El uso de la tomografía computarizada-Micro para la evaluación del desarrollo del tumor y Seguimiento de la respuesta al tratamiento en un modelo de ratón de cáncer de pulmón

El objetivo general de este video es identificar las ventajas del uso de Micro CT para la evaluación del desarrollo tumoral, la respuesta al tratamiento y otros experimentos en modelos de cáncer de pulmón en ratones. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del cáncer de pulmón cuando se utiliza un modelo de ratones, como cuándo comienzan a crecer los tumores, la tasa de crecimiento y la respuesta a las intervenciones terapéuticas. Esta técnica nos permite identificar qué animales deben ser excluidos de nuestro estudio, al tiempo que detectamos cambios en tiempo real en el tamaño de sus tumores.

La técnica ahorra tiempo y esfuerzo, y reduce notablemente el número de ratones por grupo de estudio. Desde el escáner Micro-CT, acceda al control de la computadora y abra el paquete de software llamado RMCT2"Luego, inicie el ciclo de calentamiento. A continuación, prepare el lecho de muestras del escáner, para el ratón, envolviéndolo en plástico.

A continuación, anestesiar al ratón con isoflurano y confirmar que está anestesiado, mediante un pellizco cutáneo. Un pellizco suave de un pequeño pliegue de piel es suficiente. A continuación, aplique una pomada oftálmica para prevenir la sequedad de la córnea.

Ahora coloque el ratón, con la parte dorsal hacia arriba, sobre el lecho de muestras. Sostenga la cabeza del ratón y tire del cuerpo hacia abajo desde las extremidades inferiores para estirar y enderezar el cuerpo simétricamente. Luego, dirija el gas anestésico a la cámara y coloque el tubo de gas junto a la nariz del animal, para administrar anestesia continua.

A continuación, envuelva el ratón y la cama de muestras con plástico para mantener el ratón en su sitio. Asegúrese de que el mouse esté seguro porque cualquier movimiento o giro durante el escaneo dará como resultado imágenes borrosas e inutilizables. Ahora, cierre la cámara, ajuste el sistema a 90 kilovoltios y 160 microamperios, y configure el tiempo de escaneo en 4,5 minutos.

Establezca el rango de la imagen en 24 milímetros. A continuación, configure el sistema en modo sincrónico para los latidos del corazón. Ahora, cree una nueva carpeta en la base de datos para las nuevas imágenes e inicie el escaneo.

Después de completar el escaneo, mueva el mouse a una jaula vacía y obsérvelo hasta que recupere la conciencia. No lo devuelva a sus compañeros de alojamiento hasta que esté completamente recuperado de la anestesia. Abra los archivos de imagen de micro CT en serie en la imagen J.Desplácese por todas las imágenes de cada ratón desde el cuello hasta el abdomen o viceversa.

Ahora, utilizando escaneos de ratones naïve de tipo salvaje, identifique la densidad de diferentes áreas y estructuras anatómicas normales en el pecho. Desplácese hacia arriba hasta las vísceras abdominales blanquecinas y el diafragma, e identifique el área a través del tórax y hasta el cuello. Toma nota de los puntos de referencia de la jaula torácica ósea, el esternón, las vértebras y las costillas.

Luego, identifique el corazón en la parte frontal del tórax y los vasos sanguíneos principales cerca del corazón y en el mediastino. La luz traqueal es un pequeño círculo oscuro a nivel del cuello y la parte superior del tórax, que se bifurca en los bronquios principales derecho e izquierdo, y luego continúa ramificándose en bronquios cada vez más pequeños. Tenga en cuenta que cada bronquio está estrechamente asociado con dos o tres vasos sanguíneos.

Ahora, comience a examinar los escaneos de ratones DT no inducidos e identifique la presencia de cualquier anomalía. Excluir del experimento a los ratones con sombras pulmonares anormales previas a la inducción, como nódulos o ampollas enfisematosas. Para este experimento, se utilizaron ratones con gammagrafías pulmonares normales que pueden producir tumores inducidos por FGF9.

Para inducir los tumores, se les proporciona doxiciclina en su comida a 200 partes por millón. Después de 10 semanas, se realiza una segunda microtomografía computarizada de estos ratones para confirmar el desarrollo de nódulos tumorales en sus pulmones. Luego, divide a los ratones en dos grupos.

