Análisis cuantitativo de la expresión de la proteína para el Estudio de la especificación del linaje de ratón de preimplantación de embriones

El objetivo general de este protocolo es cuantificar los niveles de proteínas in situ en embriones preimplantacionales de ratón. Por lo tanto, este método nos permite realizar análisis de alto rendimiento de imágenes de microscopía confocal con resolución de una sola célula de forma semiautomática. Este método se puede utilizar para cuantificar las concentraciones de proteínas en imágenes confocales donde hay una alta densidad nuclear y cuando se desea estudiar heterogeneidades dentro de las poblaciones celulares.

Para empezar, utilice una llama abierta en una pipeta pasteur de vidrio para dibujar un extremo capilar en la punta. Frote suavemente el extremo más alejado de la pipeta contra el capilar para romperlo y crear un extremo romo. Después de sacrificar una rata hembra preñada en el día embrionario deseado de desarrollo, exponga las vísceras abdominales de acuerdo con el protocolo de texto y localice el útero.

Sostenga el extremo cervical, corte a través del cuello uterino y tire suavemente hacia arriba para estirar ambos cuernos uterinos. Recorta la grasa, teniendo cuidado de no perforar la pared uterina. Se corta por encima de los oviductos, por debajo de los ovarios, para liberar todo el útero, y se coloca en una placa de Petri.

A continuación, cubra el útero con PBS y separe ambos cuernos uterinos cortando el extremo proximal a ambos lados del cuello uterino. A continuación, separa cada oviducto del útero cortando por debajo del istmo que los conecta. Bajo un microscopio de disección, use una jeringa de un mL con una aguja hipodérmica para eliminar los blastocistos del útero y colocarlos en el medio de manipulación, forzando 0.5-1 mL de medio a través de cada cuerno desde la abertura cervical.

Espere hasta uno o dos minutos para que los blastocistos se hundan hasta el fondo del plato después de tirar de la cadena. A continuación, localice los blastocistos y, utilizando la pipeta pasteur de vidrio controlada por la boca con un extremo capilar, recoja los blastocistos y transfiéralos a una gota fresca de medio. Después de enjuagar los blastocistos, elimine la zona pelúcida usando la solución ácida de Tyrode para lavar brevemente los embriones.

Tan pronto como la zona ya no sea visible, transfiera los blastocistos de nuevo al medio de manipulación. Lave los blastocistos en PBS a temperatura ambiente y fíjelos transfiriéndolos a 4% de PFA en PBS durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después de la fijación, transfiera los blastocistos de nuevo a PBS para su almacenamiento a cuatro grados Celsius.

Después de llevar a cabo la inmunofluorescencia de acuerdo con el protocolo de texto, use una pipeta de boca fina para hacer microgotas de PBS o solución de tinción nuclear en la superficie de vidrio de un plato con fondo de vidrio de 35 mm y cúbralas con aceite mineral. Coloque los embriones en las microgotas y colóquelos de manera consistente, preferiblemente con el acceso a la cavidad ICM paralelo a la superficie del vidrio, luego coloque el plato en el soporte del microscopio. Para llevar a cabo la obtención de imágenes confocal, utilice la potencia láser más baja que proporcione una fuerte relación señal-ruido sin blanquear los fluoróforos.

Ajuste la ganancia y el off set para obtener el rango dinámico más amplio sin sobreexponer la muestra. La captura de la mayor parte o de todo el rango de escala de grises facilitará la detección de pequeñas diferencias de intensidad entre las imágenes. Siga los detalles adicionales descritos en el protocolo de texto para obtener imágenes de embriones en todo el eje Z.

Siga la interfaz gráfica de usuario de la herramienta de segmentación basada en MATLAB Modular Interactive Nuclear Segmentation, o MINS, para cargar una imagen confocal o una pila Z completa de datos sin procesar generados por el microscopio. Para ver el resultado de cada paso, haga clic en el botón "Ver" correspondiente. Una etiqueta amarilla sobre el botón indica que se está llevando a cabo una operación en curso.

Una etiqueta verde indica que la operación se ha completado. Evalúe el resultado del paso de detección antes de proceder a la segmentación. Si no es satisfactorio, modifique los parámetros de detección y vuelva a ejecutarlo.

