Name: Fuerza Atómica Microscopía Imaging y Fuerza Espectroscopia de admitidos Bilayers lípidos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: Aprende a preparar bicapas lipídicas admitidas y caracterizar su estructura mediante microscopía de fuerza atómica y espectroscopía de fuerza. Este protocolo permite investigar propiedades mecánicas de membranas biológicas con alta resolución.

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Este trabajo fue apoyado por la Sociedad Max Planck, el Centro Alemán de Investigación Oncológica, la Universidad de Tubinga, y el Bundesministerium für Bildung und Forschung (subvención. No 0312040). Damos las gracias a Eduard Hermann por ayudarnos a automatizar el análisis de los datos de la curva de la fuerza y ​​el Dr. Jakob Suckale para una lectura cuidadosa de este manuscrito.

1. Preparación de admitidos Bilayers lípidos (SLB) 11,12,21 <ol><li> Preparación de mezcla de lípidos y vesículas multilamelares Suspensiones <ol><li> Prepare los siguientes tampones de antemano. <ol><li> Preparar tampón PBS en concentraciones de 2,7 mM KCl, 1,5 mM KH 2 PO 4, 8 mM Na 2 HPO 4, y NaCl 137 mM, pH 7,2. </li><li> Preparar SLB (bicapa lipídica apoyado) tampón a concentraciones de NaCl 150 mM, HEPES 10 mM, pH 7,4. </li><li> Preparar una solución de 1 M de CaCl2. </li></ol></li><li> Disolver los siguientes lípidos en cloroformo a una concentración deseada: por ejemplo, di-oleoil-fosfatidilcolina (DOPC) a 25 mg / ml, esfingomielina (SM) a 25 mg / ml y colesterol (Chol) a 10 mg / ml. </li><li> Tome 18,38 l de DOPC, 17,10 l de SM y 11,30 l de Chol para hacer una solución con 1 mg de lípidos totales en un 2: 2: 1 DOPC: relación molar Chol: SM. Varíe los volúmenes de acuerdo basado en el concentrations de los lípidos preparados en 1.1.2. Sin embargo, mantener la relación molar a 2: 2: 1 DOPC: SM: Chol, como el cambio de la relación molar va a cambiar las características de fase de la membrana 25. </li><li> Mezclar la solución por completo mediante agitación. Añadir un colorante fluorescente lipídico en 0,05% en moles si se desea visualizar la bicapa por un microscopio de fluorescencia. Nota: La familia de dialkylcarbocyanines de cadena larga, como lo hizo, Dil y Dio abarcan una amplia gama de longitudes de onda y puede ser idealmente utilizan para etiquetar las membranas lipídicas. Alternativamente, los lípidos marcados con fluorescencia, como rodamina-fosfatidiletanolamina o BODIPY-colesterol pueden ser utilizados. En cualquier caso, la concentración del colorante debe ser optimizado de acuerdo con el ajuste de la microscopía, teniendo en cuenta que las altas concentraciones de fluoróforo unido al lípido puede cambiar el comportamiento de lípidos 19. </li><li> Seque el cloroformo utilizando gas N2 (o cualquier gas inerte disponibles, tales como Ar y He). </li><li> Además t secaque lipídico mezcla al vacío durante al menos 1 hora. Nota: Si va a guardar esta mezcla de lípidos, purgar el aire con gas inerte (N2, Ar o He) y almacenar a -20 ° C. Alícuota exceso de lípidos-en-cloroformo en pequeños frascos marrones. Secar en una manera similar a la mezcla de lípidos, desplazar el aire con gas inerte (N 2, Ar o He) y almacenar a -20 ° C. </li><li> Disolver los lípidos secos en tampón de PBS a una concentración de 10 mg / ml. </li><li> Vortex la mezcla vigorosamente durante aproximadamente 20 segundos a 1 minuto para obtener una suspensión turbia, contiene vesículas multilamelares. Asegúrese de que el no hay películas lipídicas se pegan a los lados del vial. </li><li> Distribuir esta suspensión en 10 alícuotas (1 mg de lípidos hace 10 alícuotas). </li><li> Almacenar a -20 ° C hasta su uso posterior. </li></ol></li><li> Preparación de vesículas unilamelares Nota: Los varios tamaños de vesículas unilamelares se pueden preparar utilizando el método de sonicación o el método de extrusión. Sonicación usa sound energía para agitar la mezcla y separar las capas de la suspensión multilamelares. Esto se indica en la limpieza de la suspensión turbia. Extrusión obliga a las vesículas multilamelares que pasar por un filtro de membrana con un tamaño de poro definido. <ol><li> Método Sonicación <ol><li> Tome los 10 l de suspensiones lipídicas multilamelares y añadir 150 l de tampón SLB. </li><li> Transfiera la mezcla en pequeñas (2 ml) viales de vidrio tapados y sellar con Parafilm. </li><li> Sonicar la mezcla a temperatura ambiente en un baño de ultrasonidos durante 10 min o hasta que se vuelve claro para producir pequeñas vesículas unilaminares (SUVs, por debajo de 50 nm de diámetro). </li></ol></li><li> Método de extrusión <ol><li> Tome los 10 l de suspensiones lipídicas multilamelares y añadir 150 l de tampón SLB. </li><li> Transferir la suspensión a un tubo criogénico. </li><li> Congelar la suspensión de lípidos sumergiendo el tubo criogénico durante unos segundos en nitrógeno líquido. </li><li> Descongele lasuspensión de lípidos sumergiendo el tubo criogénico en un baño de agua a temperatura ambiente o 37 ° C durante unos minutos. Repita los pasos de congelación-descongelación por lo menos 10 veces. </li><li> Con el fin de extruir la suspensión de lípidos, utilizar una membrana de policarbonato con tamaño de poro 200 nm (otros tamaños de poro están disponibles como, 100 nm o 400 nm) y un dispositivo de extrusión comercial 26. Nota: Actualmente, hay dos dispositivos de extrusión comercialmente disponible: una extrusora manual está disponible para los pequeños volúmenes (200 l a unos pocos ml). En este caso, la muestra