Name: Vasodilatación de los vasos aislados y el aislamiento de la matriz extracelular de la piel-apretado ratones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Aprende a aislar la matriz extracelular cardíaca y realizar estudios de vasodilatación ex vivo en ratones de piel tensa para evaluar el efecto del péptido inhibidor de IRF5 en la función vascular.

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Este trabajo fue apoyado por las subvenciones de los NIH HL-089779 (DW), HL-112270 (KAP) y HL-102836 (KAP) y Cimphoni Life Sciences (parte del salario de DW). Los autores agradecen a Meghann Sytsma por editar el manuscrito.

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<li>Krausgruber, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IRF5+promotes+inflammatory+macrophage+polarization+and+TH1-TH17+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">IRF5 promotes inflammatory macrophage polarization and TH1-TH17 responses.</a> Nat. Immunol. 12 (3), 231-238 (2011).</li>
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<li>Weihrauch, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+IRF5+Decoy+Peptide+Reduces+Myocardial+Inflammation+and+Fibrosis+and+Improves+Endothelial+Cell+Function+in+Tight-Skin+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">An IRF5 Decoy Peptide Reduces Myocardial Inflammation and Fibrosis and Improves Endothelial Cell Function in Tight-Skin Mice.</a> PLoS One. 11 (4), 0151999(2016).</li>
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<li>Weihrauch, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+D-4F+on+vasodilation%2C+oxidative+stress%2C+angiostatin%2C+myocardial+inflammation%2C+and+angiogenic+potential+in+tight-skin+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of D-4F on vasodilation, oxidative stress, angiostatin, myocardial inflammation, and angiogenic potential in tight-skin mice.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 293 (3), 1432-1441 (2007).</li>
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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

El objetivo era diseñar un inhibidor IRF5 para dilucidar el papel de IRF5 sobre la inflamación, fibrosis y la función vascular en los corazones de TSK / + ratones. Los resultados son que IRF5D no indujo la proliferación o la apoptosis. Por otra parte, la inflamación se redujo y la función vascular mejorada. Estos datos sugieren que IRF5 juega un papel mecanicista importante en el desarrollo de la inflamación y fibrosis en el corazón de TSK / + ratones y que tiene el potencial de servir como una diana terapéutica. <p...

<html> Regulación del crecimiento celular y la respuesta inmune de muerte celular es fundamental para el papel de la familia de factores de transcripción de factores reguladores de interferón. IRF5 se pone de relieve como crucial para la regulación de la respuesta inmune entre el tipo 1, la promoción de una respuesta inflamatoria y tipo 2, una reparación de tejidos respuesta inmune de orientación. IRF5 es clave en el cáncer de 1, y la autoinmunidad 2, 3, 4, 5. El ratón apretado-piel (Tsk / +) es un modelo para la fibrosis del tejido y la esclerodermia debido a una mutación de duplicación en el gen de la fibrilina-1. Esta mutación da como resultado un apretado-piel y un aumento en el tejido conectivo. Estos ratones desarrollan inflamación miocárdica, fibrosis e insuficiencia finalmente corazón 5, 6, 7,&gt; 8, 9. La esclerodermia es un trastorno fibrótico autoinmune que afecta a aproximadamente 150.000 pacientes en los Estados Unidos 6. Las características de esta enfermedad son la fibrosis de los órganos internos, incluyendo el corazón 7, 8, 9, 10, 11. La naturaleza del estudio exigía el diseño de un péptido inhibidor. El enfoque de software fue elegido sobre un enfoque tradicional usando una visualización de fagos. El enfoque de software es más fácil y menos consume mucho tiempo. El banco de datos RCSB se utiliza para identificar sitios de unión apropiados 12. Para estudiar la interacción del péptido de nuevo diseño con la proteína recombinante y centrarse en los parámetros de unión, se utilizó una técnica llamada interferometría capa biológica. Biocapa interferometría es un techniq basado biosensorue lo que determina la afinidad de unión, de asociación y disociación utilizando un biosensor y una muestra de unión. El biosensor puede ser fluorescente, luminiscentemente, etiquetado radiométricamente y colorimétricamente. La medición se basa en la adición de masa o el agotamiento se asemeja asociación y disociación 13, 14. El objetivo de este estudio fue comprender el papel de IRF5 en la inflamación y la fibrosis miocárdica. El objetivo era profundizar en el papel de IRF5 en el desarrollo de la fibrosis del tejido y la esclerodermia.

