Name: Individual Detección Molecule-Label gratis con Microtoroid ópticos Resonadores (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Aprende a detectar moléculas individuales sin etiquetas utilizando resonadores ópticos microtoroides y bloqueo de frecuencia. Este método avanzado permite estudiar plegamiento de proteínas y cinética de unión con alta sensibilidad.

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Esta investigación fue apoyada en parte por un Premio del Servicio Nacional de Investigación (T32GM07616) del Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales.

1. Configuración experimental y la preparación de muestras <ol><li> Fabrique microtoroids utilizando la litografía, el grabado, y el derretimiento de procedimiento que el descrito anteriormente 6. Fabricar microtoroids en la parte superior de una oblea de silicio (chip) que típicamente tienen un diámetro mayor de de 80-100 micras, y un diámetro menor de 2 micras. </li><li> Relájese más o menos un metro de la fibra óptica monomodo (125 revestimiento m, 4,3 m de diámetro modo de campo) de su carrete de fibra. </li><li> En el centro de la porción desenrollada de la fibra óptica, tira de un pequeño segmento (2,5 cm) del recubrimiento de polímero alrededor de la fibra óptica utilizando pelacables. Nota: Esta es la parte de la fibra óptica que se utilizará para evanescente de luz par en el microtoroid. </li><li> Limpie la fibra despojado con alcohol isopropanol y un trapo que no suelte pelusa. </li><li> Mantenga esta parte de la fibra en su lugar usando un soporte de fibra hecha de abrazaderas magnéticas. </li><li> Delgado la fibra despojado a ~ 500 nm por melting y tirando usando un soplete de hidrógeno y dos motores paso a paso que se mueven en direcciones opuestas a 60 m / min. Coloque la fibra óptica dentro de la porción superior de la llama, que debe ser ~ 10 mm de altura. Deje de tirar la fibra cuando la transmisión a través de la fibra se detiene fluctuante, que puede ser monitoreada, ya sea visualmente (mirando la luz que se dispersa lateralmente desde el abrir y cerrar de fibra de encendido y apagado) o mediante la conexión de la fibra a un fotodiodo que está unido a un osciloscopio . </li><li> Cleave un extremo de la fibra óptica y la inserta en un adaptador de fibra desnuda. Coloca este extremo de la fibra en la entrada del fotorreceptor. </li><li> Fibra acoplar el otro extremo del carrete de fibra para el láser mediante el uso de un acoplador de fibra óptica. </li><li> Coloque el chip microtoroid en la parte superior de un soporte de muestra (acero inoxidable, 37,8 mm x 6,4 mm x 3,2 mm) utilizando epoxi o cinta de doble cara. </li><li> Montar el soporte de la muestra en la parte superior de una etapa de posicionamiento que comprende de un 3-eje nano-posicionamiento (nanocube) etapa (ver lista de equipo) en la parte superior de un micrómetro de 3 ejes. Realizar todos los experimentos sobre una mesa óptica neumática aislado para minimizar las vibraciones. </li><li> Posición aproximada del chip muestra utilizando el micrómetro de 3 ejes. </li><li> Alinear la que contiene microtoroid-chip paralelo a la fibra óptica usando el nano-posicionador. Nota: Alinear el microtoroid dentro de una distancia de una longitud de onda de la luz de entrada (~ 633 nm). Para la visualización de este proceso de usar dos columnas de imagen (tubo con lente objetivo y la cámara, ver la lista de equipo) colocado en la parte superior y en el lado del chip. </li><li> Optimizar la polarización de la luz láser dirigido a través de la fibra óptica que utiliza un controlador de polarización en línea (ver lista de equipo) con un mando para ajustar la polarización. Nota: la polarización óptimo se consigue cuando el dip medido en la transmisión de la fibra óptica aparece el más estrecho. Observar esta inmersión en un osciloscopio (consulte el paso 2.2 para más detalles). </li><li> Construiruna cámara de muestra por epoxying un cubreobjetos de vidrio sobre la etapa de la muestra usando un portaobjetos de vidrio como un espaciador. Nota: Un recinto de plexiglás que cubre toda la configuración puede ser útil para minimizar las corrientes de aire. Una pequeña abertura debe dejarse para permitir la solución para ser bombeada en el uso de tubos. </li><li> Térmicamente equilibre suspensiones de partículas o soluciones acuosas de una sola molécula de ≥ 1 hora en un baño de agua RT (~ 500 ml). Nota: Las muestras se diluyeron