se extruye a través de la membrana empujando manualmente la suspensión de ida y vuelta entre dos jeringas. Dependiendo del fabricante, tendrían que combinarse para alcanzar el volumen mínimo de la puesta en marcha alícuotas de lípidos. Para volúmenes más grandes se utilizan dispositivos más sofisticados (hasta 50 ml) en el que la suspensión es forzado a través de la membrana de policarbonato mediante el uso de gas comprimido. Set-up y extrusión condiciones pueden cambiar de acuerdo con el Ministerio de Defensaeléct. Consulte las instrucciones del fabricante antes de usar. Este protocolo se refiere a la extrusora manual para pequeños volúmenes. </li><li> Equilibrar la extrusora en agua haciendo pasar agua a través de la extrusora. Sumerja la membrana en agua. </li><li> Coloque la membrana entre los dos pistones, montar el dispositivo y equilibrar en tampón, haciendo pasar el tampón a través de la extrusora, de una jeringa a la otra. Este paso permite, además, pruebas de la falta de estanqueidad del sistema. Si se filtra, desmontar y volver a montar de nuevo el cambio de la membrana. </li><li> Tome la suspensión de lípidos usando una jeringa de la extrusora (&#39;lado sucio&#39;). </li><li> Conecte la jeringa que contiene la suspensión de lípidos en una de las cámaras y la jeringa vacía en la cámara opuesta. </li><li> Empuje la jeringa en un extremo. Pasar la solución a través de la membrana y en la jeringa opuesta. Este es el paso 1 st. </li><li> Pasar a través de la membrana para un total de 31 veces talesque la solución termina en la jeringuilla opuesta (&#39;lado limpio&#39;). Nota: Consulte la membrana después de la extrusión. Si se rompe, entonces el proceso de extrusión no tuvo éxito y necesita ser repetido. </li><li> Vacíe la jeringa en un pequeño tubo. Vesículas unilamelares grandes (LUV) son estables durante 1-2 días si se mantiene a 4 ° C. </li></ol></li></ol></li><li> Preparación de Mica y Cubreobjetos <ol><li> Wash cubreobjetos primero en agua y luego en etanol. Aire seco. </li><li> Tome los discos de mica y retire la capa exterior con cinta adhesiva. </li><li> Coloque el disco de mica en el cubreobjetos. Colas ópticas transparentes son óptimas para que se pueda comprobar las bicapas con un microscopio de fluorescencia. </li><li> Adjuntar cilindros de plástico (diámetro 2,5 cm exterior, 2 cm de diámetro interior y 0,5 cm de altura) con óptica pegamento / grasa. Asegúrese de que todo está sellado y que no hay fugas. Utilice grasa cuando se quiere volver a utilizar los cilindros, ya que pueden ser fácilmente separados de THe cubreobjetos y se lavan. Las dimensiones de los cilindros de plástico dependen del tamaño del soporte voladizo AFM y se deben ajustar en consecuencia. </li></ol></li><li> La deposición de vesículas unilamelares en soporte sólido <ol><li> Pipetear toda la solución de liposomas directamente sobre la mica. Añada más memoria intermedia SLB para llegar a un volumen de 300 l. </li><li> Añadir 0,9 l de solución de cloruro de calcio 1 M para alcanzar una concentración final de 3 mM Ca 2+. </li><li> Incubar a 37 ° C durante 2 min y luego a 65 ° C durante al menos 10 min. Siempre cubra las bicapas con tampón. El contacto con las burbujas de aire y aire lo destruirá. Durante la incubación, añadir más tampón si es necesario, especialmente si la incubación a temperaturas más altas. Nota: Las temperaturas de incubación varían de acuerdo con las mezclas de lípidos y fases requeridas. Se necesita tiempo de incubación de al menos 10 min para formar bicapas soportadas, pero podría ser más largo, dependiendo de la temperatura y la composición. </li><li> Lavarla bicapa con agua caliente (65 ° C) tampón SLB 15-20 veces para eliminar el calcio y las vesículas no fusionadas. Tenga mucho cuidado durante las etapas de lavado para mantener la bicapa bajo tampón y pipetear suavemente la solución de lavado para evitar la destrucción de la bicapa. </li><li> Bicapas frescos soportados a temperatura ambiente antes de mediciones de AFM. Esto es necesario para formar las diferentes fases de la membrana, así como minimizar la deriva térmica en el instrumento. </li></ol></li></ol> 2. Microscopía de Fuerza Atómica Medidas 11,12 <ol><li> Imaging Nota: Realice las imágenes de microscopía de fuerza atómica en el modo de contacto o el modo tapping. De imagen soportados bicapas en solución; no permita que la solución se evapore por completo ya que esto va a destruir las bicapas. Como era de estar trabajando con tampón, se deben observar las medidas de seguridad para asegurarse de que cualquier parte AFM está protegido contra derrames de líquidos. <ol><li> Seleccionar un voladizo suave (abajo se recomienda 0,2 N / m constante del resorte) y montarlo en tél AFM. La elección de la rigidez en voladizo es más crítico para la espectroscopia de fuerza (y esto se discutirá más adelante). </li><li> Montar la muestra en el escenario AFM y asegurarse de que todos los módulos de aislamiento de vibraciones están encendidos. Espere al menos 15 minutos para equilibrar y reducir la deriva térmica del sistema. Dependiendo de la AFM configuración, especificaciones de ajuste y de imagen pueden variar. Consulte el manual del fabricante. </li><li> Acérquese a la muestra con la punta del AFM hasta que el contacto. </li><li> Desde bicapas lipídicas son generalmente 4 nm de altura, utilice el Z-rango del instrumento que le dará la mayor z-resolución (por ejemplo 1,5 micras). </li><li> Seleccione una región de la imagen. Para tener una visión general de la