<table><tbody><tr><td>&nbsp; Triton X 100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100- 100 ml</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 488 con anticuerpo IgG anti-ratón de cabra &nbsp;</td><td>Reactivo Thermo Fisher</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>Bardford</td><td>Thermo Fisher</td><td>23200</td><td>Pierce&nbsp;</td></tr><tr><td>Biosensores</td><td>Forte-Bio</td><td>MR18-0009</td><td></td></tr><tr><td>CD64 (H-250)</td><td>Santa Cruz Biotechnologies</td><td>sc-15364</td><td></td></tr><tr><td>CellEvent Caspasa-3/7 Sustrato</td><td>Thermo Fisher/Life Technologies</td><td>C10427</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter AQueous One Solution Cell Proliferation Kit de ensayo</td><td>Promega</td><td>G3580</td><td>Promega</td></tr><tr><td>DAPI (4&prime;,6-diamidino-2-fenilindol)</td><td>Thermo Fisher</td><td>D-1306</td><td>dilución 1:1.000 en PBS</td></tr><tr><td>burro anti ratas Alexa 488</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-21208</td><td>dilución 1:1.000 en PBS</td></tr><tr><td>ECL más</td><td>GE healthcare/Amersham</td><td>RPN2133</td><td>Después de mucho ensayo y error, volvimos a este</td></tr><tr><td>Microscopio Eclipse TE 200-U con software de escaneo láser EZ C1</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cabra anti conejo Alexa 488</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-11008</td><td>dilución 1:1.000 en PBS</td></tr><tr><td>HRP&nbsp; anti-cabra</td><td>Santa Cruz Biotechnologies</td><td>sc-516086</td><td>!:10.000 dilución en TBS</td></tr><tr><td>HRP burro anti-ratón</td><td>Santa Cruz Biotechnologies</td><td>sc-2315</td><td>dilución 1:10.000 en</td></tr><tr><td>TBS ICAM-1 anticuerpo</td> Santa <td>Cruz Biotechnologies</td><td>sc-1511</td><td>dilución 1:200 en PBS</td></tr><tr><td>anticuerpo IRF5 (H56)</td><td>Santa Cruz Biotechnologies</td><td>sc-98651</td><td></td></tr><tr><td>Lector de microplacas Elx800</td><td>Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NIMP marcador de neutrófilos</td><td>Santa Cruz Biotechnologies</td><td>sc-133821</td><td>dilución 1:200 en PBS</td></tr><tr><td>Octet RED</td><td>Forte Bio</td><td></td><td>proteína-proteína unión a proteína</td></tr><tr><td>Diseño de péptidos&nbsp; Software Medit SA</td><td>RCSB.org</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Síntesis de proteínas IRF5 recombinantes</td><td>TopGene Technologies</td><td>expresión de proteínas</td><td></td>, servicio de síntesis</tr><tr><td>dodecilo fosfato de sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>436143</td><td>detergente</td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>Pharmacy</td><td></td><td>Schedule III sustancia controlada, se requiere presencia&nbsp;</td></tr><tr><td>Xilacina</td><td>MedVet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3.5X-45X Microscopio estereoscópico con zoom de disección trinocular con luces LED de cuello de cisne</td><td>Am Scope</td><td>SKU: SM-1TSX-L6W</td><td></td></tr><tr><td>Columnas de desalinización Zeba</td><td>Thermofisher</td><td>2161515</td><td></td></tr><tr><td>Endotelial Basal Media EBM Bullet kit El kit</td><td>Lonza</td><td>CC-3124</td><td>contiene suplementos de crecimiento</td></tr><tr><td>VIA-100K</td><td>&nbsp; Boeckeler Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 - 15% TGX gel</td><td>Bio-Rad</td><td>5671081</td><td></td></tr><tr><td>MedSuMo software</td><td>Medit, Palaiseau, Francia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laemmli Buffer</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

