Vasodilatación de los vasos aislados y el aislamiento de la matriz extracelular de la piel-apretado ratones
March 24th, 2017
Describimos el aislamiento de la matriz extracelular cardíaca de ratones control C57Bl/6J, ratones de piel tensa y ratones de piel tensa tratados con el péptido inhibidor IRF5. También describimos los estudios de vasodilatación en los vasos aislados de C57Bl/6J, ratones de piel tensa y ratones de piel tensa tratados con el péptido inhibidor IRF5.
El objetivo general de estos procedimientos para el aislamiento de la matriz extracelular y la vasodilatación ex vivo es estudiar el tratamiento con péptidos inhibidores de IRF5 en roedores. Este método puede ayudar a responder cómo los cambios en la matriz extracelular pueden aumentar o atenuar la progresión de la enfermedad. La principal ventaja de los estudios de vasodilatación es que nos da una idea de los procesos in vivo sin tener que tener en cuenta todos los componentes de señalización.
El aislamiento de la matriz extracelular cardíaca se puede aplicar a otros órganos como la extremidad posterior o el pulmón. Tuvimos la idea por primera vez cuando empezamos a centrarnos en la duplicación de la fibrilina en el ratón de piel tensa, y reconocimos el impacto de la alteración de la matriz extracelular y el comportamiento de las células. Después de anestesiar al ratón y prepararlo para la cirugía, abra la piel con unas tijeras.
Corte desde el tórax hasta el lateral de la mandíbula con cuidado para no alterar el tejido subyacente hacia la parte delantera de la mandíbula. A continuación, diseccione la arteria fascial extirpando el tejido blando que la rodea. Al hacer esto, tenga cuidado de evitar dañar la arteria.
Bañe el tejido expuesto en un tampón de fregona para que permanezcan sanos. Una vez que la arteria fascial haya quedado completamente expuesta, agarre la fascial proximal a la primera bifurcación distal a donde se cortará la arteria. Luego, córtelo lejos de la arteria principal y sujete la arteria fascial con las pinzas.
Corte las dos ramas que salen de la fascial y luego levante suavemente el vaso mientras corta las conexiones con el tejido circundante hasta llegar a la bifurcación. En la bifurcación, corte ambas arterias hijas para liberar el vaso y transfiéralo a un plato de tampón de trapeadores donde permanecerá hidratado hasta que lo necesite. Para medir la vasodilatación, primero prepárese para canular los vasos.
Cargue pipetas de vidrio con un diámetro terminal de 125 a 175 micras llenas de tampón de mopa. También llene los depósitos de solución con trapeadores. Ahora canular los vasos aislados.
Átelos a pipetas de vidrio con sutura oftálmica. Asegúrese de evitar que se formen burbujas de aire en las pipetas. A continuación, monte las cámaras de los recipientes en un microscopio invertido con el accesorio de la cámara de vídeo.
Pase el video a través del sistema de medición del calibrador de video para una medición en pantalla de las embarcaciones. Ahora presurice los recipientes mediante un proceso de dos pasos. En primer lugar, eleve los depósitos llenos de fregonas a una altura por encima del recipiente para obtener 20 milímetros de mercurio de presión.
Abra la línea con las fregonas hasta el recipiente. A medida que el recipiente se presuriza, busque signos de fugas alrededor de los amarres y a lo largo del recipiente. Si no se encuentran fugas, eleve los depósitos para producir 60 milímetros de mercurio de presión.
A continuación, vuelva a inspeccionar los recipientes en busca de fugas. Una vez que la presión se mantenga sin fugas, equilibre el recipiente durante 30 minutos a esta presión. Después de estar equilibrado, mida la vasodilatación en respuesta a un compuesto de interés.
Primero constriña el recipiente de la mitad a tres cuartos agregando U46619. Deje que la solución bañe los recipientes durante seis minutos para que se estabilicen. A continuación, añada gradualmente el compuesto de prueba a la solución de baño, como la acetilcolina.
Cada dos minutos, aumente la concentración de la solución de prueba en el baño en 10, comenzando en 000001 molar y progresando hasta 001 molar. Los cambios en la vasodilatación plantearon preguntas sobre la señalización. Pero nuestro enfoque está en el corazón.
Para reducir el uso de animales, optamos por aislar la matriz extracelular cardíaca para centrarnos en la señalización iniciada desde el exterior. Comience recogiendo el corazón de un ratón anestesiado. Transfiéralo a un vaso de precipitados cargado con 15 mililitros de dodecil sulfato de sodio hipertónico al uno por ciento.