bicapa lipídica, un 50 micras x 50 micras o 25 micras x 25 micras región será un buen punto de partida para la imagen. Si aparecen las características más pequeñas, la imagen de un bote en áreas más pequeñas (10 m x 10 m, o 2 m x 2 m). La elección de la superficie de imágenes también depende de la r de trabajoange del escáner piezoeléctrico. Por favor consulte el manual del instrumento para ello. </li><li> Como bicapas son muy frágiles, ajustar el punto de la punta del AFM conjunto durante la exploración para mantener la fuerza, como mínimo, y corregir la deriva térmica, manteniendo contacto con la muestra. En el modo de contacto, minimizar el punto de ajuste. En el modo de grabación, maximizar el punto de ajuste. </li><li> Imágenes de proceso de ajuste de cada línea de exploración de las funciones polinómicas de nivelación. Efectuar la eliminación de línea para las exploraciones que pierden contacto con la membrana utilizando el software propietario de la empresa de fabricación de AFM. </li></ol></li><li> Fuerza Espectroscopia <ol><li> Calibrar el voladizo siguiendo las instrucciones según el protocolo del fabricante. La calibración permite la conversión de la señal eléctrica de los fotodiodos a la fuerza (Figura 1B). <ol><li> Calibrar sensibilidad de la punta para medir la deflexión como el movimiento z-piezo (en unidades de longitud) en lugar de la señal eléctrica en voltios. <br /&gt; Nota: AFM detecta cambios en la deflexión del voladizo utilizando un láser reflejados en la parte posterior de la voladizo. El láser alcanza un fotodiodo que puede detectar espacialmente la posición del punto láser. Un cambio en la deflexión del voladizo como se dobla al contacto con la muestra se detecta por este fotodiodo como &quot;deflexión vertical&quot;, y esto es en las unidades de tensión. Dado que el voladizo se mueve por el piezo-z, la deflexión vertical está relacionado con el movimiento en el z-piezo. La relación entre la deflexión vertical y z-movimiento se llama sensibilidad y convierte el voltaje a distancia. </li><li> Calcular la constante de resorte en voladizo utilizando el método de frecuencia de ruido térmico, generalmente incorporado en el software AFM. En este método, representar gráficamente la amplitud de la vibración del ruido con respecto a la frecuencia de oscilación, la creación de un gráfico de densidad espectral de potencia. Esta parcela se mostrará un pico alrededor de la frecuencia de resonancia. La frecuencia donde el i amplituds la mayor es la frecuencia de resonancia. Montar una función Lorentzian alrededor del pico para calcular automáticamente la constante del resorte por el software. Algunos recursos útiles para la teoría del método ruido térmico se dan en las referencias 27-30. </li></ol></li><li> Después de la formación de imágenes un área de la bicapa, seleccione una región x 5 m 5 m en la bicapa para realizar espectroscopia de fuerza. </li><li> Configure el AFM para que tome las curvas de fuerza en una cuadrícula de esa región de 16 x 16. Esto se traduce en 256 curvas de fuerza por región. El espacio entre dos puntos vecinos debería ser suficiente para evitar que el área de la membrana se sondeó por un punto coincidiría con el siguiente punto. Esto depende de la radio de la punta. Una distancia 100 nm entre dos puntos sería ideal. Divida el 5 micras x 5 región micras en 16 x 16 cuadrícula. Dependiendo del tamaño de la fase, se puede seleccionar una región más pequeña o más grande, y luego ajustar el tamaño de la cuadrícula en consecuencia. </li><li> Ajuste de desplazamiento z-piezo a400 nm. Esto determina el rango máximo de movimiento de la z-piezo. Debe ser lo suficientemente grande para asegurarse de que el voladizo ha completamente retraída lejos de la muestra en entre mediciones. </li><li> Ajuste la velocidad de aproximación a 800 nm / seg y retraer la velocidad a 200 nm / seg. Utilice una velocidad de aproximación entre 400 a 6.000 nm / seg dependiendo de la composición bicapa y fase lipídica a ser estudiados 6,16. </li><li> Después de configurar todos los parámetros, adquirir curvas de fuerza, pulsando el botón &quot;Ejecutar&quot; del software AFM. </li><li> Guardar curvas de fuerza como la fuerza contra curvas de altura (una medida del movimiento z-piezo). Esto no toma en cuenta la flexión del voladizo cuando está en contacto con la muestra. Durante la etapa de procesamiento de datos, el software AFM permite la corrección de flexión en voladizo para obtener fuerza frente a curvas de separación punta-muestra (Figura 1C), lo que dará valores adecuados para el espesor bicapa. Los valores de corrección se incorporan normalmente en la Calibración, que se guarda con cada curva de fuerza. Calcular la separación punta-muestra restando la desviación vertical del movimiento piezo en un punto dado. Nota: El pico en la curva de fuerza enfoque (el valor de la fuerza va hacia abajo, incluso si el movimiento en voladizo está todavía en el ciclo de aproximación) es la fuerza de avance de la membrana, mientras que la diferencia entre la posición de este pico y la posición del punto donde la fuerza comienza a aumentar de nuevo proporciona el espesor de la membrana. </li><li> Adquirir al menos 500 curvas de fuerza para cada condición para obtener buenas estadísticas. Trazar un histograma de los valores utilizando programas como Origen o MatLab, y encajar los histogramas para una distribución gaussiana para obtener el pico y la anchura de la distribución. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