Desde el menú de ejecución "Modo por lotes", haga clic en Agregar archivos"y cargue todos los archivos que se procesarán a la vez. Haga clic en "Iniciar ejecución del modo por lotes" y deje tiempo para que el software procese los archivos. La salida de la segmentación se guardará en el mismo directorio que los archivos originales.

Identificar falsos positivos como vesículas apoptóticas u otros elementos que no son núcleos intactos pero que pueden haber sido identificados como tales por MINS. Elimine los registros correspondientes a los falsos positivos de las estadísticas de estrellas. Archivo CSV.

Conserve el archivo de starstatistics. csv original para referencia futura y edite solo una copia del mismo. Si un núcleo ha sido sobresegmentado y presentado como dos o más núcleos, combine los registros promediando su nivel de intensidad, o mantenga uno de los registros de esa célula y descarte el resto.

Para resolver la segmentación, identifique los eventos en los que MINS no ha podido detectar el borde entre dos o más núcleos y los ha segmentado como uno solo, o en los que no ha podido detectar un núcleo por completo. Utilice ImageJ para medir el nivel de gris promedio de cada canal en las celdas inferiores o sin segmentar. A continuación, encuentre una sección medial del núcleo inferior o no segmentado en el canal de ADN, utilizando la herramienta de selección a mano alzada, delinee el perímetro del núcleo inferior o no segmentado.

Luego, presione Control M" o vaya al menú Analizar" y seleccione Medir"Esto registrará el valor medio de gris para el área delineada y lo mostrará en una nueva ventana. Usando la misma área delineada que se acaba de seleccionar en el canal de ADN, repita la medición de cada uno de los canales de fluorescencia de interés. Los resultados se invertirán con respecto al anterior en la ventana de resultados de las mediciones.

A continuación, utilice las mediciones obtenidas para reemplazar los registros erróneos en el archivo starstatistics. csv. Si el núcleo ha sido subsegmentado, duplique su fila, asigne diferentes ID de celda a cada nueva celda e introduzca los valores obtenidos en ImageJ en la columna correspondiente.

En este caso, ambas celdas compartirán coordenadas espaciales. Cuando los núcleos mitóticos se vayan a considerar por separado en el análisis, puntúrelos manualmente y agregue la información al archivo de datos. Consulte el protocolo de texto para obtener instrucciones adicionales de procesamiento de imágenes.

Esta figura muestra ejemplos de blastocistos intactos en diferentes etapas con una cavidad expandida. Aquí se muestran ejemplos de buenos anticuerpos para una serie de proteínas nucleares, incluidas CDX2, GATA4, GATA6, NANOG y OCT4. Esta muestra fue marcada con la proteína citoplasmática DAB2 que proporciona una alta relación señal-ruido.

En este panel, se muestran ejemplos de una mala tinción para GATA4 con una baja relación señal-ruido, donde las muestras solo se fijaron durante 10 minutos. Este anticuerpo anti-GATA4 en particular requiere fijación durante la noche para proporcionar una señal fuerte. Estos embriones fueron fotografiados con un objetivo de inmersión en aceite de 40x con una NA de 1,30 y una distancia de trabajo de 0,21 mm. Los paneles centrales muestran aumentos de los ICMs o núcleos individuales y se puede distinguir el borde entre ellos.

Los paneles inferiores ilustran cómo cuanto más avanzado está el embrión, mayor es la densidad nuclear y, por lo tanto, mayor es la posibilidad de errores de segmentación. Estas imágenes muestran errores que MINS puede cometer, como la detección de núcleos apoptóticos como células vivas, la sobresegmentación o la subsegmentación. Esta secuencia de cortes Z revela un evento de subsegmentación, donde dos celdas se han identificado como una.

Una vez dominado, este protocolo se puede llevar a cabo en tres o cuatro días de principio a fin, con una carga de tiempo de dos a cuatro horas por día. Al realizar este procedimiento, es importante recordar que debe ser muy consistente con las condiciones del experimento, es decir, los protocolos de inmunofluorescencia y los parámetros de imagen. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología del desarrollo del ratón realizaran análisis cuantitativos in situ de la expresión de genes y proteínas en células individuales.

Después de ver este video, tendrá una buena comprensión de cómo adquirir datos de imagen que sean apropiados para el análisis cuantitativo de expresión in situ.