Digestión del hígado murino para el análisis cytometric del flujo de las células endoteliales linfáticas

El objetivo de este protocolo es identificar las poblaciones de células endoteliales linfáticas dentro del hígado usando marcadores descritos. Utilizamos colagenasa IV y DNasa y un picado suave del tejido, combinado con citometría de flujo, para identificar una población diferente de células endoteliales linfáticas.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en campos linfáticos y hepáticos, como cómo las células endoteliales linfáticas, o LEC, responden a estímulos específicos y cómo eso contribuye a la patogénesis de la enfermedad. La principal ventaja de esta técnica es que podemos evaluar el fenotipo de células endoteliales linfáticas hepáticas y la función por célula, y se puede utilizar para aplicaciones de flujo descendente después de la clasificación celular. Aunque este método puede proporcionar información sobre la biología linfática hepática, también se puede utilizar para evaluar las células endoteliales linfáticas de diferentes tejidos, como la piel y la glándula mamaria.

Demostrando el procedimiento estará Jeffrey Finlon, un asistente de investigación profesional de mi laboratorio. Para preparar una suspensión de una sola célula de las células hepáticas aisladas, comience rociando el ratón con etanol del setenta por ciento, y asegurando las patas a una tabla de disección. Usa tijeras de disección para cortar la piel aproximadamente un centímetro por encima del ano y usa fórceps dentados para levantar la piel del cuerpo.

Inserte las puntas de las tijeras entre la piel y el peritoneo y abra las tijeras para separar los tejidos antes de continuar la incisión de la piel hasta el cuello. Asegure la piel a la mesa de disección debajo de cada extremidad delantera y por encima de cada extremidad posterior, y tire del saco peritoneal hacia arriba para extender la incisión hacia el cuello. Sujete los lóbulos del hígado y corte justo debajo del esternón para permitir la disección alrededor del hígado.

A continuación, transfiera el órgano a cuatro mililitros del medio EHAA de Click. Utilice el bisturí para cortar el hígado en trozos de aproximadamente un milímetro de diámetro y digerir las piezas en quinientos microlitros de solución de digestión recién preparada y quinientos microlitros de DNase 1. Después de quince minutos a treinta y siete grados centígrados, utilice una pipeta de quinientos mililitros para mezclar los tejidos a fondo y devolver el recipiente a la incubadora durante otros quince minutos.

Al final de la incubación, transfiera la muestra digerida a través de un colador de cien micras en un tubo cónico de cincuenta mililitros y utilice el émbolo de una jeringa de un mililitro para presionar suavemente los trozos de tejido restantes a través de la malla. Lave el filtro con cinco mililitros de tampón de aislamiento y presione suavemente cualquier tejido restante a través del colador. Recoger las células hepáticas aisladas por centrifugación y volver a suspender el pellet en cuatro mililitros de tólizar de lisis de glóbulos rojos.

Después de cinco minutos a temperatura ambiente, lave las células en diez mililitros de tampón de aislamiento y cuente las células en el hemocitoómetro para determinar el recuento completo del hígado. Re-suspenda el pellet en cinco mililitros de iodixanol del veinte por ciento y superponga la suspensión celular con un mililitro de PBS. Separe las células por separación de gradiente de densidad y cosecha la capa entre el PBS y el yodoxanol.

Luego filtre las células a través de un colador de cien micrómetros en un nuevo tubo cónico de cincuenta mililitros. Lavar las células en diez mililitros de tampón de aislamiento fresco y volver a suspender el pellet resultante en quinientos microlitros de PBS, complementados con suero bovino fetal del dos por ciento, o FBS. Después de contar, alícuota aproximadamente cinco veces diez a la sexta célula no parénquima en cada control y pozo experimental de una placa de noventa y seis pozos para centrifugación y re-suspende los pellets en noventa microlitros de PBS más FBS por pozo.

Añadir los cócteles de anticuerpos primarios experimentales y de control adecuados a cada pozo y manchar todos los pozos con un marcador de viabilidad adecuado. El paso más importante en este procedimiento es la valoración adecuada de los anticuerpos y el uso de controles de tipo hielo y controles de fluorescencia-1 para validar la tinción. Después de treinta minutos a cuatro grados celsius, centrífuga lavar las células con cien microlitros de PBS más FBS por pozo y transferir las células de cada pozo a tubos individuales de citometría de flujo redondo de cinco mililitros a un volumen final de cuatrocientos microlitros de PBS más FBS por tubo.

Luego, utilice un pequeño volumen de células para ajustar el láser y los ajustes de compensación en el citometro de flujo y leer todos los eventos para cada tubo. Cuando se hayan leído todos los tubos, importe los datos en un programa de análisis de citometría de flujo adecuado. Puerta en células vivas basada en el tinte marcador de viabilidad donde la expresión negativa se considera viva.

Puerta en las células vivas basada en el tamaño y la granularidad de las células, así como su expresión de tinte marcador de viabilidad, seguido de gating en la población de células positivas CD31 negativas CD45 utilizando el control de isotipo adecuado y los datos de fluorescencia-1 para determinar las poblaciones positivas y negativas. A continuación, atraque las células positivas CD31 negativas CD45 de acuerdo con su expresión CD16/32 y podoplanina para permitir la identificación de las poblaciones positivas DE podoplaniales nómoplanina CD45 negativas CD45, CD16/32 negativo podoplanina. Las células endoteliales enfáticas expresan el vaso linfático y el hialuronano endotelial, pero no CD146.

Las células positivas CD31 positivas CD31 aisladas en hígado se aislan como se ha demostrado también son CD146 positivas y podoplanina positivas, mientras que las células negativas CD31 positivas CD31 CD16/32 son principalmente CD146 negativas y ya sea podoplanina positivas o negativas. La positividad se determinó sobre la base de la tinción por fluorescencia-1. Las células endoteliales linfáticas hepáticas son CD146 negativas y PDPN positivas.

Ni el endotelio vascular ni los macrófagos hepáticos murinos expresan podoplanina. La tinción de podoplanina también se puede utilizar para distinguir los colangiocitos de los vasos linfáticos en función de las estructuras nucleares distintivas de los conductos biliares, así como por la tinción de citoqueratina 7. Como sólo las células endoteliales linfáticas co-express receptor de factor de crecimiento vascular 3 y Próspero homeobox proteína 1 en el hígado, estos marcadores se pueden utilizar más adelante para confirmar la pureza de la población de células endoteliales linfáticas hepáticas ordenadas.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar trabajar rápidamente y mantener las células en hielo. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la clasificación de flujo de las poblaciones LEC para responder a preguntas adicionales, como la generación de perfiles transcripcionales de LEC. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología linfática específica del hígado exploraran cómo los linfáticos afectan la enfermedad hepática en ratones y humanos.

Generalmente, los individuos nuevos en este método lucharán porque las células endoteliales linfáticas son una población poco frecuente y gradual en un hígado y el método debe realizarse rápidamente.