Resolución de imagen subnanométrica con modulación de amplitud en microscopía de fuerza atómica en Líquido

El objetivo general de este procedimiento es lograr la obtención de imágenes con la mayor resolución posible en líquido, utilizando un microscopio de fuerza atómica (AFM) comercial operado en modo de modulación de amplitud, también conocido como modo de tanteo. Este método ayuda a ampliar los límites del funcionamiento estándar del AFM en líquido, mediante el uso de la mejor combinación de parámetros para obtener alta resolución. La principal ventaja de esta técnica es que puede utilizarse con la mayoría de los AFM comerciales, por lo que no requiere equipos especializados.

El método presentado aquí está dirigido a científicos y técnicos que ya poseen algunos conocimientos básicos de microscopía de fuerza atómica (AFM), pero que desean obtener mayor aprovechamiento de la técnica. Este método no está enfocado a ningún tipo particular de muestra, y puede aplicarse ampliamente a muestras provenientes de la física, la biología, la química, la ciencia de materiales y las ciencias de superficies. En general, las personas nuevas en esta técnica podrían tener dificultades, ya que se requiere cierta paciencia para encontrar los mejores parámetros para una muestra determinada.

Someta los instrumentos y el disco que sostiene el sustrato a ultrasonidos en agua ultrapura. A continuación, utilice isopropanol y nuevamente agua ultrapura, durante 10 minutos cada uno. Cuando se busca una alta resolución, cualquier contaminación puede tener consecuencias perjudiciales.

Use guantes en todo momento y asegúrese de que todas las superficies o instrumentos que entren en contacto con la muestra, el cantiléver o la celda de AFM estén completamente limpios. Después de la sonicación, seque cada uno de los instrumentos y el disco de muestra bajo un flujo de nitrógeno. Utilice un disco de acero como soporte para la mica, para imaginar iones metálicos individuales absorbidos.

Limpie físicamente las superficies que no se pueden limpiar por sonicación, limpiándolas con toallas de baja pelusa de una sola capa empapadas en agua ultrapura, isopropanol y agua ultrapura, secuencialmente. Deje que la superficie se seque al aire durante hasta 30 minutos. A continuación, prepare una pequeña cantidad de adhesivo epóxico mezclando completamente los reactivos, y coloque aproximadamente 10 microlitros del epóxico sobre el disco de muestra de acero limpio.

Coloque el sustrato de mica sobre el epoxi y fíjelo al disco de acero aplicando presión sobre el sustrato. Deje que el epoxi se cure durante varias horas a una temperatura elevada según las especificaciones del fabricante. Luego, presione firmemente un trozo de cinta adhesiva de 2,5 centímetros de ancho sobre el sustrato, de modo que quede cubierta toda la superficie, y retire suavemente la capa superior.

Repita este proceso dos o tres veces hasta que la mica quede perfectamente lisa al ojo. Sumerja el chip del cantiléver en un baño de isopropanol seguido de agua ultrapura, cada uno durante 60 minutos. Luego, exponga la punta a luz UV durante hasta cinco minutos para favorecer la formación de sitios de hidratación estables.

Los tiempos prolongados de sobreexposición pueden dañar la punta o aumentar su radio de curvatura. Inserte el cantiléver en el porta-cantiléver del MFA y pipetee 25 microlitros del líquido de imagen sobre el cantiléver y la punta para humedecer previamente la superficie. Esto reducirá la aparición de burbujas de aire al acercarse a la muestra.

Derrita el disco de muestra y el sustrato sobre la platina de la muestra y agregue una gota del líquido de imagen a la muestra. Luego conecte el soporte del cantiléver al MFA. Acerque el cantiléver y la muestra lo suficiente como para formar un puente capilar entre los fluidos en la punta del cantiléver y los de la muestra.

Utilice el software del microscopio de fuerza atómica (AFM) para alinear el láser de medición cerca del extremo de la punta del cantiléver. A continuación, encuentre la frecuencia de resonancia del cantiléver a partir del pico principal en su espectro térmico. Si se ha calibrado la deflexión del cantiléver, ajustar el pico de resonancia con un modelo de oscilador armónico simple proporciona la constante elástica del cantiléver.

Luego, ajuste el cantiléver al encontrar su respuesta de amplitud cuando se impulsa externamente a través de un rango de frecuencias cercanas a la frecuencia de resonancia identificada en el espectro térmico. Ajuste la amplitud de excitación de modo que la amplitud de oscilación libre sea aproximadamente de cinco nanómetros. Esto generalmente corresponde a 0.2-0.8 voltios en la mayoría de los AFM.

