Individual Detección Molecule-Label gratis con Microtoroid ópticos Resonadores
29 de diciembre de 2015
Hemos desarrollado un sistema de biodetección sin etiquetas basado en la tecnología de resonador óptico conocido como Resonador Evanescente Susurrante Óptico de Bloqueo de Frecuencia (FLOWER) que es capaz de detectar moléculas individuales en solución. Aquí se describen y presentan los procedimientos detrás de este trabajo.
El objetivo general de este procedimiento es detectar moléculas individuales y nanopartículas ultra pequeñas sin el uso de etiquetas utilizando una técnica basada en la tecnología de resonador óptico y bloqueo de frecuencia. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en campos bioquímicos como el plegamiento de proteínas y la cinética de unión. La principal ventaja de esta técnica es que no es necesario marcar la molécula objetivo para detectarla.
La configuración para esta técnica implica el acoplamiento de un chip micro OID a una fibra óptica. Primero, obtenga un micro chip OID. Se trata de un chip de silicio de aproximadamente 6,5 milímetros por 5,5 milímetros con un micro OID fabricado en él.
Como en esta imagen, el micro OID tiene un diámetro mayor de 80 a 100 micrómetros y un diámetro menor de dos micrómetros. Por ahora, deja el chip a un lado y prepara la fibra para acoplar el chip. Trabaje con fibra monomodo en un carrete y desenrolle aproximadamente un metro de la fibra.
Consigue pelacables y aproximadamente en el medio de la fibra de desenrollado. Utilícelos para quitar un segmento de 2,5 centímetros del recubrimiento de polímero de la fibra. Esta región pelada es la región de acoplamiento de la fibra.
Después de quitar la fibra, use una toallita sin pelusa y alcohol isopropanol para limpiar la región pelada. A continuación, use un soporte de fibra con abrazaderas magnéticas para mantener la parte limpia en su lugar. Para el siguiente paso, tenga motores paso a paso dispuestos para tirar de la fibra en direcciones opuestas.
Coloque el soporte de fibra para permitir la conexión de los motores paso a paso a la fibra a cada lado de la región pelada. Además, conecte un láser a un extremo de la fibra para que sirva como fuente de luz. Encienda los motores paso a paso moviéndose en direcciones opuestas para estirar la fibra y use un soplete de hidrógeno para derretir la parte despojada de la fibra.
Controle constantemente la luz dispersada lateralmente desde la fibra. El parpadeo indica que la transmisión de luz a través de la fibra fluctúa y se necesita un mayor adelgazamiento. Cuando cese el parpadeo, deje de calentar y tirar de la fibra, que habrá sido delgada a unos 500 nanómetros.
Una vez que la fibra se haya adelgazado, separe la fuente de luz y retire la fibra y su soporte de abrazadera magnética de los motores rebeldes. A continuación, mueva la fibra a un banco aislado neumáticamente equipado con la etapa de posicionamiento. Coloque la fibra en su soporte de abrazadera magnética en un bloque de soporte frente al chip de muestra.
La etapa de posicionamiento es una etapa de nanoposicionamiento de tres ejes sobre un micrómetro de tres ejes. Además de la etapa de nanoposicionamiento, hay columnas de imágenes de vista superior y lateral para ayudar con la alineación. Continúe trabajando con la fibra asegurándose de que la parte pelada esté cerca de la etapa de posicionamiento.
Prepárese para introducir el extremo libre de fibras en el sistema de medición. Después de cortar el extremo libre, insértelo en un adaptador de fibra desnuda. Utilice el adaptador para conectar la fibra a la entrada de un receptor de fotos autobalanceado conectado a un osciloscopio.
Ahora concéntrate en el otro extremo de la fibra. Primero, conecte este extremo a un acoplador óptico. Luego, acople la fibra a la salida de un polarizador en línea, que tiene entrada de un divisor de haz 50 50 y un láser de diodo sintonizable ATT.
He aquí un esquema de las conexiones hechas hasta este punto. Tenga en cuenta que la segunda salida del divisor de haz pasa a través de un polarizador en línea y se utiliza como referencia para el receptor de fotos autobalanceado. El siguiente paso es prepararse para montar el chip micro OID utilizando un portamuestras de acero inoxidable.
Utilice cinta adhesiva de doble cara para asegurar el chip al portamuestras. A continuación, coloque el microchip encima del portamuestras. Ahora monte el soporte de muestras con el chip en la parte superior de la etapa de posicionamiento nano.
