Name: Vasodilatación de los vasos aislados y el aislamiento de la matriz extracelular de la piel-apretado ratones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Aprende a aislar la matriz extracelular cardíaca y realizar estudios de vasodilatación ex vivo en ratones de piel tensa para evaluar el efecto del péptido inhibidor de IRF5 en la función vascular.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Este trabajo fue apoyado por las subvenciones de los NIH HL-089779 (DW), HL-112270 (KAP) y HL-102836 (KAP) y Cimphoni Life Sciences (parte del salario de DW). Los autores agradecen a Meghann Sytsma por editar el manuscrito.

<ol><li>Bi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+interferon+regulatory+factor+5+%28IRF5%29+expression+in+human+ductal+carcinoma+correlates+with+disease+stage+and+contributes+to+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Loss of interferon regulatory factor 5 (IRF5) expression in human ductal carcinoma correlates with disease stage and contributes to metastasis.</a> Breast Cancer Res. 13 (6), 111(2011).</li>
<li>Dideberg, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+insertion-deletion+polymorphism+in+the+interferon+regulatory+Factor+5+%28IRF5%29+gene+confers+risk+of+inflammatory+bowel+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">An insertion-deletion polymorphism in the interferon regulatory Factor 5 (IRF5) gene confers risk of inflammatory bowel diseases.</a> Hum Mol Genet. 16 (24), 3008-3016 (2007).</li>
<li>Graham, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+common+haplotype+of+interferon+regulatory+factor+5+%28IRF5%29+regulates+splicing+and+expression+and+is+associated+with+increased+risk+of+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Genet%22%5BJournal%5D)">A common haplotype of interferon regulatory factor 5 (IRF5) regulates splicing and expression and is associated with increased risk of systemic lupus erythematosus.</a> Nat.Genet. 38 (5), 550-555 (2006).</li>
<li>Krausgruber, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IRF5+promotes+inflammatory+macrophage+polarization+and+TH1-TH17+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">IRF5 promotes inflammatory macrophage polarization and TH1-TH17 responses.</a> Nat. Immunol. 12 (3), 231-238 (2011).</li>
<li>Eames, H. L., Corbin, A. L., Udalova, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon+regulatory+factor+5+in+human+autoimmunity+and+murine+models+of+autoimmune+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Res%22%5BJournal%5D)">Interferon regulatory factor 5 in human autoimmunity and murine models of autoimmune disease.</a> Transl Res. 167 (1), 167-182 (2016).</li>
<li>Mayes, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunochip+analysis+identifies+multiple+susceptibility+Loci+for+systemic+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Immunochip analysis identifies multiple susceptibility Loci for systemic sclerosis.</a> Am J Hum Genet. 94 (1), 47-61 (2014).</li>
<li>Dimitroulas, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-and+Macrovascular+Treatment+Targets+in+Scleroderma+Heart+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Pharm+Des%22%5BJournal%5D)">Micro-and Macrovascular Treatment Targets in Scleroderma Heart Disease.</a> Curr Pharm Des. , (2013).</li>
<li>Botstein, G. R., LeRoy, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+heart+disease+in+systemic+sclerosis+%28scleroderma%29%3A+advances+in+clinical+and+pathologic+features%2C+pathogenesis%2C+and+new+therapeutic+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Am+Heart+J%22%5BJournal%5D)">Primary heart disease in systemic sclerosis (scleroderma): advances in clinical and pathologic features, pathogenesis, and new therapeutic approaches.</a> Am Heart J. 102 (5), 913-919 (1981).</li>
<li>Oram, S., Stokes, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+heart+in+scleroderma%5BTitle%5D)+AND+%22Br+Heart+J%22%5BJournal%5D)">The heart in scleroderma.</a> Br Heart J. 23 (3), 243-259 (1961).</li>
<li>Xu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4F+decreases+IRF5+expression+and+activation+in+hearts+of+tight-skin+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">4F decreases IRF5 expression and activation in hearts of tight-skin mice.</a> PLoS One. 7 (12), 52046(2012).</li>