vasodilatación de los vasos aislados y el aislamiento de la matriz extracelular de la piel-apretado ratones

Vasodilation of Isolated Vessels and the Isolation of the Extracellular Matrix of Tight-skin Mice

El factor regulador del interferón 5 (IRF5) es crucial para que las células determinen si responden de manera proinflamatoria o antiinflamatoria. La capacidad de IRF5 para cambiar las células de una vía a otra es muy atractiva como diana terapéutica. Diseñamos un péptido señuelo IRF5D con un software de modelado molecular para el diseño de moléculas y péptidos pequeños.
IRF5D inhibió IRF5, redujo las alteraciones en la matriz extracelular y mejoró la vasodilatación endotelial en el ratón de piel tensa (Tsk/+). El Kd de IRF5D para IRF5 recombinante es de 3,72 ± 0,74 x 10-6 M, determinado por experimentos de unión utilizando experimentos de interferometría de biocapas. La proliferación y apoptosis de las células endoteliales (CE) se mantuvieron sin cambios utilizando concentraciones crecientes de IRF5D (0 a 100 μg/mL, 24 h). Los ratones Tsk/+ fueron tratados con IRF5D (1 mg/kg/d por vía subcutánea, 21 d). Las expresiones de IRF5 e ICAM disminuyeron después del tratamiento con IRF5D. La función endotelial mejoró según la vasodilatación de las arterias faciales de los ratones Tsk/+ tratados con IRF5D en comparación con los ratones Tsk/+ sin tratamiento con IRF5D. Como factor de transcripción, IRF5 trafica desde el citosol hasta el núcleo. La translocación se evaluó mediante inmunohistoquímica en miocitos cardíacos cultivados en las diferentes matrices extracelulares cardíacas. El tratamiento con IRF5D del ratón Tsk/+ dio lugar a una reducción del número de núcleos positivos para IRF5 en comparación con los animales sin tratamiento con IRF5D (50 μg/mL, 24 h). Estos hallazgos demuestran el importante papel que desempeña IRF5 en la inflamación y la fibrosis en ratones Tsk/+.

Los resultados demostrados en la Figura 1 muestran cómo diseñar un péptido. La Figura 1, parte superior izquierda, muestra la región (entre las 2 flechas amarillas, los aminoácidos (aa) 425 a 436) en IRF5 que es fosforilada por una serie de quinasas. La figura 1, parte superior derecha, muestra un óvalo de color amarillo donde dominio fosforilada de IRF5 une. La estructura dimérica de 3DSH se hizo girar para observar una hendidura o vall...

Describimos el aislamiento de la matriz extracelular cardíaca de ratones control C57Bl/6J, ratones de piel tensa y ratones de piel tensa tratados con el péptido inhibidor IRF5. También describimos los estudios de vasodilatación en los vasos aislados de C57Bl/6J, ratones de piel tensa y ratones de piel tensa tratados con el péptido inhibidor IRF5.

Vasodilatación de los vasos aislados y el aislamiento de la matriz extracelular de la piel-apretado ratones

The interferon regulatory factor 5 (IRF5) is crucial for cells to determine if they respond in a pro-inflammatory or anti-inflammatory fashion. IRF5's ...

