Name: Resolución de imagen subnanométrica con modulación de amplitud en microscopía de fuerza atómica en Líquido (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: Aprende a obtener imágenes de resolución subnanométrica con microscopía de fuerza atómica en modo de modulación de amplitud en líquido. Este método optimiza parámetros para lograr alta resolución en AFM comerciales.

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La financiación del Consejo de Investigación de Ciencias Físicas y de Ingeniería (subvenciones 1.452.230 y EP / M023915 / 1), la Biotecnología y Ciencias Biológicas de Investigación (Grant BB / M024830 / 1) y el Consejo Europeo (7PM CIG 631.186) se agradece.

1. Limpieza de herramientas y otras superficies NOTA: Cuando el objetivo de alta resolución, cualquier forma de contaminación puede tener consecuencias perjudiciales. Por tanto, es necesario asegurar todas las herramientas utilizadas para manipular la muestra, sustrato o AFM consejos se limpian a fondo. Lo siguiente se aplica a cualquier superficie o instrumento (por ejemplo, pinzas) que puedan entrar en contacto con la muestra, de consola, o célula AFM, incluyendo la etapa propia muestra. <ol><li> Bath-sonicar los instrumentos en agua ultrapura (18,2 mO, &lt;5 ppm orgánicos), seguido de isopropanol (99,7% de pureza), seguido de agua de nuevo ultrapura, cada uno para 10 min. Cuando sea posible, utilice isopropanol bajo una campana de extracción para reducir la inhalación de humos. </li><li> Seca bajo un flujo de nitrógeno. </li><li> Si inmersión total no es posible (por ejemplo, para el titular de voladizo / electrónica), físicamente limpia la superficie limpiando con una sola capa, tejidos de baja pelusa (tejidos ligeros escobillas) empapado en ultrapure agua, isopropanol y agua ultrapura, secuencialmente. Deje que la superficie se seque al aire (generalmente dentro de 15 a 30 min). </li></ol> 2. Preparación del substrato NOTA: El sustrato designa la superficie sólida de soporte directamente las muestras, típicamente en contacto físico con el escáner AFM y la muestra. La mayoría de AFMs tienen una montura magnética y discos de acero se pueden utilizar, pero el mismo protocolo también es adecuado para sustratos tales como portaobjetos de vidrio. Aquí asumimos un disco de acero sobre la que se fija un disco de mica. El objetivo de este procedimiento es limitar lo más posible las fuentes externas de contaminación que pueden afectar la formación de imágenes. Los guantes deben ser usados ​​en todo momento. <ol><li> Bath-sonicar el disco de muestra de acero en agua ultrapura (18,2 mO), seguido de isopropanol, y por último por el agua ultrapura de nuevo, cada uno por 10 min. </li><li> Se secan los discos bajo un flujo de nitrógeno. </li><li> Preparar una pequeña cantidad de pegamento epoxi con reactivos mezclados a fondo y el lugar 10 ~81; l en el disco de acero. </li><li> Colocar el sustrato (mica moscovita, SiO 2 cristal, vidrio, etc.) para el disco de acero mediante la aplicación de presión sobre el sustrato. Deje que el epoxi se cure durante varias horas a una temperatura elevada (ver especificaciones del fabricante). </li><li> Asegúrese de que no epoxi está expuesto directamente al aire, alrededor de los bordes del sustrato. Esto ocurrirá si se utiliza una cantidad excesiva de epoxi y puede llegar a ser una fuente de contaminación. <ol><li> Para un sustrato de mica, presione firmemente ~ cinta adhesiva de 2,5 cm de ancho sobre el sustrato, de modo que toda la cara está cubierta, y sin problemas despegarlo. Use cinta adhesiva ligeramente, y la cáscara de la mica tirando paralela a la superficie. El material eliminado es visible en la cinta. Repita este proceso 2-3 veces, hasta que la mica es lisa como un espejo en el ojo. </li><li> Para el vidrio / SiO2, si se requiere una nueva modificación química de la superficie, repetir la rutina de baño de ultrasonidos de pasos 2.1-2.2. Como alternativa, utilice Uunidad de exposición V (18 W lámparas germicidas UV-C) durante 30-60 minutos, dependiendo de alimentación) para pirolizar los compuestos orgánicos que pueden quedar en la superficie. Este procedimiento también hace la superficie más hidrófila sin aumentar significativamente la rugosidad. </li></ol></li></ol> 3. Preparación de voladizo y Tip <ol><li> Sumergir el chip en voladizo en un baño de isopropanol, seguido de agua ultrapura, cada uno por 60 min. </li><li> Si el voladizo / punta requiere una limpieza exhaustiva (por ejemplo, después de un almacenamiento prolongado en el cuadro de gel), añadir un remojo de 30 minutos en acetona (&gt; 99,5% de pureza) antes de la etapa 1 (véase también la sección dedicada a la contaminación). El almacenamiento de los consejos en cajas de gel es, en nuestra experiencia, una de la principal fuente de contaminación que puede ocurrir muy rápidamente 59. </li><li> Exponer la punta a los rayos UV se iluminan brevemente (&lt;5 min) con el fin de favorecer la formación de sitios de hidratación estables 60. Evitar la sobreexposición veces más largos, ya que puede dañar la punta o incREase su radio de curvatura. </li><li> Insertar el voladizo en el soporte en voladizo del AFM y la pipeta ~ 50 l de solución de imagen (siendo investigado la naturaleza de la solución dependerá de la muestra, pero en este caso usar una solución de 10 mM de cloruro de rubidio en agua ultrapura) sobre el voladizo y la punta de pre-mojado; Esto limitará la aparición de burbujas de aire cuando se acerca a la muestra. </li></ol> 4. Puesta en marcha de AFM de la célula <ol><li> Montar el disco de muestra y el sustrato en la etapa de la muestra y añadir una gota de líquido de imágenes (líquido típicamente de 2-3 mm de grosor en su punto más alto). </li><li> Conectar el soporte voladizo a