Fuerza Atómica Microscopía Imaging y Fuerza Espectroscopia de admitidos Bilayers lípidos

El objetivo general del siguiente experimento es obtener imágenes y probar las propiedades físicas de las membranas de separación de fases utilizando microscopía de fuerza atómica. Esto se logra mezclando primero dilio, fosfatidilcolina, fgo, mielina y colesterol en una proporción de dos a dos a uno para formar una mezcla de lípidos que separe la fase. A continuación, las bicapas lipídicas soportadas se preparan depositando la suspensión de liposomas en una superficie de MICA mediante microscopía de fuerza atómica.

A continuación, se escanea la superficie de la bicapa, produciendo una imagen topográfica en la que se pueden medir las características estructurales como la altura. La espectroscopia de fuerza siguiente se realiza en áreas específicas de la bicapa para sondear las propiedades físicas de la bicapa, en particular la fuerza de ruptura y el espesor de la membrana. En última instancia, los resultados muestran diferencias en las propiedades entre las diferentes fases lipídicas basadas en imágenes FM y curvas de fuerza.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la microscopía de fluorescencia, es el aumento de la resolución y las propiedades adicionales que un FM puede sondear en la muestra. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biofísica, como la estructura de las membranas biológicas y las proteínas incrustadas en dichas membranas. Además, también podemos observar las propiedades físicas de la membrana y monitorear cómo los cambios en la composición o el aumento de los agentes activos de la membrana podrían cambiar estas propiedades.

Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades debido a la naturaleza frágil de la muestra. Esto tiene implicaciones en la preparación de la muestra, el manejo de la elección de voladizos y las condiciones de imagen y espectroscopia FM Comience por disolver DOPC, espino, mielina y colesterol en cloroformo en las concentraciones deseadas. A continuación, combine 18,38 microlitros de DOPC, 17,1 microlitros de mielina y 11,3 microlitros de colesterol para hacer una solución con un miligramo de lípidos totales y una proporción molar de dos a dos a uno, respectivamente.

Mezcle una solución por vórtice, seque la mezcla con un gas inerte como el nitrógeno y luego séquela más al vacío durante al menos una hora. A continuación, disuelva los lípidos secos en 100 microlitros de PBS hasta una concentración de 10 miligramos por mililitro. Mezcle en vórtice vigorosamente durante aproximadamente un minuto.

Para obtener una suspensión turbia que contiene vesículas multilaminares. Asegúrese de que no queden películas lipídicas adheridas a los lados del vial. Tome 10 microlitros de la suspensión lipídica multilaminar y agregue 150 microlitros de tampón bicapa lipídica compatible.

Luego mezcle una solución y transfiérala a un pequeño frasco de vidrio con tapa de dos mililitros y séllelo con sonicate de película para. La mezcla a temperatura ambiente en un baño sonicar durante 10 minutos. Durante este tiempo, la solución debe volverse clara y producirá pequeñas uni o vesículas con un diámetro de aproximadamente 50 nanómetros.

Lave los cubreobjetos de vidrio en agua seguido de etanol y luego déjelos secar al aire. A continuación, tome los discos de Micah y despegue la capa exterior con cinta adhesiva. Fije el disco de MICA a un cubreobjetos con una gota de pegamento transparente ópticamente transparente.

A continuación, fije los cilindros de plástico a la MICA con grasa para vacío y asegúrese de que no haya fugas. Coloque toda la solución de liposomas directamente sobre la mica y agregue 140 microlitros adicionales de tampón bicapa lipídica compatible para alcanzar un volumen de 300 microlitros. A continuación, agregue 0,9 microlitros de una solución molar de cloruro de calcio para alcanzar una concentración final de tres milimolares de calcio, incube las muestras durante dos minutos a 37 grados Celsius y luego durante al menos 10 minutos a 65 grados Celsius durante este paso, también precaliente el tampón de bicapa lipídica compatible a 65 grados Celsius.

Agregue tampón si es necesario para asegurarse de que la muestra no se seque. Cubrir la cámara de muestras con un cubreobjetos también mantendrá la muestra hidratada. A continuación, enjuague la muestra suavemente con el tampón lipídico por capa precalentado de 10 a 15 veces para eliminar el calcio y las vesículas no fusionadas.