El objetivo general de estos procedimientos para el aislamiento de la matriz extracelular y la vasodilatación ex vivo es estudiar el tratamiento con péptidos inhibidores de IRF5 en roedores. Este método puede ayudar a responder cómo los cambios en la matriz extracelular pueden aumentar o atenuar la progresión de la enfermedad. La principal ventaja de los estudios de vasodilatación es que nos proporcionan una visión de los procesos in vivo sin necesidad de considerar todos los componentes de la señalización.El aislamiento de la matriz extracelular cardíaca puede aplicarse a otros órganos, como la extremidad trasera o el pulmón. Tuvimos la idea por primera vez cuando comenzamos a centrarnos en la duplicación de la fibrilina uno en el ratón de piel tensa, y reconocimos el impacto del cambio en la matriz extracelular y en el comportamiento celular. Después de anestesiar al ratón y prepararlo para la cirugía, abra la piel utilizando un par de tijeras.Cortar desde el pecho hacia lateral del hueso maxilar inferior con cuidado para no alterar el tejido subyacente en la parte frontal de la mandíbula. Luego, diseccionar la arteria fascialis eliminando el tejido blando que la rodea. Durante este procedimiento, tener cuidado de no dañar la arteria.Ba&ntilde;e el tejido expuesto en tamp&oacute;n mops para que permanezca sano. Una vez que la arteria fascialis haya sido completamente expuesta, sujete la fascialis proximal a la primera bifurcaci&oacute;n distal al lugar donde se cortar&aacute; la arteria. A continuaci&oacute;n, c&oacute;rtela de la arteria principal y sostenga la arteria fascialis con la pinza.Corte las dos ramas que salen de la fascialis y luego levante suavemente el vaso mientras secciona las conexiones con el tejido circundante hasta alcanzar la bifurcación. En la bifurcación, corte ambas arterias hijas para liberar el vaso y transfiéralo a un recipiente con tampón mops, donde permanecerá hidratado hasta que sea necesario. Para medir la vasodilatación, primero prepare la cannulación de los vasos.Cargue pipetas de vidrio con un diámetro terminal de 125 a 175 micrones completamente con tampón mops. También llene los depósitos de solución con mops. Ahora canule los vasos aislados.Átelos a pipetas de vidrio utilizando sutura oftálmica. Asegúrese de prevenir la formación de burbujas de aire en las pipetas. A continuación, monte las cámaras de los vasos sobre un microscopio invertido con el accesorio de cámara de video.Corra el video a través del sistema de medición con calibrador de video para obtener una medición en pantalla de los vasos. Ahora presurice los vasos utilizando un proceso de dos pasos. Primero, eleve los depósitos llenos de mops a una altura por encima del vaso equivalente a 20 milímetros de mercurio de presión.Abrir la línea con el mopo al recipiente. A medida que el recipiente se presuriza, buscar signos de fugas alrededor de los amarres y a lo largo de la longitud del recipiente. Si no se encuentran fugas, elevar los reservorios para generar una presión de 60 milímetros de mercurio.Luego, inspeccione los vasos en busca de fugas nuevamente. Una vez que la presión se mantenga sin fugas, equilibre el vaso durante 30 minutos a esta presión. Después de equilibrado, mida la vasodilatación en respuesta a un compuesto de interés.Primero, contraiga el vaso a la mitad o tres cuartas partes mediante la adición de U46619. Deje que la solución bañe los vasos durante seis minutos para estabilizarlos. Luego, agregue gradualmente el compuesto de prueba a la solución del baño, como la acetilcolina.Cada dos minutos, aumente la concentración de la solución