la AFM. </li><li> Llevar el voladizo y de la muestra en estrecha proximidad con el fin de formar un puente capilar entre los fluidos en el voladizo / punta y la muestra. </li></ol> 5. Inicialización de Medición y Calibración de voladizo <ol><li> Alinear el láser de medición (generalmente rojo) cerca de la punta-end del voladizo. Dependiendo del modelo de AFM, hacerlo bien a través de controles de software o mediante el ajuste manual de la posición del láser. Adquirir espectro térmico del voladizo en líquido (véase la Figura 1A). El proceso registra las fluctuaciones térmicas del voladizo utilizando el láser, a fin de encontrar la frecuencia de resonancia principal del voladizo (modo propio fundamental). En la mayoría de AFM moderno, esto se realiza a través de procedimientos automatizados en los controles de software, pero los detalles puede variar de AFM de AFM. </li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54924/54924fig1.jpg" /> Figura 1: Ajuste y calibración del voladizo. A: espectro de ruido térmico de deflexión vertical del voladizo (negro) con un ajuste oscilador armónico simple (SHO) del modo propio fundamental (rojo). Aquí, la resonancia es de 18,7 kHz en agua. Las tres primeras frecuencias de resonancia que corresponden a los tres primeros modos de vibración de flexión son highlighted con flechas azules. B: Calibración de inverso óptico palanca de sensibilidad del voladizo. La desviación lineal de la voladizo presionado contra una superficie rígida (no deformable) se utiliza para medir el factor de conversión (InvOLS) entre la deformación medida en voltios y el valor correspondiente en nanómetros. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54924/54924fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <ol start="2"><li> Grabar una deflexión frente a la curva distancia con el voladizo sobre un sustrato rígido (por ejemplo, mica o de vidrio) y calibrar la desviación mediante la imposición de que la pendiente de la curva en la zona de desviación lineal (como en la figura 1B) es la unidad 61-63. NOTA: Este proceso encuentra el factor de conversión entre la deformación medida sobre el fotodetector (en voltios) y la deflexión real de la voladizo (en nanómetros) - known como la inversa de la palanca óptico Sensibilidad (InvOLS). La calibración puede dañar la punta, por lo que es mejor para llevar a cabo después de que todas las medidas se completaron. Utilice el valor InvOLS derivada de otra voladizo del mismo tipo durante un experimento anterior para obtener una estimación (normalmente&gt; 90% exacto) de la amplitud real antes de la calibración. </li><li> Montar el pico de resonancia en el espectro térmico con un sencillo modelo de oscilador armónico 64-66 para obtener la constante de resorte del voladizo. Este procedimiento es automatizado en la mayoría del software AFM y por lo general no requiere un conocimiento especializado del modelo en cuestión. </li><li> Sintonizar el voladizo. Encontrar la respuesta de amplitud del voladizo cuando se maneja externamente (por ejemplo, acústicamente o por excitación fototérmica) en un rango de frecuencias cerca de su frecuencia de resonancia nominal. Ajuste la frecuencia de accionamiento a la cerca del máximo en este espectro, ligeramente a la izquierda. Si el voladizo es Acoustically impulsado, muchos máximos espuria puede aparecer cuando la sintonización. <ol><li> Seleccionar un pico de resonancia lo más cerca posible a (y dentro de la envoltura de) la resonancia identificada en el espectro térmico utilizando el software de control de la AFM pero específicos puede depender del tipo y la versión de software que controla el AFM. </li></ol></li></ol> 6. Enfoque y examen inicial de la muestra <ol><li> Establecer la amplitud de la conducción de modo que la amplitud de la oscilación libre es de aproximadamente 5 nm. Esto corresponde normalmente a 0,2-0,8 V en la mayoría de AFM (en el caso de los InvOLS no está calibrado). Ajuste el punto de ajuste de amplitud de ~ 80% de la amplitud libre. </li><li> Establecer las ganancias de realimentación relativamente alto (el valor absoluto depende de la AFM), pero que no se produzca inestabilidad o timbre. </li><li> Ajuste la velocidad de exploración inicial y el tamaño de escaneo para valores pequeños (por ejemplo, a ~ 1 Hz y 10 nm, respectivamente). Esto ayuda a mantener la punta en el caso de que algunos parámetros de retroalimentación están mal ajustadasevitando la exploración a grandes distancias. El tamaño de escaneo puede ampliarse a un valor mayor (por ejemplo, 100 nm) si las condiciones de exploración aparecen adecuado. </li><li> Determinar la altura aproximada de la superficie (en algunos casos esto debe hacerse ópticamente) antes de la aproximación. </li><li> Iniciar el enfoque de la punta a la superficie utilizando el software de control AFM. Los detalles finos de este proceso dependerán del modelo de AFM y el software utilizado. <ol><li> Si hay problemas con el enfoque cuando se utiliza un voladizo suave, llevar a cabo el enfoque en el modo de contacto. En este caso, asegúrese de que las ganancias son menores que en el modo AM, y establecer el punto de ajuste a un valor relativamente bajo (0,1-0,2 V después de centrar el láser sobre el fotodetector) para preservar la punta. </li><li> Evaluar si la punta ha alcanzado la superficie sin empezar a imagen cambiando ligeramente el valor de consigna (aumento en el modo de contacto o disminución en el modo AM). Si la punta está en la superficie, el efecto sobre tque la extensión de la Z-piezo debería ser insignificante. Los movimientos en vivo de la Z-piezo generalmente se muestran gráficamente en el software de control de la mayoría de AFM. Si el cambio de consigna desencadena un movimiento visible del elemento