a la concentración deseada en tubos de microcentrífuga utilizando los buffers asociados especificados por el fabricante, por ejemplo, PBS o HEPES. Si no se detectan eventos de unión, aumentar la concentración de sal del tampón. </li><li> Partícula Vortex contiene soluciones (1 ml) brevemente durante ~ 2 seg. </li><li> Inyectar las soluciones de partículas que contiene en la cámara de muestra a 1 ml / min utilizando una bomba de jeringa 1 ml. </li><li> Después de la cámara de la muestra ha llenado, apague la bomba de jeringa. </li><li> Espere 30 segundos antes de la grabación de datos para reducir al mínimolos efectos de las vibraciones mecánicas que resultan de flujo de fluido que puede afectar a la medición. </li></ol> 2. Frecuencia de bloqueo <ol><li> Re-acoplar el toroide a la fibra óptica moviendo el soporte de la muestra con el nanopositioner, debido a que el acoplamiento se verá perturbada debido a la inyección de fluido. </li><li> Ubicar la longitud de onda de resonancia de la microtoroid mediante el escaneo de láser de entrada controlada por ordenador a través de una variedad de longitudes de onda. Realice este paso mediante el envío de una señal de tensión de forma de onda triangular de un elemento piezoeléctrico dentro del controlador de láser que regula la longitud de onda del láser. Realizar experimentos usando la luz visible (635 nm ± 2,5 nm), ya que es baja absorción de la luz en el agua en esta longitud de onda. </li><li> Medir la transmisión de la luz a través de la fibra óptica conectando la salida de la fibra óptica en una fotorreceptor auto-equilibrado. Enchufe la salida del fotorreceptor en un osciloscopio mediante un cable BNC. Observar on el osciloscopio que en la longitud de onda de resonancia de la microtoroid, transmisión a través de la fibra óptica gotas. </li><li> Conecte la salida del fotorreceptor a la entrada principal de la frecuencia de bloqueo de controlador de realimentación (ver lista de equipo) a través de un cable. </li><li> Ejecute el controlador de realimentación de frecuencia de bloqueo en el modo de bloqueo automático usando el pico más alto de bloqueo con una frecuencia de oscilación de 2 kHz y una amplitud de onda de oscilación de 19 fm. Empíricamente establecer la configuración proporcional-integral-derivados en la ventana del software usando reglas de ajuste de Ziegler-Nichols 14. Nota: Estos valores sólo deben fijarse una vez al comienzo de todos los experimentos. </li><li> Auto-bloqueo de la longitud de onda del láser a la longitud de onda de resonancia de la microtoroid. Realice este paso después de llenar la cámara de muestra. Nota: Si el cambio de longitud de onda es demasiado grande, entonces el controlador de realimentación perderá bloqueo y cambia automáticamente a modo de exploración con el fin de localizar la ubicación de longitud de onda de resonancia. Este occurs de longitud de onda desplaza más grande que aproximadamente una anchura de línea (al menos 600 fm para todos los sistemas investigados aquí). </li><li> Registre la salida del controlador de retroalimentación a 20 kHz usando una tarjeta de adquisición de datos de 24 bits. Exportar los datos como un archivo de texto a través del software de adquisición de datos. </li></ol> 3. Procesamiento de Datos y Análisis <ol><li> Transformada de Fourier de los datos en MATLAB. </li><li> Paso Bajo los datos utilizando un filtro de &quot;ladrillo-pared&quot; con un corte a 1 kHz para eliminar la frecuencia de oscilación impuesto de 2 kHz (ver Código Suplementario Captura de pantalla 1 archivo). </li><li> Muesca Computacionalmente filtrar los datos utilizando un tamaño de ventana de 16 Hz. Nota: Esto se hace para eliminar las fuentes conocidas de ruido, en este caso, 60 Hz ruido en la línea electrónica y sus armónicos, además de 100 Hz (viniendo desde el controlador de láser) y sus armónicos (ver Código Suplementario Captura de pantalla 1 archivo). </li><li> Fourier transformada inversa de los datos de nuevo en el dominio del tiempo. </li><li> Filtro de mediana de los datos utilizando una ventanatamaño de 1.001 muestras (ver Código Suplementario de pantalla 2 archivos). </li><li> Busque cambios de paso en la longitud de onda de resonancia utilizando el algoritmo paso a la búsqueda de Kerssemakers et al. 15. </li><li> Generar histogramas de la amplitud de cada etapa de unión. </li><li> Calcular el tamaño de partícula medio de la ecuación. (1) (ver Discusión). </li></ol>