de prueba en el baño en 10, comenzando desde 000001 molar y progresando hasta 001 molar. Los cambios en la vasodilatación plantearon interrogantes sobre la señalización. Pero nuestro enfoque está en el corazón.Para reducir el uso de animales, elegimos aislar la matriz extracelular cardíaca para centrarnos en la señalización iniciada desde el exterior. Comience recolectando el corazón de un ratón anestesiado. Transfiera el corazón a un vaso de precipitados cargado con 15 mililitros de dodecilsulfato de sodio hipertónico al uno por ciento.Mantenga la solución agitándose suavemente en una placa agitadora a temperatura ambiente durante 18 horas. Al día siguiente, cambie la solución a 15 mililitros de Triton X100 al 5 % durante 30 minutos, seguido de 15 mililitros de PBS durante 15 minutos. Luego, congele rápidamente la MEC y el nitrógeno líquido en un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros.Una vez congelado, transfiera el tejido a un mortero y pistilo previamente enfriados y muélelo hasta obtener un polvo. Suspenda el polvo en PBS con antibiótico añadido a una concentración de 1:100 en una solución viscosa. Somete la suspensión a sonicación durante 30 a 60 segundos en un baño de hielo con el aparato de sonicación a potencia alta.La proteína de la MEC ya está aislada y debe mantenerse fría. Antes de usar la proteína, mida su concentración utilizando un ensayo de Bradford. El péptido IRF5D es un péptido inhibitorio que difiere considerablemente del IRF5 normal.IRF5D tiene solo 17 aminoácidos y se une al sitio de fosforilación de IRF5. Esto evita la fosforilación y la homodimerización, interfiriendo así con la formación del estado activo de IRF5. Se trataron ratones heterocigotos de piel tensa con IRF5D por vía subcutánea durante tres semanas.El número de neutrófilos y de CD64 disminuyó, según se determinó mediante inmunohistoquímica, en el número promedio de células teñidas por campo de visión. Los tratamientos con IRF5D mejoraron la vasodilatación inducida por acetilcolina en arterias fasciales de ratones heterocigotos con piel tensa tratados con IRF5D en comparación con aquellos tratados con tampón fosfato. En miocitos cultivados derivados del tejido cardíaco de ratones transgénicos, hubo un mayor número de células positivas para IRF5 en cultivos provenientes de ratones heterocigotos con piel tensa que en ratones control.El tratamiento de cualquiera de los cultivos con IRF5D provocó una reducción de núcleos positivos para IRF5. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo descelularizar un corazón. Una vez dominada, esta técnica puede trasladarse a muchos órganos y ayudar a responder una variedad de preguntas. Y recuerde que es importante no sobredigerir la matriz.También debería tener un buen conocimiento sobre cómo diseccionar y colgar la arteria fascialis. Una vez dominada, esta técnica debería tomar aproximadamente 60 minutos y puede utilizarse en prácticamente cualquier lecho vascular. Es importante recordar lo frágil que es el endotelio; proceda con precaución durante la disección.No es infrecuente encontrar músculo liso sano y endotelio dañado.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Presentamos una preparación para la visualización y manipulación de la señalización del calcio en el endotelio microvascular intacta nativo. Tubos endoteliales recién aisladas de las arterias de resistencia de ratones que suministran el músculo esquelético a retener en la morfología vivo y señalización dinámica dentro y entre las células vecinas. Tubos endoteliales pueden prepararse a partir de los microvasos de otros tejidos y órganos.

