sensores del entorno de plegamiento para monitorear el plegamiento incorrecto de las proteínas. Los ensayos conductuales que se asocian con el plegamiento incorrecto de una proteína específica proporcionan una lectura simple y poderosa para el plegamiento de proteínas, lo que permite la detección rápida de genes y condiciones que modulan el plegamiento. Del mismo modo, dicho mal plegamiento puede estar asociado con la mala localización de proteínas en la célula. Por lo tanto, el seguimiento de la localización de proteínas puede poner de manifiesto los cambios en la capacidad de plegamiento celular que se producen en diferentes tejidos, en diversas etapas de desarrollo y frente a condiciones cambiantes. Por último, utilizando herramientas bioquímicas ex vivo, podemos monitorizar directamente la estabilidad y conformación de las proteínas. Por lo tanto, mediante la combinación de ensayos de comportamiento, imágenes y técnicas bioquímicas, podemos monitorear el mal plegamiento de proteínas a la resolución del organismo, la célula y la proteína, respectivamente.

Un entorno de plegamiento comprometido puede provocar mal plegamiento y agregación de proteínas. El mal plegamiento proteico se asocia con una conformación alterada y conlleva una pérdida de la función proteica. Utilizamos enfoques complementarios para monitorear el plegamiento y la función proteica en animales intactos, células específicas y extractos proteicos. Una elección inteligente de un sensor de plegamiento, basada en fenotipos celulares y conductuales marcados asociados con una mutación desestabilizadora conocid...

Para estudiar la relación entre la homeostasis de las proteínas, el estrés y el envejecimiento, monitoreamos los cambios en el plegamiento de las proteínas siguiendo la disfunción de las proteínas, la localización de las proteínas en la célula y la estabilidad de las proteínas a nivel de organismo, celular y proteína, utilizando el metazoo genéticamente tratable Caenorhabditis elegans como sistema modelo.

Uso de Caenorhabditis elegans como sistema modelo para estudiar la homeostasis de proteínas en un organismo multicelular

