Un método estandarizado para el análisis de las células del hígado sinusoidal endoteliales y sus Fenestraciones por Microscopía Electrónica de Barrido

El objetivo general de este procedimiento es analizar el endotelio sinusoidal hepático. Esto se logra primero aislando un hígado y perfundiéndolo con un fijador. A continuación, el hígado se corta en bloques y se deshidrata para prepararlo para microscopía electrónica.

Luego, las muestras de hígado se recubren por pulverización catódica y se examinan bajo un microscopio electrónico. Finalmente, se analizan las microfotografías electrónicas y se calculan el diámetro y la frecuencia de las fenestraciones y el porcentaje de porosidad. En última instancia, la microscopía electrónica se utiliza para mostrar los cambios en el endotelio sinusoidal hepático bajo diversas condiciones.

Este método nos proporciona información sobre la ultraestructura y la morfología de los vasos sanguíneos del hígado en su endotelio. También puede utilizarse para examinar el riñón y el cerebro de la misma manera. Todos los procedimientos que implican el uso de animales se llevan a cabo de acuerdo con la legislación local. Este trabajo ha sido aprobado por el Comité de Bienestar Animal del Distrito Local de Salud de Sídney.

Los procedimientos permitidos se describen en la documentación de la licencia del proyecto y siguen directrices que garantizan el bienestar del animal en todo momento. Esta es una cirugía no superviviente. Después de preparar el fijador, según el protocolo descrito, caliente el tampón de perfusión y el fijador a una temperatura de 35 a 37 grados Celsius.

Una vez que el animal esté anestesiado con una inyección intraperitoneal única de ketamina y xilacina, evalúe el nivel de sedación mediante el retiro de la extremidad trasera y una compresión del rabo. A continuación, con tijeras de punta roma, realice una incisión en forma de Y en el abdomen del animal para exponer el hígado y la vena porta. Luego, coloque dos suturas muy sueltas alrededor de la vena porta, una proximal al hígado y la otra más distal al hígado.

Coloque una cánula IV de tamaño adecuado en la vena porta. Luego apriete los puntos para fijar la cánula. Ahora, utilizando entre cinco y veinte mililitros de PBS calentado a 37 grados Celsius, comience la perfusión a una presión de 10 centímetros de H2O.

Evite que las burbujas de aire entren en el hígado, ya que producirían artefactos y una presión de aire demasiado alta, lo que dañaría el hígado; corte la vena cava abdominal y torácica para permitir que el tampón salga libremente del hígado. Esto evita una alta presión inversa, daños en el hígado, en las células sinusoidales y endoteliales o en las CCL. Una vez que el hígado esté libre de sangre, reemplace el PBS con fijador para microscopía electrónica o EM y realice la perfusión hasta que el hígado esté endurecido y muy pálido.

Aproximadamente cinco minutos. Luego, con el escalpelo, corte el hígado en bloques de uno a dos milímetros cúbicos. Use fijador EM para el post.

Fije el tejido a cuatro grados Celsius durante 24 a 72 horas. Luego transfiera el tejido a tampón de Cate sodio 0,1 molar y almacénelo a cuatro grados Celsius durante hasta 12 meses para montar los especímenes para microscopía electrónica de barrido o SEM. Después de deshidratar las muestras según el protocolo descrito en el texto, etiquete la base de los soportes metálicos SEM y aplique cinta de carbono de doble cara sobre la parte superior de los soportes bajo un microscopio estereoscópico; visualice las muestras para identificar la superficie con los sinusoides más adecuados para SEM.

Coloque el encaje, con la superficie elegida hacia arriba, sobre la superficie de cinta de carbono del portaobjetos y adhiera firmemente al portaobjetos. Después de realizar el recubrimiento por pulverización y el SEM según el protocolo descrito en el texto, abra una imagen en ImageJ y utilice una barra de escala integrada en la imagen para establecer la escala; emplee la herramienta de polígono en ImageJ para trazar alrededor de toda el área plana de la LSEC, incluyendo las zonas fenestradas y no fenestradas, excluyendo cualquier fragmento grande de detritos presentes sobre la superficie celular que pudiera estar ocultando las fenestraciones. Para medir el diámetro de la fenestración, coloque una línea a través del diámetro más largo de cada fenestración seleccionando la herramienta de línea.

Pulse M para medir la línea y D para dibujarla permanentemente sobre la imagen. Esta línea se define como el diámetro de la fenestración y ahora estará disponible en el cuadro de resultados de ImageJ. Mida todos los espacios que sean orificios más grandes en el citoplasma de las LSEC superiores a 250 nanómetros, así como las fenestraciones. Calcule el área de los espacios que no son circulares trazando su contorno y utilizando ImageJ para calcular su área; transfiera los datos del cuadro de resultados de ImageJ a una hoja de cálculo de Excel.

Para análisis adicionales, utilice las siguientes fórmulas para realizar los cálculos de fenestración. El diámetro promedio de fenestración equivale al promedio de todos los diámetros de fenestración. El área de fenestración equivale a pi r al cuadrado, donde R se calcula a partir de los diámetros individuales de fenestración.

El porcentaje de porosidad equivale a sigma pi R al cuadrado dividido por el área total analizada en micrones, multiplicado por 100; excluya del cálculo el área total de los espacios. Para presentar los datos en publicaciones, incluya el diámetro de las fenestraciones junto con una aseveración que confirme que se utilizaron los diámetros de los bordes para definir las fenestraciones, la frecuencia de fenestraciones y la porosidad. Incluya también una declaración que indique si los espacios se incluyeron en el análisis, así como un gráfico de distribución de frecuencia del diámetro de las fenestraciones, el número de bloques hepáticos y las imágenes. El aumento bajo en MEB revela una superficie plana de la muestra hepática con un área expuesta suficientemente grande para observar muchos vasos hepáticos y sinusoides, incluyendo el tracto portal y el centro ES, como se muestra aquí.

Asegurar la colocación correcta del bloque de hígado sobre el portaobjetos de montaje es esencial para obtener imágenes nítidas de los sinusoides y de la cápsula glistens, que cubre todos los detalles de los sinusoides del hígado, debe evitarse. Por esta razón, como se muestra aquí, un mayor aumento permite la observación de las fenestraciones del LSEC. Las láminas de hepatocitos pueden parecerse a vasos sanguíneos, pero características como el BLI ayudan en la orientación.

Esta figura demuestra que una presión de perfusión elevada puede causar artefactos, como grandes brechas en el endotelio, que se cree son provocadas por la coalescencia de las placas SIV de las LSEC, fácilmente identificables mediante MEB. Evitar la membrana celular directamente por encima de los núcleos, que puede observarse como una protuberancia bajo la superficie de las LSEC, ayudará a mejorar la precisión en los cálculos de densidad y porosidad de las fenestraciones. Por último, la cuantificación del diámetro, la densidad y la frecuencia de las fenestraciones de las LSEC proporciona una medición empírica de las fenestraciones y permite evaluar los cambios inducidos por el envejecimiento, enfermedades, toxinas o terapias. Tras el procedimiento de perfusión, el tejido puede procesarse para otras técnicas, como microscopía electrónica de transmisión, para observar la ultraestructura celular y la estructura mitocondrial.

También se puede utilizar para histología.