<ol><li>Lu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+sensitivity+nanoparticle+detection+using+optical+microcavities%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">High sensitivity nanoparticle detection using optical microcavities.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 5976-5979 (2011).</li>
<li>Su, J., Goldberg, A. F. G., Stoltz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+detection+of+single+nanoparticles+and+biological+molecules+using+microtoroid+optical+resonators%5BTitle%5D)+AND+%22Light%3A+Science+and+Applications%22%5BJournal%5D)">Label-free detection of single nanoparticles and biological molecules using microtoroid optical resonators.</a> Light: Science and Applications. , (2016).</li>
<li>Knight, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKnight%2C+A+%22Single+molecule+biology%22">Single molecule biology</a>. , Elsevier/Academic. (2009).</li>
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<li>Vollmer, F., Arnold, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whispering-gallery-mode+biosensing%3A+label-free+detection+down+to+single+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Whispering-gallery-mode biosensing: label-free detection down to single molecules.</a> Nat. Methods. 5, 591-596 (2008).</li>
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<li>Vahala, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+microcavities%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Optical microcavities.</a> Nature. 424, 839-846 (2003).</li>
<li>Arnold, S., Khoshsima, M., Teraoka, I., Holler, S., Vollmer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shift+of+whispering-gallery+modes+in+microspheres+by+protein+adsorption%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Shift of whispering-gallery modes in microspheres by protein adsorption.</a> Opt. Lett. 28, 272-274 (2003).</li>
<li>Vollmer, F., Arnold, S., Keng, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+virus+detection+from+the+reactive+shift+of+a+whispering-gallery+mode%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Single virus detection from the reactive shift of a whispering-gallery mode.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 20701-20704 (2008).</li>
<li>He, L., Ozdemir, S. K., Zhu, J., Kim, W., Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+single+viruses+and+nanoparticles+using+whispering+gallery+microlasers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Nano%22%5BJournal%5D)">Detecting single viruses and nanoparticles using whispering gallery microlasers.</a> Nat Nano. 6, 428-432 (2011).</li>
<li>Dantham, V. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+detection+of+single+protein+using+a+nanoplasmonic-photonic+hybrid+microcavity%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Label-free detection of single protein using a nanoplasmonic-photonic hybrid microcavity.</a> Nano Lett. 13, 3347-3351 (2013).</li>
<li>Baaske, M. D., Foreman, M. R., Vollmer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+nucleic+acid+interactions+monitored+on+a+label-free+microcavity+biosensor+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Single-molecule nucleic acid interactions monitored on a label-free microcavity biosensor platform.</a> Nat Nanotechnol. 9, 933-939 (2014).</li>
<li>Su, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-Free+Single+Exosome+Detection+Using+Frequency-Locked+Microtoroid+Optical+Resonators%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Photonics%22%5BJournal%5D)">Label-Free Single Exosome Detection Using Frequency-Locked Microtoroid Optical Resonators.</a> ACS Photonics. (9), 1241-1245 (2015).</li>
<li>Åström, K. J., Murray, R. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3a%C3%85str%C3%B6m%2C+KJ+%22Feedback+systems+%3A+an+introduction+for+scientists+and+engineers%22">Feedback systems : an introduction for scientists and engineers</a>. , Princeton University Press. (2008).</li>
<li>Kerssemakers, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+dynamics+of+microtubules+at+molecular+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Assembly dynamics of microtubules at molecular resolution.</a> Nature. 442, 709-712 (2006).</li>
<li>Su, T. -T. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Label-free+detection+of+single+biological+molecules+using+microtoroid+optical+resonators%22">Label-free detection of single biological molecules using microtoroid optical resonators</a>. , California Institute of Technology. (2014).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Como una partícula se une, la longitud de onda de resonancia (λ) del toroide aumenta. Si una partícula desenlaza, la longitud de onda de resonancia disminuye correspondientemente (un evento de bajada). El diámetro de partícula (d) se puede determinar a través de histogramas de la amplitud de cada paso de longitud de onda. La altura de cada paso de longitud de onda varía debido a las variaciones de tamaño de la partícula atado y debido a la ubicación en la microtoroid donde la partícula se une. El cambi...

