Resolución de imagen subnanométrica con modulación de amplitud en microscopía de fuerza atómica en Líquido

El objetivo general de este procedimiento es lograr la imagen de la resolución más alta posible en líquido, con un AFM comercial operado y modulación de amplitud, también conocido como modo de golpeo. Este método ayuda a superar el límite de la operación estándar de AFM en líquido, mediante el uso de la mejor combinación de parámetros para alta resolución. La principal ventaja de esta técnica es que se puede utilizar con la mayoría de los AFM comerciales y, como tal, no requiere ningún equipo especializado.

El método presentado aquí está dirigido a científicos y técnicos que ya tienen algunos conocimientos básicos de AFM, pero que desean obtener más de la técnica. Este método no está dirigido a ningún tipo de muestra en particular y se puede aplicar ampliamente a muestras de física, biología, química, materiales y ciencias de servicios. Por lo general, las personas nuevas en esta técnica tendrán dificultades, porque requiere cierta paciencia para encontrar los mejores parámetros para una muestra determinada.

El baño sica los instrumentos, y el disco que soporta el sustrato en agua ultra pura. Seguido de isopropanol y, de nuevo, agua ultrapura, cada uno durante 10 minutos. Cuando se busca una alta resolución, cualquier contaminación puede tener consecuencias perjudiciales.

Use guantes en todo momento y asegúrese de que cualquier superficie o instrumento que entre en contacto con la muestra, el voladizo o la celda AFM se limpie a fondo. Después de la sonicación, seque cada uno de los instrumentos y el disco de muestra bajo un flujo de nitrógeno. Utilice un disco de acero como soporte para la mica, para obtener imágenes de iones metálicos absorbidos individuales.

Limpie físicamente las superficies que no pueden limpiarse por sonicación limpiándolas con pañuelos de papel de una sola capa con poca pelusa empapados en agua ultrapura, isopropanol y agua ultrapura secuencialmente. Deje que la superficie se seque al aire durante un máximo de 30 minutos. A continuación, prepare una pequeña cantidad de pegamento epoxi mezclando bien los reactivos y coloque unos 10 microlitros de epoxi en el disco de muestra de acero limpio.

Coloque el sustrato de mica sobre el epoxi y fíjelo al disco de acero aplicando presión sobre el sustrato. Deje que el epoxi se cure durante varias horas a una temperatura elevada de acuerdo con las especificaciones del fabricante. A continuación, presione firmemente un trozo de cinta adhesiva de 2,5 centímetros de ancho sobre el sustrato, de modo que quede cubierta toda la cara, y despegue suavemente la capa superior.

Repita este proceso dos o tres veces hasta que la mica esté suave como un espejo a la vista. Sumerja el chip en voladizo en un baño de isapropanol seguido de agua ultrapura cada uno durante 60 minutos. Luego, exponga la punta a la luz ultravioleta durante un máximo de cinco minutos para favorecer la formación de sitios de hidratación estables.

Los tiempos de sobreexposición más largos pueden dañar la punta o aumentar su radio de curvatura. Inserte el voladizo en el soporte de voladizo del AFM y pipetee 25 microlitros del líquido de imagen en el voladizo y la punta para humedecer previamente la superficie. Esto reducirá la aparición de burbujas de aire al acercarse a la muestra.

Derrita el disco de muestra y el sustrato en la etapa de muestra y agregue una gota del líquido de imagen a la muestra. A continuación, conecte el soporte en voladizo al AFM. Acerque el voladizo y la muestra para formar un puente capilar entre los fluidos de la punta del voladizo y los de la muestra.

Utilice el software AFM para alinear el láser de medición cerca del extremo de la punta del voladizo. A continuación, encuentre la frecuencia de residencia del voladizo desde el pico principal en su espectro térmico. Si se calibra la deflexión del voladizo, el ajuste del pico de residencia con un modelo de oscilador armónico simple produce la constante de resorte del voladizo.

Luego, ajuste el voladizo encontrando su respuesta de amplitud cuando se impulsa externamente en un rango de frecuencias cercano a la frecuencia de resonancia identificada en el espectro térmico. Ajuste la amplitud de conducción para que la amplitud de oscilación libre sea de aproximadamente cinco nanómetros. Por lo general, esto corresponde a 0,2-0,8 voltios en la mayoría de los AFM.

Luego, ajuste el punto de ajuste de amplitud a aproximadamente el 80% de la amplitud libre. A continuación, establezca las ganancias de retroalimentación relativamente altas. Después de asegurarse de que no se produzca inestabilidad ni zumbidos, establezca la velocidad de escaneo inicial en aproximadamente un hercio y el tamaño de escaneo en 10 nanómetros.