A continuación, ajuste el punto de ajuste de amplitud a aproximadamente el 80 % de la amplitud libre. Luego, establezca las ganancias de retroalimentación relativamente altas. Después de asegurarse de que no ocurra ninguna inestabilidad ni oscilación, fije la velocidad de exploración inicial a aproximadamente un hercio y el tamaño de exploración a 10 nanómetros.

Inicie el acercamiento del puntero a la superficie utilizando el software de control del microscopio de fuerza atómica (AFM). Evalúe si el puntero ha alcanzado la superficie sin comenzar a obtener imágenes, cambiando ligeramente el valor del punto de ajuste. Si el puntero está en la superficie, el efecto sobre la extensión de la zona ZPA debería ser insignificante.

Una vez que la punta haya alcanzado la superficie, retire la zona ZPA y reajuste el cantiléver. Es probable que la frecuencia de resonancia haya cambiado a un valor más bajo debido a las interacciones entre la punta y la muestra. Ahora, cambie el punto de ajuste a aproximadamente el 80 % de la nueva amplitud libre ajustada e introduzca el cantiléver para realizar un barrido de 10 por 10 nanómetros cuadrados de la superficie en modo de modulación de amplitud, con el fin de verificar que los parámetros de imagen sean adecuados.

Verifique que los perfiles de traza y retraza se superpongan. Si no es así, reduzca aún más el punto de ajuste y pruebe aumentando las ganancias. Si la imagen se vuelve ruidosa, disminuya las ganancias.

Repita la operación con una región grande del tamaño de uno a cinco micrómetros cuadrados de la muestra, siempre que esto sea posible. En muestras blandas o biológicas, esto podría provocar contaminación de la punta. Reduzca el tamaño de exploración a un valor adecuado para visualizar las características de interés.

Esto puede ser tan bajo como 20 por 20 nanómetros. A continuación, reduzca la amplitud de excitación del cantiléver lo suficiente para que el bucle de retroalimentación retraiga automáticamente la zona ZPA y eleve la punta de la superficie. Mientras el cantiléver esté alejado de la superficie, ajuste la amplitud de excitación de modo que la amplitud del cantiléver sea de uno a dos nanómetros de pico a pico.

Reduzca progresivamente el punto de ajuste en pequeños pasos, hasta que la zona ZPA se extienda nuevamente hacia la superficie y se recupere la imagen original. Mantenga la amplitud del punto de ajuste entre el 75 % y el 95 % de la nueva amplitud libre. A continuación, vuelva a ajustar las ganancias, ya que pueden utilizarse ganancias más altas a amplitudes más bajas sin introducir ruido significativo.

Optimice el sistema para encontrar la mejor combinación de amplitud libre, punto de ajuste y ganancia para una alta resolución. Las condiciones óptimas del sistema dependen de la muestra, las propiedades de humectación del líquido y también del cantiléver que se utilice. Para interfaces solvofílicas, use cantiléveres con una constante de resorte de 0,5 a dos newtons por metro.

Mediante esta técnica, se obtuvieron imágenes con resolución subnanométrica en una amplia gama de muestras. Las muestras blandas mostradas aquí incluyen una bicapa lipídica, membranas púrpura de Halobacterium salinarum, una monocapa autoensamblada de dímeros anfifílicos y cristales de acuaporina de una membrana del cristalino bovino. En cada caso, se resaltan las características de interés.

Las pequeñas amplitudes de oscilación y los puntos de ajuste altos minimizan la fuerza ejercida por la punta sobre la muestra, lo que permite obtener imágenes de los frágiles ensamblajes espontáneos de lípidos en la bicapa, proteínas en biomembranas nativas y moléculas anfifílicas en solución sin causar daño. Materiales cristalinos más duros, como calcita, titanito de estroncio, carburo de silicio e iones metálicos individuales absorbidos sobre una superficie de mica, pueden visualizarse mediante este enfoque, ya que en todos los casos es el líquido interfacial el que efectivamente se imagina, no el cristal en sí. Una vez dominada, esta técnica proporciona resolución a nivel molecular o atómico en líquido casi cada vez que se realiza correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante tener en cuenta que se está obteniendo una imagen del líquido interfacial. Esto implica utilizar condiciones de imagen suaves. La contaminación de la punta, la muestra o el líquido suele ser la causa principal del fracaso para lograr una alta resolución.

Si hay alguna duda, a menudo es una buena idea limpiar todas las superficies en contacto con el líquido y reutilizar las soluciones de imagen. El ruido externo también perjudica la alta resolución. Es preferible un piso de baja vibración, alejado de un conducto de ventilación.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo optimizar sus parámetros de imagen para obtener una microscopía de fuerza atómica de alta resolución. Por supuesto, como ocurre con cualquier técnica avanzada, puede ser necesario realizar varios intentos para determinar la mejor manera de obtener imágenes de una muestra, por lo que la paciencia es fundamental.