Mantenga la solución revolviendo suavemente en una placa para remover a temperatura ambiente durante 18 horas. Al día siguiente, cambie la solución a 15 mililitros de triton X100 al 5 por ciento durante 30 minutos, seguido de 15 mililitros de PBS durante 15 minutos. A continuación, congele el ECM y el nitrógeno líquido en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros.
Una vez congelado, transfiera el tejido a un mortero preenfriado y muélalo hasta convertirlo en polvo. Suspenda el polvo en PBS con antibiótico añadido a una concentración de 1:100 en una solución viscosa. Sonicar la suspensión durante 30 a 60 segundos en un baño de hielo a un ajuste de alta sonicación.
La proteína ECM ahora está aislada y debe permanecer fría. Antes de usar la proteína, mida su concentración usando un ensayo de Bradford. El péptido IRF5D es un péptido inhibidor que difiere mucho del IRF5 normal.
IRF5D tiene solo 17 aminoácidos y se une al sitio de fosforilación de IRF5. Esto evita la fosforilación y la homodimerización, interfiriendo así con la formación del estado activo de IRF5. Ratones heterocigotos de piel tensa fueron tratados con IRF5D por vía subcutánea durante tres semanas.
El número de neutrófilos y CD64 disminuyó según lo determinado por inmunohistoquímica en el número promedio de células teñidas por campo de visión. Los tratamientos con IRF5D mejoraron la vasodilatación inducida por acetilcolina de las arterias fasciales en ratones heterocigotos de piel tensa tratados con IRF5D en comparación con los tratados con tampón de fosfato. En los miocitos cultivados derivados del tejido cardíaco de los ratones transgénicos, había más células IRF5 positivas en los cultivos de ratones heterocigotos de piel apretada que en los ratones de control.
El tratamiento de cualquiera de los cultivos con IRF5D dio lugar a una reducción de los núcleos positivos para IRF5. Después de ver este video, deberías tener una buena comprensión de cómo descelularizar un corazón. Una vez dominada, esta técnica se puede trasladar a muchos órganos y ayuda a responder a una variedad de preguntas y recuerde que es importante no digerir demasiado la matriz.
También debe tener una buena comprensión de cómo diseccionar y colgar la arteria fascial. Una vez dominada, esta técnica debería tomar aproximadamente 60 minutos y se puede usar en casi cualquier lecho vascular. Es importante recordar lo frágil que es el endotelio, proceda con precaución durante la disección.
No es raro tener músculo liso sano y endotelio dañado.
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Visión general
Este artículo describe el aislamiento de la matriz extracelular cardíaca de varios modelos de ratón y los estudios de vasodilatación subsiguientes. El enfoque está en entender los efectos del tratamiento con péptido inhibidor de IRF5 en la progresión de la enfermedad.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología cardiovascular
- Investigación de la matriz extracelular
Antecedentes
- El aislamiento de la matriz extracelular es crucial para estudiar su papel en la enfermedad.
- IRF5 está implicado en la progresión de ciertas enfermedades.
- Los ratones de piel tensa exhiben propiedades alteradas de la matriz extracelular.
- Los estudios de vasodilatación proporcionan información sobre la función vascular.
Propósito del estudio
- Aislar la matriz extracelular cardíaca para un análisis posterior.
- Evaluar el impacto del péptido inhibidor de IRF5 en las respuestas vasculares.
- Entender cómo los cambios en la matriz extracelular afectan la progresión de la enfermedad.
Métodos utilizados
- Aislamiento de la matriz extracelular cardíaca de modelos de ratón.
- Estudios de vasodilatación ex vivo en vasos aislados.
- Comparación de respuestas entre ratones control y tratados.
- Preparación quirúrgica de ratones para el aislamiento de la matriz.
Principales resultados
- Aislamiento exitoso de la matriz extracelular cardíaca de diferentes cepas de ratones.
- Las respuestas de vasodilatación variaron entre ratones control y tratados con péptido IRF5.
- Conocer el papel de la matriz extracelular en la función vascular.
- Posibles aplicaciones del método de aislamiento a otros órganos.
Conclusiones
- El estudio destaca la importancia de la matriz extracelular en la salud cardiovascular.
- El tratamiento con péptido inhibidor de IRF5 muestra promesa en la modificación de las respuestas vasculares.
- Se necesita más investigación para explorar las implicaciones para el manejo de la enfermedad.