Aislamiento de microvascular endotelial Tubos de arterias de resistencia Ratón

La matriz extracelular se somete a la remodelación sustancial durante la cicatrización de heridas, la inflamación y la tumorigénesis. Se presenta un novedoso enfoque de inmunofluorescencia microscopía intravital de visualizar la dinámica de fibrilar, así como componentes de la matriz de tipo malla con una alta resolución espacial y temporal mediante epifluorescencia o microscopía de dos fotones.

A largo plazo intravital Inmunofluorescencia imágenes de tejido Componentes de Matriz con epifluorescencia y microscopía de dos fotones

La ventana de la cámara de pliegue cutáneo dorsal murino presentado visualiza una zona de isquemia aguda persistente de un colgajo musculocutáneo. Intravital permisos de microscopía de fluorescencia para epi-evaluación directa y repetitiva de la microvasculatura y la cuantificación de la hemodinámica. Morfológicas y resultados hemodinámicos más pueden ser correlacionados con los análisis histológicos y moleculares.

Lesiones tejido isquémico en la Cámara de los pliegues cutáneos dorsal del ratón: Un modelo de la piel de la aleta para Investigar la isquemia aguda persistente

El objetivo de este protocolo es demostrar las técnicas de aislamiento y cultivo de las células del músculo liso vascular primaria murino (CMLV) de la circulación coronaria. Una vez que se han aislado CMLV, que se pueden utilizar para muchas técnicas de cultivo estándar.

Aislamiento de murino coronaria células musculares lisas vasculares

Se presenta un protocolo para estudiar las interacciones del endotelio de pericitos humanos en ratón usando una variación del ensayo de angiogénesis tapón de gel de matriz.

Estudio in vivo de Interacción Humano-endotelial de pericitos Utilización de Plug Ensayo matriz de gel en el ratón

Protocolos para el estudio de la aorta murina embrionaria y perinatal mediante análisis clonal de en vivo y asignación de destino, explantes aórticos y aislada del músculo liso células se detallan aquí. Estos diversos enfoques facilitan la investigación de la morfogénesis de la aorta embrionaria y perinatal en el desarrollo normal y la patogénesis en la enfermedad.

Utilizan en Vivo y tejido y célula explante enfoques para el estudio de la morfogénesis y la patogenesia de la Aorta embrionaria y Perinatal

Aquí, presentamos un protocolo para medir la salida vascular inducida por la administración intradérmica de agentes de promoción de permeabilidad en la piel murina. Esta técnica puede utilizarse para determinar la capacidad de las moléculas para promover o inhibir la salida vascular o a estudiar los mecanismos moleculares que regulan la permeabilidad vascular.

Evaluación de agentes inductores de la hiperpermeabilidad Vascular en la piel con el ensayo de millas

Este manuscrito describe un protocolo simple para el aislamiento de las arteriolas de la retina de rata que puede utilizarse en, calcio presión y proyección de imagen de miografía estudios electrofisiológicos.

Aislamiento de arteriolas retinianas por estudios de fisiología celular Ex Vivo

Aquí, presentamos un protocolo para un ensayo de arañazos in vitro utilizando fibroblastos primarios y para un ensayo de cicatrización de heridas de piel in vivo en ratones. Ambos ensayos son métodos sencillos para evaluar la cicatrización in vitro e in vivo de heridas.

Ensayo de migración de arañazos y cámara dorsal Skinfold para análisis In Vitro e In Vivo de sanación de heridas

La meta de este protocolo es describir la generación y el análisis volumétrico de los equivalentes humanos vascularizados de la piel usando las técnicas accesibles y simples para la cultura a largo plazo. En la medida de lo posible, se describe la justificación de los pasos para permitir a los investigadores la capacidad de personalizar en función de sus necesidades de investigación.

Generación de equivalentes de piel humana vascularizada autoensamblada

La preparación intensiva de "tubos" endoteliales cerebrales intactos de ratón de las arteriolas del parénquima cerebral se ilustra para estudiar la regulación del flujo sanguíneo cerebral. Además, demostramos las fortalezas experimentales de este modelo de estudio endotelial para imágenes de fluorescencia y medición electrofisiológica de vías clave de señalización celular, incluidos los cambios en el [Ca2+] intracelular y el potencial de membrana.

Aislamiento y análisis funcional del endotelio arteriolar del parénquima cerebral de ratón

Aprende a aislar la matriz extracelular cardíaca y realizar estudios de vasodilatación ex vivo en ratones de piel tensa para evaluar el efecto del péptido inhibidor de IRF5 en la función vascular.

Vasodilatación de los vasos aislados y el aislamiento de la matriz extracelular de la piel-apretado ratones

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