Administre el bloqueador de FGFR, AZD4547, a un grupo a través de una sonda gástrica. Haga esto durante 6 días a la semana durante 10 semanas. Administre un placebo al otro grupo.

Realice un seguimiento de los cambios en las sombras nodulares realizando una tercera exploración a las cuatro o cinco semanas de iniciado el tratamiento. Más tarde, al final del tratamiento completo de 10 semanas, realice una cuarta exploración. A continuación, identificar los cambios dinámicos en los nódulos tumorales, en respuesta al tratamiento, comparando posiciones similares dentro de las imágenes de exploración en serie en los diferentes puntos temporales.

Busque la aparición, o desaparición, de cualquier sombra anormal. Orientarse correctamente a la misma posición anatómica es fundamental para interpretar los resultados. Utilice puntos de referencia anatómicos fácilmente identificables dentro del tórax, como la tráquea, su bifurcación, los bronquios principales derecho e izquierdo, la aorta y los vasos sanguíneos grandes, y el diafragma.

Debido a las inclinaciones del cuerpo, los huesos son puntos de referencia menos útiles. Después de sacrificar a un ratón y acceder a su cuello y pulmones, se corta el corazón y la glándula timo. Inserte pinzas detrás de la tráquea para separarla del esófago.

A continuación, canula la tráquea con una cánula G24 y asegure la cánula anudando una sutura colocada alrededor de la punta intertraqueal. Ahora, infle y fije el pulmón con PFA al 4% helado a través de la cánula con una columna de 25 cm. Luego, separe la cánula y apriete el nudo de la tráquea para evitar fugas de PFA.

Ahora, corte la tráquea superior, incluida su unión a la laringe. Y mientras tira de la tráquea del hilo de sutura, diseccione la tráquea y los pulmones de todos los accesorios. A continuación, retira la tráquea con los pulmones en blanco.

Coloque los pañuelos en un tubo de 15 ml que contenga 5 ml de PFA al 4% a temperatura ambiente. Deje los pulmones en PFA durante la noche para la penetración y fijación completa del tejido. Luego, procese el tejido como de costumbre.

En la preselección de ratones DT de 8 a 12 semanas de edad para este estudio, aproximadamente la mitad mostró anomalías pulmonares en la micro-tomografía computarizada, lo que los hace inadecuados para su inclusión. Para el estudio, la inducción tumoral se activó durante 10 semanas, seguida de tratamiento. Los ratones a los que se les administró el inhibidor de FGFR, AZD4547, durante 10 semanas mostraron desaparición o reducción en el tamaño de los nódulos que eran visibles en las exploraciones previas al tratamiento.

Por otro lado, los ratones de control que recibieron placebo no mostraron ningún cambio, un aumento en el tamaño del nódulo y/o la aparición de nuevos nódulos. La evaluación histológica de punto final de los pulmones confirma la exactitud de los hallazgos realizados con la exploración por micro-TC. Los ratones que se juzgó que tenían los pulmones limpios, de hecho, tenían una histología pulmonar normal.

Mientras que, los ratones que mostraron anormalidades, mostraron varios cambios histológicos, incluidas ampollas y nódulos. Después de 10-12 semanas de inducción con doxiciclina, se observaron múltiples nódulos de adenocarcinoma, con tamaños y posiciones variables, en todos los animales. El tratamiento posterior con 10-12 semanas de un bloqueador de FGFR, mostró menos nódulos y más pequeños.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo usar Micro-CT para evaluar el desarrollo de tumores en el pulmón de ratón. Y para hacer un seguimiento de cualquier cambio en estos tumores, en respuesta a diversos procedimientos experimentales. Una vez que se inicia el mouse, los escaneos se pueden realizar en menos de 10 minutos por mouse.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar mantener el ratón bajo anestesia profunda y envuelto de forma segura en el lecho de muestras para minimizar el movimiento durante las exploraciones. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo del cáncer de pulmón y las células madre cancerosas exploraran el alcance del desarrollo tumoral, la regresión progresiva y el entorno de diferentes experimentos. No olvide que trabajar con rayos X puede ser peligroso.

En el funcionamiento estándar de la máquina, siempre se deben seguir los procedimientos mientras se realiza este procedimiento.