SLBS compuestas de DOPC: SM: Chol (2: 2: 1) se formaron en mica después de la adsorción de vesículas y la ruptura inducida por cloruro de calcio. Esta composición lipídica separa en L d y L o fases. La fase L o se enriquece en la esfingomielina y colesterol, y es menos fluido / más viscoso (Figura 1A) que la fase L 11 d. La separación de L o de la fase L d manifiesta como estructuras circulares elevadas por encima de los alrede...

Microscopía de Fuerza Atómica (AFM) genera una imagen de una superficie por la exploración a través de un área de la muestra utilizando un voladizo con una punta muy afilada 1. El movimiento de la voladizo sondea la topología de la superficie de la muestra. AFM ha sido ampliamente aplicado a las moléculas biológicas - incluyendo proteínas, el ADN y las membranas, debido a su versatilidad en el análisis de muestras fijadas en el aire o estado casi nativo en líquido 2-5. Aparte de su capacidad de imagen de alta resolución en el rango nanométrico, el voladizo AFM actúa como un resorte para sondear fuerzas de interacción (adhesión) y la repulsión y las propiedades mecánicas de la muestra 5,6. Esto se conoce como espectroscopia de fuerza. En este modo, la sonda se acerca primero la muestra y ejerce una fuerza sobre él, entonces se retrae hasta que se pierde el contacto con la muestra (Figura 1A). Las curvas generadas muestran la fuerza como una función de la distancia del voladizo, tanto para la aplicacióncucaracha y retracción. Varias propiedades, incluyendo el módulo elástico para medir la rigidez de un material, y fuerzas de adhesión se pueden derivar. Bicapas lipídicas soportados son membranas modelo biológicas situadas en la parte superior de un soporte sólido - generalmente mica, vidrio de borosilicato, sílice fundida, o silicio 7 oxidado. Ellos se preparan utilizando diversas técnicas como la deposición de la vesícula, el método Langmuir-Blodgett y spin-coating 8,9. Formación de imágenes AFM se ha utilizado para seguir la formación de estas bicapas soportadas 10, y la sonda diferentes estructuras formadas por membranas de diferentes composiciones 11-15. Realización de espectroscopia de fuerza en bicapas soportadas resultados en un pico en la curva de enfoque. Este pico indica la fuerza necesaria para perforar la bicapa, y se llama fuerza de avance. El espesor bicapa también se puede medir usando la curva de fuerza 6. La fuerza de avance típico de bicapasrango entre 1-50 nN 6. Estas propiedades dependen de embalaje de lípidos (fase líquida o gel) y la estructura (longitud de la cadena acilo y el grado de insaturación) y alterado por agentes 16-de membrana activa. La teoría detrás de la ruptura ha sido explicada 17 y otros parámetros experimentales tales como suavidad voladizo, radio de la punta y la velocidad de enfoque también afectará la fuerza avance 15,16,18. Espectroscopia de fuerza se ha utilizado para analizar las propiedades de las diferentes fases de lípidos 11,19, cambios en la composición dependiente de 12,20, así como efectos de otras biomoléculas, como los péptidos, sobre la estabilidad de la membrana 21. La orientación plana de bicapas soportadas es ventajoso para la combinación de AFM con otros métodos tales como resonancia de plasmón superficial 22 y microscopía de fluorescencia 11,19 para caracterizar mejor la estructura y propiedades de las membranas. Esta detallada proto vídeocol está destinado a preparar a bicapas lipídicas apoyados mediante la deposición de vesículas y analizarlos con AFM y espectroscopia de fuerza. Mientras que las vesículas de varios tamaños se pueden usar para preparar bicapas, este protocolo se centra en pequeñas y grandes vesículas unilamelares. Bicapas soportadas que fase separada en líquido ordenado (L o) y (L d) fases desordenadas líquidos se caracterizaron 11,15. La membrana se compone de di-oleoil-fosfatidilcolina (DOPC), esfingomielina (SM) y el colesterol (Chol) en 2: 2: 1. Esta composición modelos las balsas de lípidos, que se proponen a comportarse como plataformas importantes para el tráfico de proteínas y la clasificación, la señalización celular y otros procesos celulares 23,24.

