Biofuncionalizadas prusiana nanopartículas azul para Multimodal Molecular Aplicaciones de imágenes

El objetivo general de este procedimiento es sintetizar nanopartículas de azul de Prusia biofuncionalizadas para su uso como agentes de imagen molecular multimodal. Esto se logra primero sintetizando nanopartículas de azul de Prusia que contienen iones de gadolinio o manganeso, los cuales mejoran la señal de resonancia magnética. El segundo paso consiste en unir fluorocromo avadón a la superficie de las nanopartículas, lo que les confiere capacidad de imagen mediante fluorescencia.

A continuación, las nanopartículas recubiertas con avadón se biofuncionalizan con los anticuerpos biotinilados deseados para el direccionamiento celular. Un paso final consiste en realizar un control de calidad de las nanopartículas biofuncionalizadas midiendo su tamaño, potencial zeta y estabilidad temporal. En última instancia, las nanopartículas biofuncionalizadas se utilizan en aplicaciones de imagen molecular multimodal para visualizar una población específica de células diana dentro de una mezcla mediante imágenes de fluorescencia y resonancia magnética (MRI).

Los agentes de imagen comerciales actuales son típicamente unimodales y ofrecen resolución únicamente a nivel anatómico. Las nanopartículas de azul de Prusia combinan dos modos de imagen complementarios, resonancia magnética (RM) y fluorescencia, y permiten la obtención de imágenes moleculares y a niveles subcelulares. Las aplicaciones de las nanopartículas multimodales se extienden hacia el diagnóstico de cáncer y enfermedades inflamatorias, además del monitoreo de la respuesta a su tratamiento.

Esto se debe a que las nanopartículas biofuncionalizadas pueden dirigirse y unirse a una población de células dentro de una región específica del cuerpo. Aunque este método puede proporcionar información sobre el diagnóstico de cáncer y enfermedades inflamatorias, así como sobre la respuesta al tratamiento, también puede aplicarse a otras condiciones patológicas que se beneficien de la sensibilidad y especificidad de la imagen molecular. Mediante el uso de fluorescencia y resonancia magnética, tuvimos inicialmente la idea de producir estas nanopartículas cuando determinamos que el azul de Prusia, un agente aprobado por la FDA para consumo oral humano, podía sintetizarse establemente mediante un esquema de síntesis en una sola etapa y biofuncionalizarse de forma robusta utilizando técnicas estándar de bioconjugación.

Para comenzar, prepare una solución molar de 5 millones de hexacianoferriato dos de potasio en cinco mililitros de agua desionizada para obtener la solución A. A continuación, prepare la solución B que contiene 2,5 milimolar de cloruro de hierro tres y 2,5 milimolar de manganeso dos cloruro en 10 mililitros de agua desionizada para la síntesis de nanopartículas de azul prusiano de manganeso. Otras nanopartículas pueden sintetizarse según se indica en el protocolo del texto. Transfiera la solución B a un matraz de fondo redondo y agite la solución a 1000 RPM a temperatura ambiente.

Mediante una bomba peristáltica, agregue la solución A gota a gota al recipiente a una velocidad de 10 mililitros por hora. Una vez completada la adición de la solución A, agite la mezcla a 1000 rpm durante 30 minutos adicionales. Luego, transfiera alícuotas de un mililitro de la mezcla a tubos de microcentrífuga y agregue 0,2 mililitros de cloruro de sodio cinco milimolar a cada tubo.

Centrifugue los tubos a 20.000 × g durante al menos 10 minutos y luego retire cuidadosamente el sobrenadante, dejando el sedimento de nanopartículas. A continuación, agregue un mililitro de agua desionizada a cada sedimento. Utilice una punta micrométrica para suspender uniformemente las nanopartículas en solución mediante sonicación.

Lave las nanopartículas al menos tres veces más para eliminar los componentes de la reacción inicial del sobrenadante tras la última centrifugación; re suspenda las nanopartículas en un mililitro de agua desionizada tras recubrir las nanopartículas con den fluorescente como se describe en el protocolo del texto; retire los anticuerpos biotinilados del refrigerador. Aquí, utilice el antígeno neuronal glial dos y el anticuerpo anti-eotaxina humana tres. Transfiera el anticuerpo biotinilado a un filtro microcúfugo de nailon de 0,2 micrómetros y luego centrifugue el tubo a 14.000 ×g durante 10 minutos.

A continuación, agregue menos de o igual a 0,05 miligramos del anticuerpo por miligramo de nanopartículas recubiertas con Aden y cubra los tubos con papel de aluminio para protegerlos de la luz. Incube los tubos con agitación suave durante dos a cuatro horas a cuatro grados Celsius. Después de unir los anticuerpos, agregue 10 microlitros de una muestra de nanopartículas de un miligramo por mililitro a 990 microlitros de agua desionizada en un vial plástico descartable, tape el vial y agítelo para mezclar.