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

El objetivo general de los siguientes experimentos en el metazoo genéticamente tratable CENO R elegance es monitorear el mal plegamiento de proteínas en tres niveles, el organismo, las células y las proteínas. Los fenotipos conductuales, como la motilidad o la termorresistencia, funcionan como lecturas de los cambios en la homeostasis de las proteínas a nivel del organismo, sensibles a la temperatura o que ocurren de forma natural. Las proteínas meta estables se utilizan para seguir la localización de las proteínas, que puede estar asociada con el mal plegamiento de las proteínas.Un ensayo de digestión parcial ex vivo monitorea directamente la estabilidad de las proteínas. Los resultados pueden mostrar cambios en la capacidad de proteostasis a diferentes temperaturas de cultivo en función del ensayo de termorresistencia, la microscopía de inmunofluorescencia y el análisis de sangre occidental. Estos procedimientos serán demostrados por estudiantes de posgrado en mi laboratorio.El ensayo conductual será demostrado por ish ido y Shai demostrará la tinción inmunológica y el fallo de ANA y sheron demostrará la digestión parcial. Este protocolo para medir la tolerancia a la temperatura va acompañado de pasos preparatorios para la sincronización de los animales y un ensayo de movimiento. Ambos se describen en el protocolo de texto, comenzando por la recolección de réplicas que contienen al menos 20 animales sincronizados.En 24 pozos bien explotados que contienen 450 microlitros de tampón de choque térmico. Suplementar cada pocillo con nueve microlitros de citoxina. Ahora transfiera el plato a un baño caliente.El choque térmico, la temperatura y la duración dependen en gran medida de las condiciones de crecimiento. En particular, la temperatura de cultivo marca la supervivencia del animal mediante el seguimiento de su absorción de dados. Usando un estereoscopio fluorescente con un filtro TXR, los animales que toman el dado están muertos.La principal ventaja de esta técnica de métodos existentes como el kine, la tolerancia por puntuación manual es el uso de la lectura visual de la mortalidad de los animales, lo que hace que este ensayo sea mucho más rápido y reproducible. En la etapa requerida, transfiera al menos 30 animales a un tubo de microcentrífuga que contenga tampón M nueve. Lave a los animales varias veces con M nine realizando pasos de centrifugación cortos y de baja velocidad y Resus suspendiéndolos en M nine.A continuación, coloque los tubos en hielo durante unos minutos para que se enfríen. Una vez enfriado, retira el exceso de líquido e incuba los tubos. En 500 microlitros de aldehído helado, 4%PARAFORM aldehído.El tiempo de incubación debe calibrarse para cada proteína examinada y debe ser de alrededor de cinco a 30 minutos a temperatura ambiente. Ahora, lavar los animales fijos tres veces con PBS tween a pH 7.2 por centrifugación. Las centrifugaciones siempre se realizan a 3000 RPM durante uno o dos minutos, a menos que se especifique lo contrario.En la campana, retire la mayor parte del sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en un mililitro de solución de mercaptoetanol en barra. A continuación, incubar los animales a 37 grados centígrados durante la noche con un suave balanceo al día siguiente en la campana. Lavar a los animales tres veces con PBST por centrifugación y Resus.Termine el lavado con 50 a 100 microlitros de PBST y elimine la mayor parte de este PBST después de otra centrifugación. A continuación, agregue de 100 a 150 microlitros de solución de colagenasa e incube a los animales a 37 grados centígrados con una fuerte agitación. Utilice una batidora térmica o una incubadora agitadora.Después de cinco minutos, comience a realizar controles periódicos bajo un microscopio estereoscópico. Cuando una quinta parte de los animales estén rotos, detenga la reacción colocando el tubo sobre hielo. Este paso es muy sensible.La duración del tratamiento depende de las condiciones de fijación y puede variar ampliamente entre cepas. Una incubación prolongada podría resultar en la degradación completa de los animales. Las condiciones deben calibrarse antes de cada lote de enzimas y la degradación debe controlarse cuidadosamente.A continuación, lave a los animales dos veces en PBST. Recoja los animales por centrifugación y elimine la mayor parte del PBST. Luego agregue un mililitro de una solución de BA seguida de incubación con balanceo suave durante una hora a temperatura ambiente, recoja los animales por centrifugación y resuspenda en 200 microlitros de una solución de b, A. Ahora agregue el anticuerpo primario y comience una incubación durante la noche con un balanceo suave a temperatura ambiente.Estos parámetros necesitan ser calibrados. A continuación, lavar a los animales por centrifugación. Vuelva a suspenderlos en un mililitro de a b, A e incubarlos con una mezcla suave durante 15 minutos a una hora a temperatura ambiente.En este punto, se puede agregar una adición opcional de tinte fluorescente. A continuación, repita el lavado con tampón BA tres veces más y finalice los lavados con Resus suspendiendo en 100 microlitros de BA con el anticuerpo secundario marcado con fluorescencia adecuado en una dilución de uno a 100. Incubar las muestras meciéndolas durante varias horas a temperatura ambiente, protegidas de la luz para despejar las secundarias.Realice tres lavados con a, b, a. A continuación, monte los animales en portaobjetos con Resus primero, suspendiéndolos en 10 microlitros de a b, a, y luego utilizando una pipeta de diámetro ancho para transferir uno o dos microlitros de la muestra a cada portaobjetos, añada un volumen igual de medio de montaje y cubra el portaobjetos. Sella suavemente el portaobjetos con esmalte de uñas.Los portaobjetos se pueden almacenar a menos 20 grados centígrados durante períodos prolongados. Por lo general, las personas nuevas en este protocolo tendrán dificultades porque el protocolo es largo e incluye muchos pasos que pueden afectar su eficiencia, lo que dificulta la resolución de problemas. Comience recogiendo los animales de placas de unos 1560 milímetros en uno o dos mililitros de tampón M nine.Los animales no deben estar hacinados. Lavar los animales unas cuantas veces con tampón M nine centrifugando y resus suspendiendo a los animales. Después del centrifugado final, resus suspende a los animales en 100 microlitros de tampón M nueve.A continuación, congele rápidamente los animales y, con un mortero y un taladro refrigerados, muela la muestra mientras está en hielo. Se detiene con frecuencia para comprobar si los animales están suficientemente molidos. Una vez que los animales estén completamente triturados, estime el volumen del extracto de lombriz.A continuación, añada un volumen igual de dos x solución de lisis de lombriz e incube la muestra en hielo durante 15 minutos. A continuación, elimine los residuos mediante un ciclo de centrifugación enfriado y transfiera el sobrenadante a un tubo de microfuga limpio. Después de un ensayo de Bradford, diluya la muestra a tres a 3,5 miligramos de proteína por mililitro.Luego agregue una solución fría de tripsina de camuflaje recién preparada en una proporción de uno a 1200. En este punto, configure la muestra para incubar durante una hora. Durante la incubación, tome periódicamente 20 alícuotas de microlitros y mézclelas inmediatamente con tampón SDS, seguido de cinco minutos a 96 grados centígrados.Ejecute las muestras y siga con un análisis de sangre occidental para determinar la estabilidad relativa de la proteína. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que no debe agregar un cóctel de inhibidores de proteasa a la muestra de digestión y, en cambio, mantendremos las muestras en hielo rápidamente. La mutación E 781 K ts en la chaperona muscular en 45 afecta fuertemente el plegamiento y ensamblaje de la miosina y, por lo tanto, afecta la motilidad animal.Cuando estos mutantes crecieron a temperaturas superiores a los 20 grados centígrados, quedaron completamente paralizados, pero no a 15 grados centígrados. Cuando los animales de tipo salvaje criados a 25 grados centígrados fueron sometidos a un choque térmico prolongado, la mayoría sobrevivió. Mientras que solo el 30% sobrevivió si se elevó a 15 a 20 grados Celsius para monitorear los modificadores efectivos en la respuesta al choque térmico, las condiciones de estrés de control se elevaron a una tasa de supervivencia del 70% para los animales de tipo salvaje.Los animales fueron expuestos a un choque térmico de 37 grados centígrados durante seis horas. En el primer día de la edad adulta, la supervivencia se ensayó mediante el ensayo de absorción de naranja cyt. Los animales muertos se indican con flechas blancas y los animales vivos con flechas amarillas.La localización de varias proteínas metaestables se visualizó utilizando anticuerpos específicos. Por ejemplo, los parámetros se localizan en conjuntos policristalinos en lugar de en sarcómeros musculares en condiciones restrictivas. Del mismo modo, la miosina TS forma filamentos desorganizados en lugar de las estructuras filamentosas altamente ordenadas a la temperatura restrictiva.Animales que expresan varias proteínas mutantes TS coexpresadas con miotres. La GFP mostró un rápido deterioro en la organización del miofilamento, como se detectó mediante el seguimiento de la GFP, los cambios en la miosina confirmaron que pueden reflejar cambios en la capacidad de plegamiento de las células musculares. El patrón de fragmentación proteolítica de la cadena pesada de miosina, coexpresado con UNC 45 Ts, muestra características distintas en comparación con el perfil de digestión de la miosina de animales salvajes, lo que respalda la afirmación de que el plegamiento de la miosina se ve afectado por UNC 45.Pérdida de la función. Aunque este método puede proporcionar información sobre la regulación de la proteostasis en la elegancia marina, también se puede aplicar en otros sistemas, como diferentes organismos modelo.

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