<table><tbody><tr><td>1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td>850375P</td><td>Se presenta en forma de polvo liofilizado en viales sellados. Disuelva todo el polvo en cloroformo al abrirlo. Almacene el extra en forma de películas lipídicas secas, en atmósfera inerte, a -20 &nbsp; &deg;C. Visite <a href="http://www.avantilipids.com/index.php?option=com_content&amp; ver=artículo& id=1679& Itemid=398">aquí</a> para obtener más información sobre el almacenamiento y la manipulación.</td></tr><tr><td>Esfingomielina (Cerebro, Porcino)</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td>860062P</td><td>Se presenta en forma de polvo liofilizado en grandes recipientes de plástico sellados. Disuelva la punta de una espátula de polvo en cloroformo al abrir. Almacene el extra en forma de películas lipídicas secas, en atmósfera inerte, a -20 &nbsp; &deg;C. Visita <a href="http://www.avantilipids.com/index.php?option=com_content&amp; ver=artículo& id=1679& Itemid=398">aquí</a> para obtener más información sobre el almacenamiento y la manipulación.</td></tr><tr><td>Colesterol</td><td>Avanti Lípidos Polares, Inc.</td><td>700000P</td><td>Se presenta en forma de polvo liofilizado en grandes recipientes de plástico sellados. Disuelva la punta de una espátula de polvo en cloroformo al abrir. Almacene el extra en forma de películas lipídicas secas, en atmósfera inerte, a -20 &nbsp; &deg;C. Visita <a href="http://www.avantilipids.com/index.php?option=com_content&amp; ver=artículo& id=1679& Itemid=398">aquí</a> para obtener más información sobre el almacenamiento y la manipulación.</td></tr><tr><td>Cloruro de sodio (NaCl), 99,8%</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>9265.1</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de potasio (KCl), 88%</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Hidrogenofosfato de sodio (Na2HPO4), >99%</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A1046</td><td></td></tr><tr><td>Dihidrogenofosfato de potasio (KH2PO4), 99%</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>3904.1</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de calcio dihidratado (CaCl2), grado de biología molecular</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A4689</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, grado de biología molecular</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A3724</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos de vidrio, 24&nbsp; x&nbsp; 60&nbsp; milímetros, 1&nbsp; mm de espesor</td><td>Duran Group</td><td>2355036</td><td></td></tr><tr><td>Juego de punzones y troqueles</td><td>Precision Brand Products, Inc</td><td>40105</td><td></td></tr><tr><td>Adhesivo óptico</td><td>Norland Products, Inc.</td><td>NOA 88</td><td>Adhesivo líquido que se endurece cuando se cura bajo luz UV de longitud de onda larga.</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Mica bloquea NSC</td><td>Mica Exports Ltd.</td><td></td><td>Se trata de piezas de mica de al menos 1 pulgada cuadrada de área y grosor que van desde 0,006 pulgadas hasta 0,016 pulgadas. Son cortados a un tamaño específico por la empresa para su envío. Los pequeños discos de mica se pueden perforar a partir de los bloques de mica con el juego de punzones y troqueles. Manipule siempre la mica con guantes o pinzas.</td></tr><tr><td>Equipo de laboratorio</td><td>Barrenador de grasa Chemie AG</td><td>Glisseal N</td><td></td></tr><tr><td>Extrusora de liposomas</td><td>Avestin</td><td>LiposoFast-Basic</td><td>Como alternativa, también se pueden consultar las ofertas de Northern Lipids, Inc.</td></tr><tr><td>Cinta adhesiva</td><td>3M</td><td>Scotch(R) Magic (TM) Cinta 810 (1 pulgada)</td><td></td></tr><tr><td>Sonicador de baño</td><td>Bandelin Sonorex Digitec</td><td>DT-31</td><td>Sin calentamiento, Frecuencia: 35 kHz, Potencia máxima ultrasónica: 160 W, Potencia HF: 40 W. (<a href="http://www.bandelin.com/datenblaetter/dt/DT_31_H_1798d_DE_GB_FR_BANDELIN.pdf">Hoja de datos</a>)</td></tr><tr><td>Nitruro de silicio AFM Cantilever&nbsp;</td><td>Sondas Bruker AFM</td><td>DNP-10</td><td>Cada voladizo tiene cuatro puntas y su radio nominal de punta es de 20 nm (con un máximo posible de 60&nbsp; nm). Según las especificaciones, utilizamos la punta D con una frecuencia de resonancia de 18 kHz y una constante de resorte nominal de 0,06 N/m.</td></tr><tr><td>AFM</td><td>JPK</td><td>JPK Nanowizard II montado en Zeiss Axiovert 200</td><td></td></tr></tbody></table>

fuerza atómica microscopía imaging y fuerza espectroscopia de admitidos bilayers lípidos