Aquí, el soporte y el chip están en su lugar en la etapa de posicionamiento con el micrómetro de tres Xs. Posición gruesa, el chip de muestra con respecto a la fibra. Aquí están el chip y la fibra después de que se haya completado el posicionamiento del curso.
A continuación, ajuste aún más el posicionador y use las columnas de imágenes para alinear el chip paralelo a la fibra óptica Con un micro OID con una longitud de onda láser de la fibra, esta imagen es de una fibra y microt. Después del paso de posicionamiento fino, la pegatina circular cerca del centro del campo de visión es una ayuda de posicionamiento. Ahora pasa a buscar la longitud de onda de resonancia del micro.
Genere una señal de voltaje de forma de onda triangular para regular la longitud de onda del láser a aproximadamente 635 nanómetros más o menos 2,5 nanómetros. Ahora escanea las longitudes de onda para buscar la resonancia. Observe la transmisión a través de la fibra en el osciloscopio.
Tenga en cuenta que en la longitud de onda de resonancia, la transmisión disminuye. En este punto, trabaje para ajustar la polarización de la luz láser. Ajuste los controladores de polarización en línea para optimizar la polarización de la luz láser en la fibra óptica.
Visualice la salida del receptor fotográfico con el osciloscopio y ajuste la polarización hasta que la caída de transmisión medida parezca más estrecha. Después de optimizar la polarización, construya una cámara de muestra. En la etapa de muestra.
La cámara consiste en una cubierta de vidrio que desliza epoxi a una pieza de microscopio. Diapositiva. La corredera actúa como un espaciador, lo que permite que el cubreobjetos sobresalga del chip y la fibra. Coloque una bomba de jeringa de un mililitro y un tubo para introducir las muestras experimentales en la cámara a un mililitro por minuto.
A continuación, obtenga una muestra equilibrada a temperatura ambiente de un mililitro para cargarla en la bomba. En este caso, se trata de una solución con perlas de sílice de cinco nanómetros. Una vez cargada, observe la cámara de muestras e inyecte la muestra Deteniéndose cuando la cámara está llena, la inyección de muestra se ha detenido en esta cámara, que se llena con una solución que contiene perlas de sílice de cinco nanómetros.
Después de esperar 30 segundos para minimizar el efecto de la vibración, busque la longitud de onda de resonancia del micro. Nuevamente, observe la caída y la transmisión a través de la fibra en resonancia usando el osciloscopio. Este es un esquema de la configuración experimental en este punto, incluyendo la derivada integral proporcional o el controlador PID.
El integrador y el tramado. Ejecute el controlador en modo de bloqueo automático con bloqueo en la parte superior de los picos. Establezca la frecuencia de tramado en dos kilohercios y establezca la amplitud de oscilación de la longitud de onda en 19 femto metros.
Después de encontrar empíricamente la configuración de PID, bloquea automáticamente la longitud de onda del láser a la longitud de onda de resonancia del microoide. Recopile datos mediante el registro de la salida del controlador de retroalimentación. A continuación se muestran trazas representativas del cambio de resonancia en femtometros frente al tiempo en segundos producidas con un protocolo que utiliza tres partículas de unión diferentes en orden de tamaño.
Las partículas son exosomas o nano vesículas. Perlas de sílice de cinco nanómetros e interleucina humana dos moléculas. Tenga en cuenta las diferentes escalas de los EA verticales y horizontales en cada conjunto de datos.
La observación de diferentes escalas en los datos para diferentes tamaños de partícula es una indicación de que la técnica se ha realizado correctamente. Cuando una partícula se une al oid, la longitud de onda de resonancia del OID aumenta, lo que provoca un aumento en la traza. Cuando una partícula se desune, la longitud de onda de resonancia disminuye, lo que lleva a un descenso.
La altura de cada paso de la longitud de onda está determinada por el tamaño de la partícula y su posición en el microoide. Las escalas de tiempo están determinadas por la dinámica del OID de la partícula Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en unas tres horas si se hace correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar mantener todo lo más limpio y libre de polvo posible.
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Descripción general
Este artículo presenta un sistema de biosensado sin marcado que utiliza la tecnología de Resonador de Susurro Evanescente Óptico con Bloqueo de Frecuencia (FLOWER) para la detección de moléculas individuales en solución. El método descrito permite la detección de nanopartículas extremadamente pequeñas sin necesidad de marcado, abordando preguntas importantes en la investigación bioquímica.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- bioquímica
- nanotecnología
- detección óptica
Antecedentes
- La detección de moléculas individuales es fundamental para comprender los procesos bioquímicos.