Tenga especial cuidado durante los pasos de lavado para evitar que la bicapa se seque después de los pasos de lavado. Enfríe las bicapas soportadas a temperatura ambiente. Antes de realizar mediciones en el microscopio de fuerza atómica, configure el microscopio de fuerza atómica o un FM para realizar imágenes de las bicapas lipídicas en una solución.

Utilizando el modo de contacto de acuerdo con las especificaciones del fabricante, añada tampón a la muestra para mantenerla sumergida en tampón durante todo el experimento. Monte la muestra en la platina A FM y asegúrese de que todos los módulos de aislamiento de vibraciones estén encendidos. Espere al menos 15 minutos para que el sistema se equilibre y reduzca la deriva térmica.

A continuación, acérquese a la muestra en modo de contacto con una punta en voladizo suave a FM hasta que se haga contacto. Como las bicapas son muy frágiles, minimice el punto de ajuste de la punta A FM durante la obtención de imágenes en modo de contacto para mantener la fuerza al mínimo y corregir la deriva térmica mientras mantiene el contacto con la muestra. Una vez completada la imagen, procese las imágenes ajustando cada línea de escaneo a las funciones de nivelación polinómica.

Realice la eliminación de líneas para escaneos que pierdan contacto con la membrana. Utilizando el software propietario de la empresa fabricante A FM, calibre el voladizo siguiendo el protocolo del fabricante para determinar la correcta conversión de la señal eléctrica en una medición de fuerza. Después de obtener imágenes de un área de la bicapa, seleccione una región de cinco micras por cinco micras en la bicapa para realizar la espectroscopia de fuerza.

Configure los AFM que toma curvas de fuerza en una cuadrícula de 16 por 16 de esa región, lo que da como resultado 256 curvas de fuerza por región. A continuación, configure el desplazamiento del piso Z a 400 nanómetros. Esto determina el rango máximo de movimiento del piezoeléctrico z y asegura que el voladizo se haya retraído completamente de la muestra entre mediciones.

A continuación, establezca la velocidad de aproximación a 800 nanómetros por segundo y la velocidad de retracción a 200 nanómetros por segundo. Establezca también la fuerza objetivo máxima para cada curva de fuerza en este caso, 12 nano Newton. Después de configurar todos los parámetros, adquiera curvas de fuerza presionando el botón de ejecución del software A FM.

Adquiera al menos 500 curvas de fuerza para cada condición para garantizar buenas estadísticas, trace un histograma de los valores y luego ajuste los histogramas a una distribución gaussiana para obtener el pico y el ancho de la distribución. Debido a la composición lipídica utilizada en este estudio, se forman dos regiones principales de la membrana. Hay una región líquida ordenada que está compuesta por fing, mielina y colesterol, y una región líquida desordenada que está compuesta principalmente por DOPC.

El perfil de altura de la imagen A FM puede proporcionar información importante sobre la estructura de la membrana al observar el perfil de altura. El espesor de la bicapa se puede medir utilizando la presencia de defectos en la membrana. El mapa de altura también se puede utilizar para medir la diferencia de altura entre las fases ordenadas y desordenadas.

Las curvas de fuerza derivadas del modo de espectroscopia de fuerza se utilizan para medir la fuerza de ruptura mediante el cálculo del valor de la fuerza en el pico de la curva de fuerza, como se muestra aquí. Además, el espesor de la membrana se puede obtener restando el valor de la distancia desde el pico de la curva de fuerza al valor de la distancia. Cuando la curva de fuerza comienza a subir de nuevo, Al intentar este procedimiento, es importante recordar mantener la solución de capas B y monitorear el ensamblaje FM constantemente para corregir los efectos de la deriva térmica y la acumulación de D en la punta Después de este procedimiento.

Se pueden realizar otros métodos, como la microscopía de fluorescencia confocal, para responder a preguntas adicionales, como la dinámica de membranas. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo prepararse con el apoyo de capas y usar un FM para obtener imágenes e investigar las propiedades físicas de estas bicapas.