piezoeléctrico, esto indica una falsa Engage. En este último caso, vuelva a iniciar el enfoque de la posición de la punta de corriente, usando un poco más alto (contacto) o menor valor de consigna (AM). </li></ol></li><li> Una vez que la punta ha alcanzado la superficie, retraer el piezo-Z (por lo general simplemente pulsando &quot;STOP&quot;) y volver a sintonizar el voladizo (repita el paso 5.4.); la frecuencia de resonancia es probable que se han desplazado a un valor inferior debido a la interacción punta-muestra. </li><li> Para cambiar el valor de ~ 80% de la amplitud libre recién sintonizada (a esta distancia punta-muestra). </li><li> Enganche el voladizo y realizar una exploración nm 2 10 × 10 de la superficie en el modo AM para verificar que los parámetros de imagen son adecuados. <ol><li> Compruebe que la traza (exploración de izquierda a derecha) y volver sobre (escaneado para la izquierda)perfiles se superponen. Si no es así a reducir aún más el valor de consigna y tratar de aumentar la ganancia. </li><li> Bajar las ganancias si la imagen se vuelve ruidosa. </li></ol></li><li> Repetir la operación con una gran - 1 × 1 m 2 a 5 x 5 m 2 - exploración de la muestra siempre que ello sea posible. En muestras blandas o biológicos, esto podría dar lugar a una contaminación de la punta. </li></ol> 7. Imagen de alta resolución <ol><li> Reducir el tamaño de escaneado a un valor adecuado para la visualización de las características (por ejemplo, 100 x 100 nm 2 para cristales de proteína o 20 × 20 nm 2 de mica o calcita). </li><li> Reducir la amplitud de accionamiento del voladizo suficiente para que el bucle de retroalimentación para retraer automáticamente el Z-piezo y por lo tanto la punta de la superficie. Mientras que el voladizo está lejos de la superficie, ajustar la amplitud de accionamiento de manera que la amplitud en voladizo es de ~ 1-2 nm (pico a pico). </li><li> Usando el software de control AFM, Progrèssivamente reducir el punto de ajuste de unas pocas decenas de mV a la vez hasta la Z-piezo se extiende de nuevo hacia la superficie y la imagen original se recupera. Mantenga la amplitud de consigna entre 75% y 95% de la nueva amplitud libre. </li><li> Reajuste las ganancias utilizando el software de control AFM; mayores ganancias se pueden utilizar en amplitudes más bajas sin introducir ruido significativo. <ol><li> Repetir el 7/2 a 7/4 pasos a fin de determinar la mejor combinación de amplitud libre, punto de ajuste y de ganancia para alta resolución. Las condiciones óptimas dependen de la muestra (paisaje solvatación y las propiedades humectantes del líquido), sino también el voladizo (constante de elasticidad, rigidez). </li><li> Explora diferentes combinaciones de amplitudes para optimizar las condiciones de formación de imágenes. Puede ser necesario aumentar de nuevo la amplitud libre 42. En tal caso, primero ajustar el punto de ajuste a un valor más alto y luego aumentar la unidad (es decir, el procedimiento inverso al utilizado para disminuir la amplitud). </li><li> Mantenga el setpoint amplitud en el rango de 0,5 nm - 1,5 nm (pico a pico) con relaciones de consigna mantiene por encima de 0,7 (típicamente 0,75 a 0,95). Para las interfaces solvofílica, utilizar voladizos con una constante de resorte de 0,5 - 2 N / m. Esto es suficiente para la punta para eliminar la mayor parte del líquido interfacial sin golpear la superficie. Una regla de oro se propone en la ec. 4 de referencia 29. </li></ol></li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Desde su invención, hace tres décadas, microscopía de fuerza atómica (AFM) 1 se ha establecido como una técnica de elección para la investigación de muestras en la nanoescala, especialmente donde un promedio de más áreas superficiales macroscópicas no es posible y se requiere información local. En una medición AFM típica, la deflexión de un voladizo flexible se utiliza para cuantificar la fuerza de interacción entre un pequeño número de moléculas y una punta ultrasharp montado en el extremo del voladizo. Dependiendo del tipo de las interacciones y de las escalas de tiempo considerado, una amplia gama de información se puede derivar, incluyendo las propiedades viscoelásticas de las membranas biológicas suaves 2,3, la fuerza de una sola sustancia química o enlace molecular de 4,5, los detalles de un atomísticos superficie 6-8, la magnética 9, capacitivos 10, la realización 11, térmicas 12,13 y 14 propiedades químicas de las muestras <sup&gt; 15. Parte del éxito de AFM es su capacidad para funcionar en una amplia gama de materiales 16 y en múltiples entornos como de vacío 17, gas o líquido 11,18 19,20, ya que no se basa en una fuerza específica entre la sonda y la muestra . En la práctica, sin embargo, que opera el AFM, en condiciones distintas de ambiente puede ser un reto y muchos resultados publicados todavía se obtienen en el aire. Una dificultad añadida viene del hecho de que por lo general es necesario para operar el AFM en modo dinámico (punta vibratoria) con el fin de preservar tanto punta y la muestra, evitando grandes fuerzas de fricción. Aunque más difícil, operación dinámica en principio, puede dar más información acerca de la muestra analizada, y sin pérdida de resolución espacial. Durante la última década, el campo de la AFM dinámico en líquido ha evolucionado de manera importante, desde el advenimiento de la velocidad de vídeo-AFM 21 - 23, a las mediciones multifrecuencia <sup&gt; 24,25 y subnanométrica imágenes de las estructuras de hidratación en las interfases 26 - 31. AFM operación mientras se está inmerso en un líquido ahora se utiliza de forma rutinaria en la biología y la biofísica 32 - 36, la investigación de polímeros 37, electroquímica 38 - 40 y las interfaces de caracterización