Un método estandarizado para el análisis de las células del hígado sinusoidal endoteliales y sus Fenestraciones por Microscopía Electrónica de Barrido

El objetivo general de este procedimiento es analizar el endotelio sinusoidal del hígado. Esto se logra primero aislando un hígado y perfundiéndolo con un fijador. A continuación, el hígado se corta en bloques y se deshidrata en preparación para la microscopía electrónica.

A continuación, las muestras de hígado se recubren con pulverización catódica y se examinan bajo un microscopio electrónico. Finalmente, se analizan las micrografías electrónicas y se calcula el diámetro y la frecuencia de fenestración y el porcentaje de porosidad. En última instancia, la microscopía electrónica se utiliza para mostrar cambios en el endotelio sinusoidal del hígado en diversas condiciones.

Este método nos proporciona información sobre la ultraestructura y la morfología de los vasos sanguíneos del hígado en su endotelio. También se puede utilizar para examinar el riñón y el cerebro de la misma manera Todos los procedimientos que involucran el uso de animales se llevan a cabo de acuerdo con la legislación local. Este trabajo está aprobado por el Comité de Bienestar Animal del Distrito de Salud Local de Sydney.

Los procedimientos permitidos se describen en la documentación de la licencia del proyecto y siguen pautas que garantizan el bienestar del animal en todo momento. Esta es una cirugía que no es de supervivencia. Después de preparar el fijador, de acuerdo con el protocolo de texto, caliente el tampón de perfusión y el fijador a 35 a 37 grados centígrados.

Una vez que el animal está anestesiado con una sola inyección intraperitoneal de ketamina y xilacina, evaluar el nivel de sedación mediante la retirada de las extremidades traseras y un pellizco de la cola. A continuación, con unas tijeras romas, haga una incisión en Y en el abdomen del animal para exponer el hígado y la vena porta. A continuación, ate dos suturas muy flojas alrededor de la vena porta, una proximal al hígado y la otra más distalmente al hígado.

Cánula la vena porta con una cánula intravenosa de tamaño adecuado. A continuación, apriete las suturas para asegurar la cánula. Ahora usando de cinco a 20 mililitros de PBS caliente a 37 grados Celsius, comience la perfusión a una presión de 10 centímetros de H2O.

Evite que las burbujas de aire ingresen al hígado, lo que produciría artefactos y una presión de aire demasiado alta, lo que dañará el hígado, cortará el ACV de la vena abdominal y torácica para permitir que el tampón salga libremente del hígado. Esto evita la alta contrapresión, el daño al hígado, las células sinusoidales y endoteliales o LCC. Una vez que el hígado esté libre de sangre, se sustituye el PBS por microscopía electrónica o em, fijador y perfunde hasta que el hígado esté endurecido y muy pálido.

Aproximadamente cinco minutos. Luego, con el bisturí, corta el hígado en bloques de uno o dos milímetros cúbicos. Utilice el fijador em para publicar.

Fije el tejido a cuatro grados centígrados durante 24 a 72 horas. A continuación, transfiera el tejido a un tampón Cate de sodio de 0,1 molares y guárdelo a cuatro grados centígrados durante un máximo de 12 meses para montar las muestras para microscopía electrónica de barrido o SEM. Después de deshidratar las muestras de acuerdo con el protocolo de texto, etiquete la base de los trozos metálicos de SEM y aplique cinta de carbono de doble cara en la parte superior de los trozos bajo un microscopio de disección, visualice las muestras para identificar la superficie con los mejores sinusoides para SEM.

Cordón, una superficie elegida que mira hacia arriba sobre la superficie de la cinta de carbono del trozo y pégalo firmemente en el talón. Después de realizar el recubrimiento por pulverización catódica y SEM de acuerdo con el protocolo de texto, abra una imagen en la imagen J y use una barra de escala incrustada en la imagen para establecer la escala usando la herramienta de polígono en la imagen J trace alrededor de toda el área plana del LSEC, incluidas las áreas fenestradas y fenestradas, excluya cualquier pieza grande de escombros que esté en la superficie de la celda que pueda estar oscureciendo las fenestraciones. Para medir el diámetro de la fenestración, coloque una línea a través del diámetro más largo de cada fenestración seleccionando la herramienta de línea.

Presione M para medir la línea y D para dibujar permanentemente la línea en la imagen. Esta línea se define como el diámetro de fenestración y ahora estará disponible en el cuadro de resultados de la imagen J. Mida todos los espacios que son agujeros más grandes en el citoplasma LSEC de más de 250 nanómetros, así como las fenestraciones. Calcule el área de los espacios que no son circulares trazando alrededor de ellos y usando la imagen J para calcular su área más allá de los datos del cuadro de resultados en la imagen J en una hoja de cálculo de Excel.

Para un análisis más detallado, utilice las siguientes fórmulas para realizar cálculos de fenestración. El diámetro medio de la fenestración es igual a la media de todos los diámetros de fenestración. El área de fenestración es igual a pi r al cuadrado, donde R se calcula a partir de los diámetros de fenestración individuales.

El porcentaje de porosidad es igual a sigma pi R al cuadrado sobre el área total analizada y micras por 100 excluyen de este cálculo el área de la suma de los espacios. Para presentar los datos en las publicaciones, incluya el diámetro de fenestración con una declaración que confirme que los diámetros límite se utilizaron para definir las fenestraciones, la frecuencia de fenestración y la porosidad, también incluya una declaración que confirme si se incluyeron brechas en el análisis y un gráfico de distribución de frecuencia del diámetro de fenestración y el número de bloques de hígados, así como imágenes. El bajo aumento por SEM revela una superficie plana de la muestra de hígado con un área expuesta lo suficientemente grande como para observar muchos vasos hepáticos grandes y sinusoides, incluido el tracto porta y las CE centrales, como se muestra aquí.

Asegurarse de que la colocación correcta del bloque hepático en el muñón de montaje es esencial para obtener imágenes claras de los sinusoides y debe evitarse la cápsula de brillo, que cubre todos los detalles de los sinusoides del hígado. Por esta razón, como se muestra aquí, un mayor aumento permite la observación de las fenestraciones de LSEC. Las placas de los hepatocitos pueden parecer vasos sanguíneos, pero características como el BLI ayudan con la orientación.

Esta figura demuestra que la alta presión de profusión puede causar artefactos como grandes brechas en el endotelio que se cree que son causadas por la coalescencia de las placas SIV del LSEC que se identifican fácilmente bajo SEM, evitando la membrana celular directamente sobre los núcleos, que se puede ver como una protuberancia debajo de la superficie del LSEC ayudará con la precisión de los cálculos de densidad de fenestración y porosidad. Por último, la cuantificación de la densidad y frecuencia del diámetro de las fenestraciones de LSEC proporciona una medición empírica de las fenestraciones y permite medir los cambios inducidos por el envejecimiento, la enfermedad, las toxinas o las terapias. Después del procedimiento de perfusión, el tejido se puede procesar para otras técnicas como la microscopía electrónica de transmisión para observar la ultraestructura celular, la estructura mitocondrial.

También se puede utilizar para la histología.