- Los métodos tradicionales a menudo requieren etiquetado, lo cual puede alterar el comportamiento de las moléculas.
- La tecnología de resonadores ópticos ofrece un enfoque novedoso para la biosensación.
- El bloqueo de frecuencia mejora la sensibilidad y la especificidad en la detección.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método para detectar moléculas individuales sin etiquetas.
- Mejorar la comprensión de la cinética del plegamiento y la unión de proteínas.
- Proporcionar una técnica confiable para el análisis bioquímico.
Métodos Utilizados
- Uso de un chip microscópico OID acoplado a una fibra óptica.
- Bloqueo de frecuencia para mejorar las capacidades de detección.
- Detección sin marcadores de moléculas diana.
- Configuración experimental que involucra la fabricación de micro OID de silicio.
Resultados principales
- Detección exitosa de moléculas individuales en solución.
- Demuestra las ventajas del biosensado sin marcadores.
- Información sobre el comportamiento de nanopartículas ultrapequeñas.
- Aplicaciones potenciales en diversos campos bioquímicos.
Conclusiones
- El sistema FLOWER representa un avance significativo en la tecnología de biosensores.
- La detección sin marcado abre nuevas vías para la investigación en bioquímica.
- Este método puede facilitar estudios adicionales sobre interacciones moleculares.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La detección sin etiqueta de moléculas individuales mediante resonadores ópticos microtoroides aborda un cuello de botella crítico en las fases iniciales del descubrimiento, al permitir mediciones directas y no perturbadoras de interacciones moleculares. Esta capacidad mejora la confianza predictiva en la validación de dianas y en estudios mecanicistas, apoyando decisiones de cartera ajustadas al riesgo. La sensibilidad y el funcionamiento sin etiqueta de la técnica FLOWER la posicionan como una plataforma reutilizable para puntos de inflexión de alto valor en I+D.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la interrogación directa de la unión molecular y el plegamiento sin artefactos inducidos por etiquetas.
- Apoya la desestimación mecanicista al proporcionar detección cuantitativa en tiempo real de eventos de molécula individual.
- Mejora la confianza predictiva en la interacción con el objetivo y el análisis de vías.
Desarrollo de pruebas y cribado
- Facilita la preparación de sistemas de ensayo validados y libres de marcadores para cribado de compuestos en etapas posteriores.
- Proporciona lecturas cuantitativas y reproducibles adecuadas para la estandarización entre equipos de descubrimiento.
- Permite la evaluación rápida de interacciones moleculares para determinar su idoneidad y escalabilidad en cribados.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Proporciona continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica al permitir la detección de biomoléculas relevantes para la enfermedad.
- Se alinea con las estrategias traslacionales de biomarcadores al posibilitar una detección sensible y sin marcadores en matrices complejas.
- Reduce el riesgo biológico en la etapa preclínica mediante mediciones robustas y libres de artefactos.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método FLOWER se integra en la interfaz entre el descubrimiento temprano y la identificación de compuestos activos, apoyando la comprobación de hipótesis y la validación mecanicista antes de la transición preclínica.
- Biología del Descubrimiento: Impulsa la investigación basada en hipótesis al permitir la medición directa de eventos moleculares.
- Selección: Proporciona salidas cuantitativas listas para ensayos que permiten una evaluación fiable de compuestos.
- Análisis: Genera datos de desplazamiento de resonancia con alta relación señal-ruido para el análisis comparativo de eventos de unión.
- Investigación Traducional: Facilita la alineación de biomarcadores y la continuidad entre las fases de descubrimiento y preclínica.
- Reutilización Empresarial: Ofrece una plataforma escalable de detección sin marcadores, adaptable a diversos objetivos moleculares.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en la validación de objetivos.
- Valor operativo: Estandariza los flujos de trabajo de detección y mejora la reproducibilidad entre los equipos de I+D.
- Valor estratégico: Permite tomar decisiones informadas de avance o interrupción y mejora la eficiencia del capital al reducir los riesgos biológicos en fases avanzadas.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo y el avance de activos de descubrimiento.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en la configuración de resonadores ópticos y alineación de precisión.
- Exige acceso a instrumentación especializada, incluidos chips de microtoroide y controladores de bloqueo de frecuencia.
- Necesita una limpieza rigurosa y control del polvo para mantener la sensibilidad.
- Puede requerir adaptación para diferentes objetivos moleculares o matrices de muestra.
- El rendimiento operativo y la escalabilidad dependen de la competencia técnica y la infraestructura.