sólido-líquido 41 - de 44. La presencia de líquido alrededor de la voladizo vibrante altera considerablemente su dinámica 45, así como la interacción entre la punta y la muestra 29,42. Cuando se usa apropiadamente, el líquido puede ser explotado para mejorar la formación de imágenes de resolución 26,29, con una mejora típica de casi un orden de magnitud en comparación con la mejor resolución alcanzada en condiciones ambientales 46. En AFM, la resolución espacial más alta alcanzable para una medición particular, depende tanto de la calidad de la propia AFM y la naturaleza de tque la interacción sondeó 20,47,48. En la actualidad, la mayoría de gama alta, AFM disponibles en el mercado presentan niveles de ruido que se acercan a la de límite térmico 12 por lo que el factor determinante para la resolución es por lo general la interacción punta-muestra. Es efectivamente el gradiente espacial de esta interacción que determina la resolución: mediciones basadas en corto alcance, en descomposición rápidamente interacción producen resultados resolución más alta que cuando las interacciones de largo alcance están en juego. En líquido, las fuerzas de solvatación puede mejorar la resolución de formación de imágenes, ya que tienden a desaparecer durante sólo unos pocos diámetros moleculares de líquido (típicamente &lt;1 nm) cuando se aleja de la superficie de la muestra 49. Estas fuerzas se originan a partir de la interacción entre las moléculas del líquido y la superficie de la muestra. Un líquido con una fuerte afinidad por la superficie tenderá a ser más ordenada y menos móvil que el líquido a granel en la interfaz con la muestra 29,42,50. Como resultado,se necesita más energía para una punta del AFM que vibra para desplazar moléculas de líquido interfacial de líquidos a granel 42, lo que hace la medición altamente sensible a las variaciones locales en las propiedades del líquido interfacial en la nanoescala -el paisaje solvatación. Con el fin de explotar las fuerzas de solvatación, varios aspectos prácticos deben ser tomadas en consideración. En primer lugar, la amplitud de oscilación de la punta tiene que ser comparable a la gama de las fuerzas de solvatación, típicamente &lt;1 nm. En segundo lugar, el líquido utilizado debe formar un paisaje solvatación bien definida en la superficie de la muestra. Macroscópicamente, esto es equivalente a requerir un líquido &#39;humectación&#39; para la muestra considerada. Por ejemplo, en el agua que es más fácil lograr la resolución a nivel molecular en mica hidrófilo que en 42,51 grafito hidrofóbico. Finalmente, la constante de resorte de la ménsula de soporte de la punta debe ser seleccionado apropiadamente 52,53. Cuando se trabaja en estos estafacondiciones, el AFM no sólo proporciona imágenes a nivel molecular de la interfaz, sino que también se deriva información sobre la afinidad de la muestra-líquido local que se puede utilizar para obtener información química sobre la superficie de la muestra 54. Los modos dinámicos más comunes de operación de AFM en líquido son de modulación de amplitud (AM, también &quot;modo de descarga &#39;) AFM y la frecuencia de modulación de (FM) AFM. En el primer caso 55, la punta raster-escanea la muestra, mientras que su amplitud de la vibración se mantiene constante por un bucle de retroalimentación que continuamente re-ajusta la distancia punta-muestra. Una imagen topográfica de la muestra se obtiene a partir de la corrección aplicada por el bucle de realimentación. En FM-AFM 28,41,56, es la frecuencia de oscilación del cantilever / punta que se mantiene constante, mientras que la punta escanea la muestra. Ambas técnicas proporcionan una resolución topográfica comparable en líquido 36,57. La cuantificación de la interacción punta-muestra tiende a ser más straightforward y precisa en FM-AFM, pero AM-AFM es más fácil de implementar, más robusto y permite trabajar con voladizos más suaves, algo útil para el estudio de muestras fácilmente deformables o delicados. Significativamente, AM-AFM está más extendido entre los usuarios de AFM, en parte por razones históricas, sino también debido al hecho de que es técnicamente más fácil de controlar. Aunque la amplitud se mantiene constante mediante el circuito de retroalimentación durante la exploración AM-AFM, se permite que el retraso de fase entre la oscilación de la punta y la oscilación de accionamiento para cambiar libremente. El atraso de fase puede proporcionar información útil sobre las interacciones punta-muestra, por estar relacionados con la energía disipada durante la oscilación de la punta en la interfaz con la muestra 58. Por lo tanto la eliminación de imágenes se puede adquirir de forma simultánea a la imagen topográfica, y es a menudo complementaria para poner de relieve la heterogeneidad de la superficie de la muestra. formación de imágenes de fase se ha utilizado para diversos mapeo de interacciones, incluyendo el direct mapeo de energía de adhesión 42, 58 propiedades viscoelásticas y el paisaje hidratación de una interfaz 44. En la práctica, la obtención de imágenes de alta resolución en líquido permanece no trivial, debido al gran número de parámetros a controlar, y la ausencia de un protocolo simple, sistemática que funciona en cada situación. La calidad de imagen general depende de la geometría en voladizo y la elasticidad, la química de punta, la amplitud de oscilación, y la rigidez de la muestra, entre otros 55. mediciones de AFM son también, por definición, perturbative al sistema. Como resultado, el cambio de las variables de imagen y las condiciones ambientales sin consideraciones apropiadas puede dar lugar a dificultades en la reproducción y / o observaciones misrepresentative ya resultados falsos. A continuación, presentamos nuestro protocolo