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

La microscopía de fuerza atómica (AFM) es una técnica de imagen versátil y de alta resolución que permite la visualización de membranas biológicas. Tiene suficiente aumento para examinar subestructuras de membrana e incluso moléculas individuales. AFM puede actuar como una sonda de fuerza para medir las interacciones y las propiedades mecánicas de las membranas. Las bicapas lipídicas soportadas se utilizan convencionalmente como modelos de membrana en estudios de AFM. En este protocolo, demostramos cómo preparar bicapas soportadas y caracterizar su estructura y propiedades mecánicas utilizando AFM. Estos incluyen el espesor de la bicapa y la fuerza de ruptura. 
La información proporcionada por la imagen AFM y la espectroscopia de fuerza ayuda a definir las propiedades mecánicas y químicas de las membranas. Estas propiedades desempeñan un papel importante en los procesos celulares, como el mantenimiento de la hemostasia celular del estrés ambiental, la unión de las proteínas de membrana y la estabilización de los complejos proteicos.

Bicapas soportadas lípidos compuestos por DOPC: SM: Chol (2: 2: 1) se obtuvieron imágenes de AFM (Figura 2 AC). Debido a la composición lipídica, se observaron SM / Chol-rica o L y DOPC-ricos fases L d. El perfil de la altura de la imagen AFM puede proporcionar información importante sobre la estructura de la membrana. Al observar el perfil de altura, el espesor de la bicapa se puede medir en presencia de defectos en la membrana (Figura 2B), o la diferencia de altu...

Describimos un protocolo para la preparación de bicapas lipídicas soportadas y su caracterización utilizando microscopía de fuerza atómica y espectroscopía de fuerza.

Fuerza Atómica Microscopía Imaging y Fuerza Espectroscopia de admitidos Bilayers lípidos

