Biofuncionalizadas prusiana nanopartículas azul para Multimodal Molecular Aplicaciones de imágenes

El objetivo general de este procedimiento es sintetizar nanopartículas biofuncionalizadas de azul de Prusia para el uso de agentes de imagen molecular multimodales. Esto se logra sintetizando primero nanopartículas de azul de Prusia que contienen iones de gadolinio o manganeso, que mejoran la señal de resonancia magnética. El segundo paso es unir avadon fluorescente en la superficie de las nanopartículas, lo que confiere capacidad de imagen fluorescente.

A continuación, las nanopartículas recubiertas de avadon se biofuncionalizan con los anticuerpos biotinilados dirigidos a la célula deseada. Un último paso es realizar un control de calidad de las nanopartículas biofuncionalizadas midiendo su tamaño, potencial zeta y estabilidad temporal. En última instancia, las nanopartículas biofuncionalizadas se utilizan en aplicaciones de imágenes moleculares multimodales para visualizar una población específica de células dentro de una mezcla mediante imágenes de fluorescencia y resonancia magnética.

Los agentes de imagen comerciales actuales suelen ser monomodo y ofrecen resolución solo a nivel anatómico. Las nanopartículas de azul de Prusia combinan dos modos de imagen complementarios, la resonancia magnética y la fluorescencia, y permiten la obtención de imágenes moleculares y a niveles subcelulares. Las aplicaciones de las nanopartículas multimodales se extienden hacia el diagnóstico del cáncer y las enfermedades inflamatorias, además del seguimiento de sus respuestas al tratamiento.

Esto se debe a que las nanopartículas biofuncionalizadas pueden dirigirse y unirse a una población de células dentro de una región específica del cuerpo. Aunque este método puede proporcionar información sobre el diagnóstico del cáncer y las enfermedades inflamatorias y la respuesta al tratamiento, también se puede aplicar a otras condiciones patológicas que se beneficiarán de la sensibilidad y especificidad de las imágenes moleculares. Utilizando fluorescencia y resonancia magnética, tuvimos la idea de producir estas nanopartículas cuando determinamos que el azul de Prusia y el agente aprobado por la FDA para el consumo oral humano podían sintetizarse de manera estable utilizando un esquema de síntesis de una sola parte y biofuncionalizarse de manera robusta utilizando técnicas bioconjugadas estándar.

Para comenzar, prepare una solución molar de 5 millones de molares de hexa sano ferrato de potasio dos en cinco mililitros de agua desionizada para hacer la solución A, la siguiente solución de reparación B que contiene 2,5 milimolares de hierro, tres cloruros y 2,5 milimolares de manganeso. Dos cloruros en 10 mililitros de agua desionizada para la síntesis de nanopartículas de manganeso azul de Prusia. Se pueden sintetizar otras nanopartículas como se indica en el protocolo de texto: transfiera la solución B a un matraz de fondo redondo y agite la solución a 1000 RPM a temperatura ambiente.

Usando una bomba peristáltica, agregue la solución A gota a gota en el recipiente a una velocidad de 10 mililitros por hora. Una vez completada la adición de la solución A, revuelva la mezcla a 1000 RPM durante 30 minutos más. A continuación, transfiera un mililitro de alícuotas de la mezcla a tubos de microcentrífuga y añada 0,2 mililitros de cinco mililitros de cloruro de sodio a cada tubo.

Centrifugar los tubos a 20.000 veces G durante al menos 10 minutos, y luego retire con cuidado el supinado, dejando la bolita de nanopartículas. A continuación, añade un mililitro de agua desionizada a cada pellet. Utilice una micropunta para suspender las nanopartículas de manera uniforme en solución mediante sonicación.

Lave las nanopartículas al menos tres veces más para eliminar los componentes de la reacción inicial de la suspensión después del giro final, vuelva a suspender las nanopartículas en un mililitro de agua desionizada después de recubrir las nanopartículas con den fluorescente como se describe en el protocolo de texto, retire las existencias de anticuerpos biotinilados del refrigerador. Aquí. Utilice el antígeno glial antineuronal dos y la eotaxina humana tres. Transfiera el anticuerpo biotinilado a un microfiltro de micro nylon de 0,2 y luego centrifugue el tubo a 14.000 veces G durante 10 minutos.

A continuación, agregue menos o igual a 0,05 miligramos del anticuerpo por miligramo de nanopartículas recubiertas de Aden y cubra los tubos con papel de aluminio para protegerlos de la luz. Incubar los tubos agitándolos suavemente durante dos a cuatro horas a cuatro grados centígrados. Después de unir los anticuerpos, agregue 10 microlitros de un miligramo por mililitro de muestra de nanopartículas a 990 microlitros de agua desionizada en un tapón de plástico desechable para mezclar.