Experimentos de detección de moléculas individuales son útiles para reducir la cantidad de analito utilizado en biosensores, para la detección precoz de la enfermedad, y para examinar las propiedades fundamentales de moléculas 3. Tales experimentos se realizan normalmente usando etiquetas, sin embargo, las etiquetas no siempre son posibles de obtener para una proteína particular, aumentar el costo, puede perturbar los eventos están estudiando, y puede ser un inconveniente, sobre todo por el tiempo real en el sitio experimentos o punto-de- diagnósticos de atención. El estándar de oro actual de biosensor libre de etiquetas es resonancia de plasmón superficial 4, sin embargo los sistemas comercial resonancia de plasmón superficial tienen típicamente un límite inferior de detección típica del orden de nM. Recientemente, resonadores ópticos han emergido como una tecnología prometedora para la etiqueta libre sola molécula biodetección 5. Resonadores ópticos trabajo basado en los de largo plazo (ns) confinamiento de la luz 6,7. La luz es evanescentejunto a estos dispositivos normalmente a través de una fibra óptica. Cuando la longitud de onda de la luz que pasa a través de la fibra coincide con la longitud de onda de resonancia del resonador, de manera eficiente la luz se acopla al resonador. Esta luz acoplada refleja totalmente internamente dentro de la cavidad del resonador generar un campo evanescente en la proximidad de la circunferencia del resonador. Como partículas entran en el campo evanescente y se unen al resonador, la longitud de onda de resonancia de los cambios de resonador en proporción al volumen de la partícula 8. En términos de capacidad de detección, resonadores de microesferas anterior se han utilizado para detectar solo la influenza A partículas de virus (100 nM) 9,10. Recientemente, resonadores ópticos mejorada plasmonically en microesferas se han utilizado para detectar el suero de albúmina bovina sola moléculas de oligonucleótidos 11 y 8-mer 12, sin embargo, este enfoque limita el área de captura de partículas de 0,3 micras por 2 devicio. Grandes biosensores zona de captura son ideales para maximizar la posibilidad de detección de partículas. Las tecnologías actuales basados ​​en soluciones de etiqueta libre de biosensores con grandes (&gt; 100 m 2) zonas de captura se han limitado a la detección de partículas de poliestireno ≥ 25 nm. Hemos desarrollado un sistema biosensor etiqueta gratuito basado en la tecnología resonador óptico conocido como Frecuencia Bloqueo óptico Whispering Evanescent Resonador (FLOR) 13 (Figura 1) que es capaz de detectar de resolución temporal de las moléculas individuales en solución. FLOR utiliza la larga vida útil de fotones de resonadores ópticos microtoroid combinados con una frecuencia de bloqueo de control de retroalimentación, detección equilibrada, y filtrado de cómputo para detectar partículas pequeñas a moléculas de proteínas individuales. El uso de la frecuencia de bloqueo permite que el sistema para rastrear siempre la resonancia desplazamiento de la microtoroid como partículas se unen, sin la necesidad de barrer o escanear la longitud de onda láser sobregrandes rangos. Los principios de la FLOR pueden utilizarse para mejorar las capacidades de detección de otras técnicas que incluyen la mejora plasmónica. En lo que sigue, se describen los procedimientos para realizar FLOR.

<table><tbody><tr><td>Láser de diodo sintonizable</td><td>Newport</td><td>TLB-6300</td><td></td></tr><tr><td>Controlador láser</td><td>Newport</td><td>TLB-6300-LN</td><td></td></tr><tr><td>Controlador de retroalimentación de bloqueo de frecuencia</td><td>Toptica Photonics</td><td>Digilock 110</td><td></td></tr><tr><td>Fotorreceptor autobalanceado</td><td>Newport</td><td>Modelo 2007</td><td></td></tr><tr><td>Controlador de polarización en línea</td><td>General Photonics</td><td>PLC-003-S-90</td><td></td></tr><tr><td>Tarjeta de adquisición de datos de 24 bits</td> National <td>Instruments</td><td>NI-PCI-4461</td><td></td></tr><tr><td>Interleucina-2 humana recombinante</td><td>Pierce Biotechnology</td><td>R201520</td><td></td></tr><tr><td>perlas de poliestireno de 20 nm</td><td>Thermo Scientific</td><td>3020A</td><td></td></tr><tr><td>NanoCube XYZ Piezo Stage</td><td>Physik Instrumente</td><td>P-611.3</td><td></td></tr><tr><td>Mesa óptica</td><td>Newport</td><td>VH3660W-OPT</td><td></td></tr><tr><td>Lente de objetivo para columna de imagen</td><td>Navitar Machine Vision</td><td>1-60228</td><td></td></tr><tr><td>Columna de imagen (tubo adaptador)</td><td>Navitar Machine Vision</td><td>1-60228</td><td></td></tr><tr><td>Cámara CCD de alta resolución para columna de imagen</td><td>Edmund Industrial Optics</td><td>NT39244</td><td></td></tr></tbody></table>