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

El objetivo general del siguiente experimento es obtener imágenes y analizar las propiedades físicas de membranas con separación de fases utilizando microscopía de fuerza atómica. Esto se logra primero mezclando dilio, fosfatidilcolina, fgo, mielina y colesterol en una proporción de dos a dos a uno para formar una mezcla lipídica con separación de fases. A continuación, se preparan bicapas lipídicas soportadas depositando la suspensión de liposomas sobre una superficie de MICA mediante microscopía de fuerza atómica.A continuación, se escanea la superficie de la bicapa, generando una imagen topográfica en la que se pueden medir características estructurales como la altura. Después, se realiza espectroscopía de fuerza en áreas específicas de la bicapa para investigar sus propiedades físicas, especialmente la fuerza de ruptura y el grosor de la membrana. En última instancia, los resultados muestran diferencias en las propiedades entre distintas fases lipídicas basadas en imágenes de MF y curvas de fuerza.La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la microscopía de fluorescencia es el aumento en resolución y las propiedades adicionales que un microscopio de fuerza puede analizar en la muestra. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biofísica, como la estructura de las membranas biológicas y las proteínas integradas en dichas membranas. Además, también podemos examinar las propiedades físicas de la membrana y monitorear cómo los cambios en su composición o la adición de agentes activos sobre la membrana podrían alterar estas propiedades.Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades debido a la naturaleza frágil de la muestra. Esto tiene implicaciones en la preparación de la muestra, el manejo, la elección de los cantiléveres y las condiciones de imagenología y espectroscopía de FM. Comience disolviendo DOPC, spino, mielina y colesterol en cloroformo a las concentraciones deseadas. Luego combine 18,38 microlitros de DOPC, 17,1 microlitros de sing mielina y 11,3 microlitros de colesterol para obtener una solución con un miligramo de lípidos totales y una relación molar de dos a dos a uno, respectivamente.Mezcle una solución mediante vortex, seque la mezcla utilizando un gas inerte como nitrógeno y luego séquela más bajo vacío durante al menos una hora. A continuación, disuelva los lípidos secos en 100 microlitros de PBS hasta una concentración de 10 miligramos por mililitro. Agite la mezcla vigorosamente mediante vortex durante aproximadamente un minuto.Para obtener una suspensión turbia que contenga vesículas multilaminares. Asegúrese de que no queden películas de lípidos adheridas a las paredes del vial. Tome 10 microlitros de la suspensión de lípidos multilaminares y agregue 150 microlitros de tampón para bicapa lipídica soportada.Luego, mezcle una solución y transfiérala a un pequeño vial de vidrio con tapa de dos mililitros y séllelo con película de parafina. Someta la mezcla a ultrasonido a temperatura ambiente en un baño ultrasónico durante 10 minutos. Durante este tiempo, la solución debe volverse clara y producirá vesículas pequeñas unilaminares con un diámetro de aproximadamente 50 nanómetros.Lave las laminillas de vidrio con agua, seguido de etanol, y luego déjelas secar al aire. A continuación, tome los discos de MICA y retire la capa externa utilizando cinta adhesiva. Fije el disco de MICA a una laminilla utilizando una gota de pegamento transparente ópticamente claro.Luego, sujete cilindros de plástico a la mica utilizando grasa de vacío y asegúrese de que no haya fugas. Pipetee toda la solución de liposomas directamente sobre la mica y agregue 140 microlitros adicionales de tampón de bicapa lipídica soportada para alcanzar un volumen de 300 microlitros. A continuación, agregue 0,9 microlitros de una solución unimolar de cloruro de calcio para alcanzar una concentración final de tres milimolar de calcio, incube las muestras durante dos minutos a 37 grados Celsius y luego durante al menos 10 minutos a 65 grados Celsius; en este paso, también precaliente el tampón de bicapa lipídica soportada a 65 grados Celsius.Agregue tampón si es necesario para asegurar que la muestra no se seque. Cubrir la cámara de muestra con un cubreobjetos también mantendrá la muestra hidratada. Luego, enjuague suavemente la muestra con el tampón de capa de lípidos soportados precalentado de 10 a 15 veces para eliminar el calcio y las vesículas no fusionadas.Tenga especial cuidado durante los pasos de lavado para evitar que la bicapa se seque después de los lavados. Enfríe las bicapas soportadas hasta temperatura ambiente. Antes de realizar mediciones en el microscopio de fuerza atómica, prepare el microscopio de fuerza atómica o un FM para realizar imágenes de las bicapas lipídicas en solución.Utilizando el modo de contacto según las especificaciones del fabricante, agregue tampón a la muestra para mantenerla sumergida en tampón durante todo el experimento. Monte la muestra en la etapa de MF-A y asegúrese de que todos los módulos de aislamiento de vibraciones estén encendidos. Espere al menos 15 minutos para que el sistema alcance el equilibrio y se reduzca la deriva térmica.A continuación, acérquese a la muestra en modo de contacto con una punta blanda de cantiléver FM hasta lograr el contacto. Dado que las bicapas son muy frágiles, minimice el punto de ajuste de la punta FM durante la adquisición de imágenes en modo de contacto para mantener la fuerza al mínimo y corregir la deriva térmica mientras se mantiene el contacto con la muestra. Una vez finalizada la adquisición, procese las imágenes ajustando cada línea de escaneo a funciones polinómicas de nivelación.Realice la eliminación de líneas en escaneos que pierdan contacto con la membrana. Utilizando el software propietario de la empresa fabricante del microscopio de fuerza atómica, calibre el cantiléver siguiendo el protocolo del fabricante para determinar la conversión correcta de la señal eléctrica en una medición de fuerza. Después de obtener una imagen de un área de la bicapa, seleccione una región de cinco micrómetros por cinco micrómetros en la bicapa para realizar espectroscopia de fuerza.Configure los microscopios de fuerza atómica (AFM) para que tomen curvas de fuerza en una cuadrícula de 16 por 16 en esa región, obteniendo así 256 curvas de fuerza por región. Luego, establezca el desplazamiento del piso Z en 400 nanómetros. Esto determina el rango máximo de movimiento del piezo en el eje Z y asegura que el cantiléver se haya retirado completamente de la muestra entre mediciones.A continuación, configure la velocidad de aproximación en 800 nanómetros por segundo y la velocidad de retracción en 200 nanómetros por segundo. También establezca la fuerza objetivo máxima para cada curva de fuerza, en este caso, 12 nano Newton. Después de configurar todos los parámetros, adquiera las curvas de fuerza presionando el botón de ejecución del software de MF A.Adquiera al menos 500 curvas de fuerza para cada condición para garantizar una buena estadística, trace un histograma de los valores y luego ajuste los histogramas a una distribución gaussiana para obtener el pico y el ancho de la distribución. Debido a la composición lipídica utilizada en este estudio, se forman dos regiones principales de la membrana. Existe una región líquida ordenada compuesta por fing, mielina y colesterol, y una región líquida desordenada compuesta principalmente por DOPC.El perfil de altura obtenido mediante la imagenología de AFM puede proporcionar información importante sobre la estructura de la membrana al analizar el perfil de altura. El grosor de la bicapa se puede medir aprovechando la presencia de defectos en la membrana. El mapa de altura también puede utilizarse para medir la diferencia de altura entre las fases ordenadas y desordenadas.Las curvas de fuerza derivadas del modo de espectroscopía de fuerza se utilizan para medir la fuerza de ruptura tomando el valor de fuerza en el pico de la curva de fuerza, como se muestra aquí. Además, el grosor de la membrana puede determinarse restando el valor de distancia desde el pico de la curva de fuerza hasta el valor de distancia cuando la curva de fuerza comienza a aumentar nuevamente. Al realizar este procedimiento, es importante recordar mantener la solución de estratificación B y monitorear constantemente el ensamblaje de FM para corregir los efectos de la deriva térmica y la acumulación de D en la punta tras seguir este procedimiento.Se pueden realizar otros métodos como la microscopía de fluorescencia confocal para responder preguntas adicionales, como la dinámica de membranas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar bicapas soportadas y utilizar un microscopio de fuerza para imaginar e investigar las propiedades físicas de estas bicapas.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

En este video, demostramos las interacciones proteína-fosfoinositida en un patrón microfluídico utilizando el ensayo de modulación de pH, utilizando un colorante fluorescente sensible al pH marcado con el lípido de fosfatidiletanolamina de una bicapa lipídica soportada, llamada plataforma microfluídica. Las modulaciones en el pH después de la unión de proteínas a fosfolípidos causan extinción de fluorescencia.