para lograr imágenes de alta resolución de muestras duras y blandas en solución, utilizando instrumentos comerciales operados en amplitude-modulación. Nuestro objetivo es ofrecer un procedimiento práctico para la optimización de los principales parámetros que pueden influir en la resolución sobre diferentes muestras, explicando en cada caso la justificación de nuestras elecciones de los principios físicos que subyacen al proceso de formación de imágenes. Detallamos un enfoque paso a paso, desde la limpieza y preparación del substrato, a elección del voladizo, el ajuste de los parámetros de imagen y resolución de problemas problemas comunes. Al explicar los fundamentos científicos detrás de nuestras decisiones y procedimientos para alta resolución debería ayudar a tomar decisiones racionales para la adaptación de la metodología, y servir como punto de partida para nuevos sistemas de formación de imágenes. A lo largo de este texto utilizamos AM para referirse al modo de funcionamiento con modulación de amplitud de un AFM. Nos referimos a la parámetro de realimentación mantiene constante durante ya sea la desviación en voladizo (modo de contacto) o amplitud de oscilación (modo AM) como el valor de consigna. En el modo AM, el voladizo es accionado externamenteya sea por una oscilación acústica o por un láser de impulsos se centró en la base del voladizo. La amplitud de la unidad es la intensidad de la señal oscilatoria externa. El valor absoluto de la amplitud de excitación necesaria para lograr una amplitud de oscilación dada del voladizo depende de muchos parámetros, tales como el método de la conducción (acústico, fototérmica o magnéticamente), la fijación en voladizo y los parámetros (rigidez, geometría) y la alineación de láser. El valor exacto de la amplitud de la unidad, por lo tanto no es relevante pero se ajusta en cada experimento con el fin de proporcionar una amplitud de oscilación apropiado (y cuantificable) del voladizo. Cuando el voladizo accionado está lejos de la muestra y no amortiguación de su vibración se produce a través de interacciones punta-muestra, su amplitud de oscilación se llama la amplitud de oscilación libre. A medida que la punta vibratoria se acerca a la superficie de la muestra, su amplitud comienza a disminuir. Si se activa la regeneración, el Z-piezo constantly volver a ajustar su extensión para que la quilla a la amplitud nominal ajustada, constante. El valor de consigna normalmente es siempre menor que la amplitud libre. Es común referirse a la relación de punto de ajuste, la relación de la amplitud de consigna (amplitud de imagen) sobre la amplitud libre. Cuanto menor sea la relación de consigna, la más dura de las condiciones de formación de imágenes son.

<table><tbody><tr><td>Multimodo IIIA AFM</td><td>Brucker</td><td>NA</td><td>Una de las máquinas usadas</td></tr><tr><td>Cypher ES AFM</td><td>Asylum Resarch</td><td>NA</td><td>Una de las máquinas usadas</td></tr><tr><td>AFM voladizo/punta</td><td>Nanoworld</td><td>Arrow UHF-AUD</td><td>mejor para alta frecuencia</td></tr><tr><td>AFM voladizo/punta</td><td>Olympus</td><td>RC800-PSA agua ultrapura</td><td>versátil y barata</td></tr><tr><td></td><td>Milipore</td><td>NA</td><td>los sistemas de filtrado de laboratorio pueden inducir contaminación</td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido</td><td>Sigma-Aaldrich</td><td>200-664-3&nbsp;</td><td>Químico estándar, sin más purificación</td></tr><tr><td>Sales monovalentes</td><td>Sigma-Aaldrich</td><td></td><td>producto químico estándar, sin purificación adicional</td></tr><tr><td>Lípidos</td><td>Avanti Polar Lipides</td><td></td><td>bicapas lipídicas formadas mediante protocolos de stadard</td></tr><tr><td>Cristales Cristales pulidos</td><td>MTI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cinta adhesiva</td><td>3M</td><td>Scotch Magic Tape</td><td>La cinta translúcida funciona mejor. Los palos transparentes se adhieren con demasiada fuerza</td></tr></tbody></table>

resolución de imagen subnanométrica con modulación de amplitud en microscopía de fuerza atómica en líquido

Sub-nanometer Resolution Imaging with Amplitude-modulation Atomic Force Microscopy in Liquid

La microscopía de fuerza atómica (AFM) se ha convertido en una técnica bien establecida para la obtención de imágenes a nanoescala de muestras en aire y en líquido. Estudios recientes han demostrado que cuando se opera en modo de modulación de amplitud (tapping), se pueden lograr imágenes de resolución a nivel atómico o molecular en una amplia gama de muestras blandas y duras en líquido. En estas situaciones, las pequeñas amplitudes de oscilación (SAM-AFM) mejoran la resolución al explotar el líquido solvatado en la superficie de la muestra. Aunque la técnica se ha aplicado con éxito en campos tan diversos como la ciencia de los materiales, la biología y la biofísica y la química de superficies, la obtención de imágenes de alta resolución en líquido puede seguir siendo un reto para los usuarios novatos. Esto se debe, en parte, a la gran cantidad de variables a controlar y optimizar, como la elección del voladizo, la preparación de la muestra y la correcta manipulación de los parámetros de imagen. Aquí, presentamos un protocolo para lograr imágenes de alta resolución de muestras duras y blandas en fluidos utilizando SAM-AFM en un instrumento comercial. Nuestro objetivo es proporcionar una guía práctica paso a paso para lograr imágenes de alta resolución, incluyendo la limpieza y preparación del aparato y la muestra, la elección del voladizo y la optimización de los parámetros de imagen. Para cada paso, explicamos la justificación científica detrás de nuestras elecciones para facilitar la adaptación de la metodología al sistema específico de cada usuario.