A continuación, determine el tamaño medio de las nanopartículas utilizando un sistema dinámico de dispersión de luz con un ángulo de medición de 173 grados. Comience preparando suspensiones de 10 mililitros de células en PBS a una concentración de aproximadamente 100.000 células por mililitro para cultivos mixtos, los tubos que contienen proporciones variables de cada línea celular deben prepararse como se describe en el protocolo de texto a dos mililitros de 5% BS, A por cada tubo para bloquear las células y minimizar la unión inespecífica. A continuación, añade un mililitro de un miligramo por mililitro, biofuncionaliza nanopartículas a cada tubo e incuba la mezcla durante una hora.

A continuación, enjuague las células para liberarlas de nanopartículas no unidas haciendo girar los tubos a 1000 veces G durante cinco minutos y volviendo a doblar los gránulos en un mililitro de PBS. Repite este proceso al menos dos veces más. Fije las células usando formaldehído al 10% en PBS y luego agregue 10 microgramos por mililitro, siete aminoácidos actina y micina D en PBS para teñir las células, incubar el tubo en hielo durante 30 minutos y luego enjuagar las células con PBS.

A continuación, cargue la muestra en el citómetro de flujo y analice 10.000 células compuertas de cada muestra. En el protocolo de texto se describe un procedimiento similar para obtener imágenes de células unidas a nanopartículas fluorescentes mediante microscopía confocal láser. Para comenzar, use las celdas en matraces T 75 hasta aproximadamente el 80% de confluencia y luego enjuague las celdas sin medio con cinco mililitros de PBS.

Agregue cinco mililitros de 1%BSA en PBS y bloquee las células durante una hora. A continuación, añada cinco mililitros de nanopartículas recubiertas de anticuerpos de 0,5 miligramos por mililitro al matraz e incube las células durante una hora para permitir que las nanopartículas se unan. A continuación, enjuague las células tres veces con cinco mililitros de PBS para eliminar las nanopartículas no unidas.

A continuación, añadir dos mililitros de solución de EDTA al 0,25% e incubar las células durante cinco minutos para separarlas del matraz. Agregue ocho mililitros de DMEM para apagar la prueba y luego transfiera la suspensión celular a los tubos de centrífuga. Gírelos a 1000 veces G durante cinco minutos para pellet las células.

A continuación, aspire el supinato y vuelva a suspender las células en un mililitro de PBS. Agregue un mililitro de formaldehído al 10% en PBS para fijar las celdas y luego transfiera 100 microlitros de cada muestra a pocillos separados de una placa de fondo plano de 96 pocillos. Agregue 100 microlitros de 1%aros fundidos en agua desionizada a cada pocillo y mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo.

Deje que el gel se solidifique a cuatro grados centígrados durante 12 horas para producir un fantasma. Después de que el gel se solidifique, coloque el maniquí en un imán clínico horizontal de tres T junto a un bloque cúbico sólido de 150 centímetros de agar al 2%. A continuación, asegure el maniquí y el bloque de agar dentro del centro de una bobina cerebral HD de ocho canales para medir los tiempos de relajación, utilice cortes coronales de 0,5 milímetros de grosor tomados a la altura media de la placa de 96 pocillos, se utilizaron ensayos de dispersión dinámica de la luz para determinar el diámetro hidrodinámico de la estabilidad de las nanopartículas generadas. Los estudios verificaron la estabilidad a largo plazo de las nanopartículas que se utilizan tanto en experimentos basados en agua como en medios celulares.

La microscopía confocal láser mostró nanopartículas fluorescentes cargadas con anticuerpos para EOT tres encontradas específicamente en la superficie de las células EOL one. Cuando se utilizan anticuerpos para un NG dos, se unen específicamente a la superficie de las neuroesferas BSG. Las nanopartículas biofuncionalizadas fueron capaces de marcar con éxito con fluorescencia una población de células objetivo según lo medido por citometría de flujo.

Además, las nanopartículas fueron capaces de dirigirse a una subpoblación específica de células en una mezcla, incluso con proporciones bajas de células objetivo para controlarlas. Por último, las nanopartículas biofuncionalizadas aumentaron el contraste de resonancia magnética de las células objetivo, células tratadas con nanopartículas cargadas con un nng. Dos anticuerpos mostraron hiperintensidad en las secuencias ponderadas T one en comparación con las células tratadas con partículas control.

Por el contrario, las dos nanopartículas A NNG confirieron hipointensidad en las secuencias ponderadas T dos en comparación con las partículas de control. Una vez maestros. La síntesis de nanopartículas biofuncionalizadas de presión azul puede completarse en dos días si se realiza correctamente.

De manera similar a este procedimiento, las nanopartículas se pueden biofuncionalizar con diferentes biopolímeros y dirigirse al ligando para investigar nuevas enfermedades y nuevas afecciones. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo sintetizar nanopartículas de azul de Prusia para aplicaciones de fluorescencia e imágenes para etiquetar poblaciones de células. No olvide seguir rigurosamente las pautas de seguridad y los procedimientos operativos estándar para realizar los estudios en el imán de resonancia magnética clínica.