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Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

La detección de pequeñas concentraciones de moléculas hasta el límite de una sola molécula tiene impacto en áreas como la detección precoz de la enfermedad, y los estudios fundamentales sobre el comportamiento de las moléculas. Técnicas individuales de detección molécula comúnmente utilizan etiquetas como etiquetas fluorescentes o puntos cuánticos, sin embargo, las etiquetas no siempre están disponibles, aumentar el costo y la complejidad, y pueden perturbar los eventos están estudiando. Resonadores ópticos han surgido como un medio prometedor para detectar moléculas individuales sin el uso de etiquetas. Actualmente la partícula más pequeña detectada por un sistema resonador óptico no mejorada plasmonically desnudo en solución es un poliestireno esfera 25 nm 1. Hemos desarrollado una técnica conocida como frecuencia de bloqueo óptico Whispering Evanescent Resonador (FLOR) que puede superar este límite y lograr sola detección de moléculas de etiqueta libre en solución acuosa 2. Como fuerza de la señal escalas con el volumen de partículas, nuestro trabajo representa un&gt; improveme 100xnt en la relación señal a ruido (SNR) sobre el estado actual de la técnica. Aquí los procedimientos detrás FLOR se presentan en un esfuerzo por aumentar su uso en el campo.

Eventos de unión de partículas se ven claramente como cambios de paso-como en la longitud de onda de resonancia de la microtoroid lo largo del tiempo (Figura 2). Las alturas de estos pasos se muestran como un histograma en la Figura 2B. Figuras 2-4 muestran trazas representativas de la unión de los exosomas (nanovesículas), perlas de sílice 5 nm y solteras humanos interleucina-2 moléculas, respectivamente. El hecho de que los eventos escalonadas escala ...

Hemos desarrollado un sistema de biodetección sin etiquetas basado en la tecnología de resonador óptico conocido como Resonador Evanescente Susurrante Óptico de Bloqueo de Frecuencia (FLOWER) que es capaz de detectar moléculas individuales en solución. Aquí se describen y presentan los procedimientos detrás de este trabajo.

Individual Detección Molecule-Label gratis con Microtoroid ópticos Resonadores

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

El objetivo general de este procedimiento es detectar moléculas individuales y nanopartículas ultra pequeñas sin utilizar etiquetas, mediante una técnica basada en tecnología de resonador óptico y bloqueo de frecuencia. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en campos bioquímicos, como el plegamiento de proteínas y la cinética de unión. La principal ventaja de esta técnica es que no es necesario etiquetar la molécula diana para poder detectarla.La configuración para esta técnica implica acoplar un chip micro OID a una fibra óptica. Primero, obtenga un chip micro OID. Este es un chip de silicio de aproximadamente 6,5 milímetros por 5,5 milímetros con un micro OID fabricado en él.Como en esta imagen, el micro OID tiene un diámetro mayor de 80 a 100 micrómetros y un diámetro menor de dos micrómetros. Por ahora, deje el chip a un lado y prepare la fibra para acoplar el chip. Trabaje con fibra monomodo en un carrete y desenrolle aproximadamente un metro de la fibra.Obtenga pelacables y colóquelos aproximadamente en el centro de la fibra desenrollada. Utilícelos para retirar un segmento de 2,5 centímetros del revestimiento polimérico de la fibra. Esta región expuesta es la

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Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Biosensores interactuar con entornos complejos, biológicos y realizar una detección selectiva mediante la combinación de sensores altamente sensibles con sondas muy específicas que figuran en el sensor a través de modificación de la superficie. Aquí, se demuestra la funcionalización de la superficie de los sensores ópticos de sílice con biotina utilizando agentes de acoplamiento de silano para reducir el sensor y el entorno biológico.

Colocación de sondas biológicas de biosensores ópticos de silicio mediante agentes de acoplamiento de silano

Se describe la utilización de una técnica de dióxido de carbono reflujo láser para fabricar cavidades resonantes de sílice, incluyendo independiente microesferas y microtoroids en el chip. El método de reflujo elimina imperfecciones de la superficie, permitiendo largos tiempos de vida de fotones dentro de ambos dispositivos. Los dispositivos resultantes tienen factores de ultra alta calidad, permitiendo a las aplicaciones que van desde las telecomunicaciones a biodetección.

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