El protocolo descrito en la sección anterior se ha aplicado con éxito con varios AFMs comerciales para lograr imágenes molecular- o a nivel atómico. Todas las imágenes se obtuvieron con amplitudes de trabajo entre 0,5 nm y 1,5 nm ajustados individualmente siguiendo el procedimiento los pasos 7,1-7,4. Los resultados podrían ser obtenidos a través de una amplia gama de suave (Figura 2) y (3) Figura muestras rígidas. En cada caso, se resaltan las características de interés. Una de las grandes ventajas de la técnica es que las pequeñas amplitudes de oscilación y altos puntos de ajuste minimizan la fuerza ejercida por la punta en la muestra, lo que permite frágiles auto-ensamblados de lípidos (Figura 2A), proteínas (Figura 2 B y D), y moléculas anfifílicas (Figura 2C) para obtener imágenes sin daño en solución. Los materiales más duros cristalinos tales como minerales (Figuras 3A, B, C) yiones metálicos individuales adsorbidos sobre una superficie (Figura 3C) se pueden obtener imágenes utilizando el enfoque porque en cada caso, es el líquido interfacial que es imaginada eficazmente con el protocolo descrito. Las fuerzas de solvatación son comparables en las muestras de las figuras 2 y 3 muestran: todas las muestras son hidrófilas (más en general, &quot;solvofílica&quot; en el caso de las figuras 2C, 3B, 3D) con respecto a la solución de formación de imágenes. Consistentemente, los voladizos con rigidez comparable (0,2 - 0,8N / m) se utilizaron en todos los casos. Tanto la muestra y la punta deben ser solvofílica para asegurar que las moléculas de líquido forman una estructura de solvatación bien definido que se pueden obtener imágenes. Esto no siempre es una condición suficiente, pero en la mayoría de los casos y para moléculas de líquido relativamente pequeño, el propio líquido re-estructuras de una manera que imita la simetría de muestra. El principal motor de la alta resolución es la variación local en la afinidad de las moléculas de disolvente adsorbidospara las superficies (Ångström escala, en el caso de las Figuras 2A, 3A, 3C). La técnica se por lo tanto, más adecuado para materiales en los que la estructura de disolvente varía en gran medida a través de la superficie. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54924/54924fig2.jpg" /> Figura 2: las interfaces suaves imaginada por AM-AFM en soluciones acuosas. R: dipalmitoil-fosfatidilcolina (DPPC) bicapa lipídica en la fase de gel en la imagen in KCl 150 mM. Los grupos de cabeza hexagonal de lípidos lleno se distinguen tanto en la topografía y la fase, junto con el contraste local que indica las variaciones específicas del sitio en la hidratación. B: membranas púrpura de Halobacterium salinarum fotografiado en KCl 150 mM, Tris 10 mM, pH 7,4. Varios trímeros de proteína bacteriorrodopsina se resaltan. La fase exhibe un contraste diferente de la topografía debido a sitios de hidratación locales en las proteínas. trímeros de proteínas individuales<html> se pueden hacer fuera (líneas de trazos). C: tinte anfifílico (Z907) moléculas adsorbidas en la superficie de una nanopartícula TiO 2 en una célula solar sensibilizada con colorante. La imagen fue adquirida en sulfona etil-isopropil. El aspecto esponjoso que es creado por las moléculas de colorante adsorbido. D: cristal Acuaporina en las membranas de lentes bovinas autóctonas imagen formada en el mismo tampón B. Un tetrámero acuaporina se pone de relieve. Sub-estructura que corresponde a los bucles entre helicoidales son visibles en la topografía mientras que la fase muestra un contraste sorprendentemente diferente debido al comportamiento inusual agua cerca de la proteína. Las imágenes son una adaptación de los árbitros 36 (B), ref 38 (C) y ref 67 (D). La barra de escala es de 5 nm (A), 10 nm (B), 3 nm en (C), y 15 nm (D) La escala de color indica, respectivamente, una variación de la altura y fase de 200 pm y 15 ° (A), 600 pm y 4 ° (B), 2,5 nm y 2,5 ° (C), y 1,6 nm y 9,5 ° (D).carga / 54924 / 54924fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/54924/54924fig3.jpg" /> Figura 3: Imágenes representativas AM-AFM de muestras duras en soluciones fluidas. R: La calcita cristalina [ <img alt="Equation2" src="/files/ftp_upload/54924/54924equation2.jpg" /> ] Superficie con la imagen en una solución de agua ultrapura equilibrada. B: titanato de estroncio fotografiada obtenida en sulfóxido de dimetilo (DMSO). -Alta resolución no fue posible en el agua. C: la mica moscovita reflejado en RbCl 3 mm - individuales adsorbidos iones Rb + son visibles en los sitios de celosía de la mica en ambas exploraciones de fase y de la altura. D: El carburo de silicio en fotografiada en DMSO. Los arreglos cristalográficas esperados se muestran en imágenes B y D. Las imágenes son una adaptación de ref 68 (A), ref 42 (B y D),y ref 44 (C). La barra de escala es de 3 nm (A, B, C) y 5 nm (C). La escala de colores indica, respectivamente, una variación de la altura y la fase de 250 horas y 14 ° (A), a 600 pm y 5,5 ° (B), a 800 pm y 15 ° (C), y 500 pm y 3,5 ° (D). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54924/54924fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Se presenta un método para lograr imágenes de alta resolución subnanométricas con (modo de descarga) con modulación de amplitud en la microscopía de fuerza atómica líquido. El método se muestra en microscopios de fuerza atómica comerciales. Se explica la razón de ser de nuestras opciones de parámetros y sugerir estrategias para la optimización resolución.