Inicie la aproximación de la punta a la superficie utilizando el software de control AFM. Evalúe si la punta ha llegado a la superficie sin comenzar a obtener imágenes cambiando ligeramente el valor del punto de ajuste. Si la punta está en la superficie, el efecto sobre la extensión de la zona ZPA debería ser insignificante.

Una vez que la punta haya llegado a la superficie, retraiga la zona ZPA y vuelva a ajustar el voladizo. Es probable que la frecuencia de resonancia haya cambiado a un valor más bajo debido a las interacciones de la muestra de la punta. Ahora, cambie el punto de ajuste a aproximadamente el 80% de la amplitud libre recién ajustada y active el voladizo para realizar un escaneo cuadrado de 10 por 10 nanómetros de la superficie en modo de modulación de amplitud para verificar que los parámetros de imagen sean adecuados.

Compruebe que los perfiles de seguimiento y retroceso se superpongan. De lo contrario, reduzca aún más el punto de ajuste e intente aumentar las ganancias. Si la imagen se vuelve ruidosa, disminuya las ganancias.

Repita la operación con una región grande de uno a cinco micrómetros cuadrados de la muestra, siempre que sea posible. En muestras blandas o biológicas, esto podría resultar en la contaminación de la punta. Reduzca el tamaño del escaneo a un valor adecuado para visualizar las características de interés.

Esto puede ser tan bajo como 20 por 20 nanómetros. A continuación, reduzca la amplitud de accionamiento del voladizo lo suficiente como para que el bucle de retroalimentación retraiga automáticamente la zona ZPA, mejore la punta de la superficie. Mientras el voladizo está lejos de la superficie, ajuste la amplitud de la unidad para que la amplitud del voladizo sea de uno a dos nanómetros de pico a pico.

Reduzca progresivamente el punto de ajuste en pequeños pasos, hasta que la zona ZPA se extienda nuevamente hacia la superficie y se recupere la imagen original. Mantenga la amplitud del punto de ajuste entre el 75% y el 95% de la nueva amplitud libre. A continuación, reajuste las ganancias, ya que las ganancias más altas se pueden utilizar a amplitudes más bajas sin introducir un ruido significativo.

Optimice el sistema para encontrar la mejor combinación de amplitud libre, punto de ajuste y ganancia para alta resolución. Las condiciones óptimas del sistema dependen de la muestra, de las propiedades humectantes del líquido y también del voladizo que se utilice. Para interfaces solvofílicas, utilice voladizos con una constante de resorte de 0,5 a dos newtons por metro.

Con esta técnica, se obtuvieron imágenes con resolución subnanométrica en una amplia gama de muestras. Las muestras blandas que se muestran aquí incluyen una bicapa lipídica, membranas púrpuras de halobacterium salinarum, una monocapa autoensamblada de dimoléculas anfofílicas y cristales de acuaporina de una membrana de lente bovina. En cada caso, se resaltan las características de interés.

Las pequeñas amplitudes de oscilación y los altos puntos de ajuste minimizan la fuerza ejercida por la punta sobre la muestra, lo que permite que los frágiles autoensamblajes de lípidos en la bicapa, proteínas en biomembranas nativas y moléculas anfofílicas se obtengan imágenes en solución sin daños. Los materiales cristalinos más duros, como la calcita, la titanita de estroncio, el carburo de silicio y los iones metálicos individuales absorbidos en una superficie de mica, pueden obtenerse mediante este enfoque, ya que en todos los casos es el líquido interfacial el que se visualiza eficazmente, no el cristal en sí. Una vez dominada, esta técnica proporciona una resolución a nivel molecular o atómico en líquido casi cada vez que se realiza correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante tener en cuenta que se trata del líquido interfacial que se está fotografiando. Esto significa utilizar condiciones de imagen blandas. La contaminación de la punta, la muestra o el líquido suele ser la causa principal de que no se logre una alta resolución.

En caso de duda, a menudo es una buena idea limpiar todas las superficies en contacto con el líquido y reutilizar las soluciones de imagen. El ruido externo también es perjudicial para la alta resolución. Es mejor un suelo de baja vibración, lejos de un conducto de ventilación.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo optimizar sus parámetros de imagen para lograr AFM de alta resolución. Por supuesto, como para cualquier técnica de vanguardia, pueden ser necesarios varios ensayos para descubrir la mejor manera de obtener una imagen de una muestra, por lo que la paciencia es clave.