Ensayo de modulación del pH en bicapas lipídicas soportadas para detectar interacciones proteína-fosfoinositida

Presentamos un método de preparación de mica apoyado bicapas lipídicas de microscopía de alta resolución. La mica es transparente y plana en una escala atómica, pero rara vez se utiliza en la formación de imágenes debido a dificultades de manejo; nuestra preparación resulta en la deposición uniforme de la hoja de mica, y reduce el material utilizado en la preparación bicapa.

Preparación de Mica Soportado bicapa lipídica de Alta Resolución Microscopía Óptica de Imagen

Se presenta un protocolo para acoplar una gran variedad de moléculas individuales covalentemente en una punta AFM. Se proporcionan procedimientos y ejemplos para determinar la fuerza de adhesión y la energía libre de estas moléculas sobre soportes sólidos y bio-interfaces.

Investigando individual molécula de adhesión por espectroscopia de fuerza atómica

Se presenta un protocolo experimental para formar una bicapa lipídica apoyado sobre soportes sólidos sin usar vesículas lipídicas. Se demuestra un método de un solo paso para formar una bicapa lipídica en dióxido de silicio y oro, así como membranas soportadas con dominio enriquecida en colesterol para diversas aplicaciones biológicas.

Biomembrana Fabrication por la bicapa lipídica (SALB) Método-Solvente asistida

Aquí se muestra la preparación de bicapas lipídicas planas funcionalizadas con proteínas, la determinación de la movilidad de las proteínas en su interior y la medición de las densidades de las proteínas. Se esboza una hoja de ruta para la construcción de un microscopio de reflexión interna total con reducción de ruido, que permite visualizar fluorocromos residentes de una sola capa con alta resolución espacio-temporal.

Bilayers Individual Molécula microscopía de fluorescencia en planar compatibles

A continuación, se presenta un protocolo para detectar eventos individuales, SNARE mediada por liposomas y de fusión entre bicapas soportadas en los canales de microfluidos utilizando TIRFM polarizado, con sensibilidad única molécula y ~ 15 ms tiempo de resolución. Lípidos y liberación de carga solubles se pueden detectar de forma simultánea. tamaño de los liposomas, de difusividad de los lípidos, y poro de fusión propiedades se miden.

La fusión mediada por SNARE de proteoliposomas individual con bicapas soportadas atados en una celda de flujo de microfluidos supervisado por microscopía TIRF polarizada

Se presenta un método para lograr imágenes de alta resolución subnanométricas con (modo de descarga) con modulación de amplitud en la microscopía de fuerza atómica líquido. El método se muestra en microscopios de fuerza atómica comerciales. Se explica la razón de ser de nuestras opciones de parámetros y sugerir estrategias para la optimización resolución.

Resolución de imagen subnanométrica con modulación de amplitud en microscopía de fuerza atómica en Líquido

Este artículo describe los protocolos para la preparación de muestras, la reducción de datos y el análisis de datos en estudios de eco de espín de neutrones (NSE) de membranas lipídicas. El etiquetado juicioso de los lípidos con deuterio permite el acceso a diferentes dinámicas de membrana en escalas de longitud y tiempo mesoscópicas, sobre las cuales ocurren procesos biológicos vitales.

Espectroscopía de eco de espín de neutrones como una sonda única para la dinámica de la membrana lipídica y las interacciones membrana-proteína

Este protocolo describe la formación de vesículas unilipídicas y multilipídicas que imitan a las células, bicapas lipídicas soportadas y bicapas lipídicas suspendidas. Estos modelos in vitro se pueden adaptar para incorporar una variedad de tipos de lípidos y se pueden utilizar para investigar diversas interacciones de moléculas y macromoléculas.

Ensamblaje de modelos de bicapa lipídica soportada y suspendida de imitación celular para el estudio de interacciones moleculares

La cuantificación del área de contacto y la fuerza aplicada por la punta de una sonda de microscopio de fuerza atómica (AFM) a una superficie de muestra permite la determinación de propiedades mecánicas a nanoescala. Se discuten las mejores prácticas para implementar la nanoindentación basada en voladizo AFM en aire o fluido en muestras blandas y duras para medir el módulo elástico u otras propiedades nanomecánicas.

Atomic Force Microscopy Cantilever-Based Nanoindentation: Mechanical Property Measurements at the Nanoscale in Air and Fluid

Se presenta un protocolo experimental para ensamblar, estimular eléctricamente y analizar bicapas de interfaz de gotas dopadas con gramicidina A. Las relaciones estructura-función lipídio-proteína se cuantifican midiendo cambios en el área de membrana, el flujo iónico y la conductancia de canal único, y relacionando estas respuestas con cambios similares a la plasticidad en la conducción iónica en un modelo de membrana inspirado en sinapsis eléctricas.

Caracterización de la estructura y función de la membrana lipído-proteína usando bicapas de interfaz de gotas

Aprende a preparar bicapas lipídicas admitidas y caracterizar su estructura mediante microscopía de fuerza atómica y espectroscopía de fuerza. Este protocolo permite investigar propiedades mecánicas de membranas biológicas con alta resolución.

Fuerza Atómica Microscopía Imaging y Fuerza Espectroscopia de admitidos Bilayers lípidos

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