Luego, determine el tamaño promedio de las nanopartículas utilizando un sistema de dispersión dinámica de luz con un ángulo de medición de 173 grados. Comience preparando suspensiones de 10 mililitros de células en PBS a una concentración de aproximadamente 100 000 células por mililitro; para cultivos mixtos, deben prepararse tubos que contengan diferentes proporciones de cada línea celular según se describe en el protocolo del texto. Añada dos mililitros de BSA al 5 % a cada tubo para bloquear las células y minimizar la unión no específica. A continuación, agregue un mililitro de nanopartículas biofuncionalizadas a una concentración de un miligramo por mililitro a cada tubo e incube la mezcla durante una hora.

A continuación, lave las células para eliminar los nanopartículas no ligadas, centrifugando los tubos a 1000 ×g durante cinco minutos y resuspendiendo los precipitados en un mililitro de PBS. Repita este proceso al menos otras dos veces. Fije las células utilizando formaldehído al 10 % en PBS y luego agregue 10 microgramos por mililitro de siete amino actin y micina D en PBS para teñir las células, incube el tubo en hielo durante 30 minutos y luego lave las células con PBS.

A continuación, cargue la muestra en el citómetro de flujo y analice 10.000 células seleccionadas de cada muestra. En el protocolo escrito se describe un procedimiento similar para obtener imágenes de células unidas a nanopartículas fluorescentes mediante microscopía confocal láser. Para comenzar, cultive las células en matraces T75 hasta alcanzar aproximadamente el 80 % de confluencia, y luego enjuague las células para eliminar el medio con cinco mililitros de PBS.

Añada cinco mililitros de BSA al 1 % en PBS y bloquee las células durante una hora. Luego, añada cinco mililitros de nanopartículas recubiertas con anticuerpos a 0,5 miligramos por mililitro al matraz e incube las células durante una hora para permitir la unión de las nanopartículas. A continuación, enjuague las células tres veces con cinco mililitros de PBS para eliminar las nanopartículas no unidas.

Luego, agregue dos mililitros de solución de tripsina-EDTA al 0,25 % y incube las células durante cinco minutos para desprenderlas del frasco. Añada ocho mililitros de DMEM para detener la tripsina y, a continuación, transfiera la suspensión celular a tubos de centrífuga. Centrifugue a 1000 ×g durante cinco minutos para formar el pellet celular.

A continuación, aspire el sobrenadante y resuspenda las células en un mililitro de PBS. Añada un mililitro de formaldehído al 10 % en PBS para fijar las células y luego transfiera 100 microlitros de cada muestra a pozos separados de una placa de fondo plano de 96 pozos. Añada 100 microlitros de agarosa al 1 % fundida en agua desionizada a cada pozo y mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo.

Deje que el gel solidifique a cuatro grados Celsius durante 12 horas para obtener un fantasma. Una vez que el gel haya solidificado, coloque el fantasma junto a un bloque sólido cúbico de 150 centímetros de agar al 2% dentro de un imán clínico horizontal de tres T. A continuación, asegure el fantasma y el bloque de agar en el centro de una bobina cerebral HD de ocho canales para medir los tiempos de relajación, utilizando cortes coronales de 0,5 milímetros de espesor tomados a la altura media de la placa de 96 pocillos. Se utilizaron ensayos de dispersión dinámica de luz para determinar el diámetro hidrodinámico de las nanopartículas generadas. Estudios de estabilidad verificaron la estabilidad a largo plazo de las nanopartículas, que se utilizan tanto en experimentos basados en agua como en medios celulares.

La microscopía confocal con láser mostró nanopartículas fluorescentes cargadas con anticuerpos para EOT tres que se unieron específicamente a la superficie de células EOL una. Cuando se utilizaron anticuerpos para un NG dos, estos se unieron específicamente a la superficie de neuroesferas BSG. Las nanopartículas biofuncionalizadas pudieron etiquetar con éxito mediante fluorescencia una población de células diana, según se midió por citometría de flujo.

Además, las nanopartículas pudieron dirigirse a una subpoblación específica de células en una mezcla, incluso con relaciones bajas de células diana respecto a células de control. Finalmente, las nanopartículas biofuncionalizadas incrementaron el contraste en resonancia magnética de las células diana, células tratadas con nanopartículas cargadas con una nng. Dos anticuerpos mostraron hiperintensidad en las secuencias ponderadas en T uno en comparación con las células tratadas con partículas de control.

En contraste, las dos nanopartículas A NNG produjeron una hipointensidad en las secuencias ponderadas en T2 en comparación con las partículas de control. Una vez maestros. La síntesis de nanopartículas de azul de presión biofuncionalizadas puede completarse en dos días si se realiza adecuadamente.

De forma similar a este procedimiento, las nanopartículas pueden ser biofuncionalizadas con diferentes biopolímeros y ligandos de targeting para investigar nuevas enfermedades y nuevas condiciones. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo sintetizar nanopartículas de azul de Prusia para aplicaciones de fluorescencia y de imágenes destinadas a marcar poblaciones de células. No olvide seguir rigurosamente las directrices de seguridad y los procedimientos operativos estándar para realizar los estudios en el imán clínico de resonancia magnética.