Resolución de imagen subnanométrica con modulación de amplitud en microscopía de fuerza atómica en Líquido

Atomic force microscopy (AFM) has become a well-established technique for nanoscale imaging of samples in air and in liquid. Recent studies have shown ...

El objetivo general de este procedimiento es lograr la obtención de imágenes con la mayor resolución posible en líquido, utilizando un microscopio de fuerza atómica (AFM) comercial operado en modo de modulación de amplitud, también conocido como modo de tanteo. Este método ayuda a ampliar los límites del funcionamiento estándar del AFM en líquido, mediante el uso de la mejor combinación de parámetros para obtener alta resolución. La principal ventaja de esta técnica es que puede utilizarse con la mayoría de los AFM comerciales, por lo que no requiere equipos especializados.El método presentado aquí está dirigido a científicos y técnicos que ya poseen algunos conocimientos básicos de microscopía de fuerza atómica (AFM), pero que desean obtener mayor aprovechamiento de la técnica. Este método no está enfocado a ningún tipo particular de muestra, y puede aplicarse ampliamente a muestras provenientes de la física, la biología, la química, la ciencia de materiales y las ciencias de superficies. En general, las personas nuevas en esta técnica podrían tener dificultades, ya que se requiere cierta paciencia para encontrar los mejores parámetros para una muestra determinada.Someta los instrumentos y el disco que sostiene el sustrato a ultrasonidos en agua ultrapura. A continuación, utilice isopropanol y nuevamente agua ultrapura, durante 10 minutos cada uno. Cuando se busca una alta resolución, cualquier contaminación puede tener consecuencias perjudiciales.Use guantes en todo momento y asegúrese de que todas las superficies o instrumentos que entren en contacto con la muestra, el cantiléver o la celda de AFM estén completamente limpios. Después de la sonicación, seque cada uno de los instrumentos y el disco de muestra bajo un flujo de nitrógeno. Utilice un disco de acero como soporte para la mica, para imaginar iones metálicos individuales absorbidos.Limpie físicamente las superficies que no se pueden limpiar por sonicación, limpiándolas con toallas de baja pelusa de una sola capa empapadas en agua ultrapura, isopropanol y agua ultrapura, secuencialmente. Deje que la superficie se seque al aire durante hasta 30 minutos. A continuación, prepare una pequeña cantidad de adhesivo epóxico mezclando completamente los reactivos, y coloque aproximadamente 10 microlitros del epóxico sobre el disco de muestra de acero limpio.Coloque el sustrato de mica sobre el epoxi y fíjelo al disco de acero aplicando presión sobre el sustrato. Deje que el epoxi se cure durante varias horas a una temperatura elevada según las especificaciones del fabricante. Luego, presione firmemente un trozo de cinta adhesiva de 2,5 centímetros de ancho sobre el sustrato, de modo que quede cubierta toda la superficie, y retire suavemente la capa superior.Repita este proceso dos o tres veces hasta que la mica quede perfectamente lisa al ojo. Sumerja el chip del cantiléver en un baño de isopropanol seguido de agua ultrapura, cada uno durante 60 minutos. Luego, exponga la punta a luz UV durante hasta cinco minutos para favorecer la formación de sitios de hidratación estables.Los tiempos prolongados de sobreexposición pueden dañar la punta o aumentar su radio de curvatura. Inserte el cantiléver en el porta-cantiléver del MFA y pipetee 25 microlitros del líquido de imagen sobre el cantiléver y la punta para humedecer previamente la superficie. Esto reducirá la aparición de burbujas de aire al acercarse a la muestra.Derrita el disco de muestra y el sustrato sobre la platina de la muestra y agregue una gota del líquido de imagen a la muestra. Luego conecte el soporte del cantiléver al MFA. Acerque el cantiléver y la muestra lo suficiente como para formar un puente capilar entre los fluidos en la punta del cantiléver y los de la muestra.Utilice el software del microscopio de fuerza atómica (AFM) para alinear el láser de medición cerca del extremo de la punta del cantiléver. A continuación, encuentre la frecuencia de resonancia del cantiléver a partir del pico principal en su espectro térmico. Si se ha calibrado la deflexión del cantiléver, ajustar el pico de resonancia con un modelo de oscilador armónico simple proporciona la constante elástica del cantiléver.Luego, ajuste el cantiléver al encontrar su respuesta de amplitud cuando se impulsa externamente a través de un rango de frecuencias cercanas a la frecuencia de resonancia identificada en el espectro térmico. Ajuste la amplitud de excitación de modo que la amplitud de oscilación libre sea aproximadamente de cinco nanómetros. Esto generalmente corresponde a 0.2-0.8 voltios en la mayoría de los AFM.A continuación, ajuste el punto de ajuste de amplitud a aproximadamente el 80 % de la amplitud libre. Luego, establezca las ganancias de retroalimentación relativamente altas. Después de asegurarse de que no ocurra ninguna inestabilidad ni oscilación, fije la velocidad de exploración inicial a aproximadamente un hercio y el tamaño de exploración a 10 nanómetros.Inicie el acercamiento del puntero a la superficie utilizando el software de control del microscopio de fuerza atómica (AFM). Evalúe si el puntero ha alcanzado la superficie sin comenzar a obtener imágenes, cambiando ligeramente el valor del punto de ajuste. Si el puntero está en la superficie, el efecto sobre la extensión de la zona ZPA debería ser insignificante.Una vez que la punta haya alcanzado la superficie, retire la zona ZPA y reajuste el cantiléver. Es probable que la frecuencia de resonancia haya cambiado a un valor más bajo debido a las interacciones entre la punta y la muestra. Ahora, cambie el punto de ajuste a aproximadamente el 80 % de la nueva amplitud libre ajustada e introduzca el cantiléver para realizar un barrido de 10 por 10 nanómetros cuadrados de la superficie en modo de modulación de amplitud, con el fin de verificar que los parámetros de imagen sean adecuados.Verifique que los perfiles de traza y retraza se superpongan. Si no es así, reduzca aún más el punto de ajuste y pruebe aumentando las ganancias. Si la imagen se vuelve ruidosa, disminuya las ganancias.Repita la operación con una región grande del tamaño de uno a cinco micrómetros cuadrados de la muestra, siempre que esto sea posible. En muestras blandas o biológicas, esto podría provocar contaminación de la punta. Reduzca el tamaño de exploración a un valor adecuado para visualizar las características de interés.Esto puede ser tan bajo como 20 por 20 nanómetros. A continuación, reduzca la amplitud de excitación del cantiléver lo suficiente para que el bucle de retroalimentación retraiga automáticamente la zona ZPA y eleve la punta de la superficie. Mientras el cantiléver esté alejado de la superficie, ajuste la amplitud de excitación de modo que la amplitud del cantiléver sea de uno a dos nanómetros de pico a pico.Reduzca progresivamente el punto de ajuste en pequeños pasos, hasta que la zona ZPA se extienda nuevamente hacia la superficie y se recupere la imagen original. Mantenga la amplitud del punto de ajuste entre el 75 % y el 95 % de la nueva amplitud libre. A continuación, vuelva a ajustar las ganancias, ya que pueden utilizarse ganancias más altas a amplitudes más bajas sin introducir ruido significativo.Optimice el sistema para encontrar la mejor combinación de amplitud libre, punto de ajuste y ganancia para una alta resolución. Las condiciones óptimas del sistema dependen de la muestra, las propiedades de humectación del líquido y también del cantiléver que se utilice. Para interfaces solvofílicas, use cantiléveres con una constante de resorte de 0,5 a dos newtons por metro.Mediante esta técnica, se obtuvieron imágenes con resolución subnanométrica en una amplia gama de muestras. Las muestras blandas mostradas aquí incluyen una bicapa lipídica, membranas púrpura de Halobacterium salinarum, una monocapa autoensamblada de dímeros anfifílicos y cristales de acuaporina de una membrana del cristalino bovino. En cada caso, se resaltan las características de interés.Las pequeñas amplitudes de oscilación y los puntos de ajuste altos minimizan la fuerza ejercida por la punta sobre la muestra, lo que permite obtener imágenes de los frágiles ensamblajes espontáneos de lípidos en la bicapa, proteínas en biomembranas nativas y moléculas anfifílicas en solución sin causar daño. Materiales cristalinos más duros, como calcita, titanito de estroncio, carburo de silicio e iones metálicos individuales absorbidos sobre una superficie de mica, pueden visualizarse mediante este enfoque, ya que en todos los casos es el líquido interfacial el que efectivamente se imagina, no el cristal en sí. Una vez dominada, esta técnica proporciona resolución a nivel molecular o atómico en líquido casi cada vez que se realiza correctamente.Al intentar este procedimiento, es importante tener en cuenta que se está obteniendo una imagen del líquido interfacial. Esto implica utilizar condiciones de imagen suaves. La contaminación de la punta, la muestra o el líquido suele ser la causa principal del fracaso para lograr una alta resolución.Si hay alguna duda, a menudo es una buena idea limpiar todas las superficies en contacto con el líquido y reutilizar las soluciones de imagen. El ruido externo también perjudica la alta resolución. Es preferible un piso de baja vibración, alejado de un conducto de ventilación.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo optimizar sus parámetros de imagen para obtener una microscopía de fuerza atómica de alta resolución. Por supuesto, como ocurre con cualquier técnica avanzada, puede ser necesario realizar varios intentos para determinar la mejor manera de obtener imágenes de una muestra, por lo que la paciencia es fundamental.

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Investigación

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Source: Williams, S. M. et al. Novel Atomic Force Microscopy Based Biopanning for Isolation of Morphology Specific Reagents against TDP-43 Variants in Amyotrophic Lateral Sclerosis. J. Vis. Exp. (2015)This video demonstrates tapping-mode AFM to visualize phage–antigen interactions on a mica surface. It outlines the steps for antigen immobilization, phage binding, and high-resolution nanoscale imaging.

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