<li>Steen, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+heart+in+systemic+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.Rheumatol.Rep%22%5BJournal%5D)">The heart in systemic sclerosis.</a> Curr.Rheumatol.Rep. 6 (2), 137-140 (2004).</li>
<li>Deshpande, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RCSB+Protein+Data+Bank%3A+a+redesigned+query+system+and+relational+database+based+on+the+mmCIF+schema%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The RCSB Protein Data Bank: a redesigned query system and relational database based on the mmCIF schema.</a> Nucleic Acids Res. 33, Database issue D233-D237 (2005).</li>
<li>Concepcion, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+detection+of+biomolecular+interactions+using+biolayer+interferometry+for+kinetic+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Comb+Chem+High+Throughput+Screen%22%5BJournal%5D)">Label-free detection of biomolecular interactions using biolayer interferometry for kinetic characterization.</a> Comb Chem High Throughput Screen. 12 (8), 791-800 (2009).</li>
<li>Matthew, A. <a target="_blank" href="http://www.ddw-online.com/drug-discovery/p97058-current-biosensor-technologies-in-drug-discovery-summer-06.html">Current biosensor technologies in drug discovery.</a> Drug Discovery. , 69(2006).</li>
<li>Doppelt-Azeroual, O., Moriaud, F., Adcock, S. A., Delfaud, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+MED-SuMo+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Disord+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">A review of MED-SuMo applications.</a> Infect Disord Drug Targets. 9 (3), 344-357 (2009).</li>
<li>Kim, S., Jang, J., Yu, J., Chang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+mucosal+immunization+of+recombinant+adenovirus-based+vaccine+expressing+F1+protein+fragment+induces+protective+mucosal+immunity+against+respiratory+syncytial+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Single mucosal immunization of recombinant adenovirus-based vaccine expressing F1 protein fragment induces protective mucosal immunity against respiratory syncytial virus infection.</a> Vaccine. 28 (22), 3801-3808 (2010).</li>
<li>Frenzel, D., Willbold, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+Titration+Series+with+Biolayer+Interferometry%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Kinetic Titration Series with Biolayer Interferometry.</a> PloS one. 9 (9), 106882(2014).</li>
<li>Ou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-4F%2C+an+apolipoprotein+A-1+mimetic%2C+dramatically+improves+vasodilation+in+hypercholesterolemia+and+sickle+cell+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">L-4F, an apolipoprotein A-1 mimetic, dramatically improves vasodilation in hypercholesterolemia and sickle cell disease.</a> Circulation. 107 (18), 2337-2341 (2003).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal.Biochem. 72 (1-2), 248-254 (1976).</li>
<li>Bauer, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compensatory+phosphorylation+and+protein-protein+interactions+revealed+by+loss+of+function+and+gain+of+function+mutants+of+multiple+serine+phosphorylation+sites+in+endothelial+nitric-oxide+synthase%5BTitle%5D)+AND+%22J.Biol.Chem%22%5BJournal%5D)">Compensatory phosphorylation and protein-protein interactions revealed by loss of function and gain of function mutants of multiple serine phosphorylation sites in endothelial nitric-oxide synthase.</a> J.Biol.Chem. 278 (17), 14841-14849 (2003).</li>
<li>Weihrauch, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+IRF5+Decoy+Peptide+Reduces+Myocardial+Inflammation+and+Fibrosis+and+Improves+Endothelial+Cell+Function+in+Tight-Skin+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">An IRF5 Decoy Peptide Reduces Myocardial Inflammation and Fibrosis and Improves Endothelial Cell Function in Tight-Skin Mice.</a> PLoS One. 11 (4), 0151999(2016).</li>
<li>Hoogenboom, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+phage+display+technology+and+its+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Immunotechnology%22%5BJournal%5D)">Antibody phage display technology and its applications.</a> Immunotechnology. 4 (1), 1-20 (1998).</li>
<li>Roehm, N. W., Rodgers, G. H., Hatfield, S. M., Glasebrook, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+colorimetric+assay+for+cell+proliferation+and+viability+utilizing+the+tetrazolium+salt+XTT%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">An improved colorimetric assay for cell proliferation and viability utilizing the tetrazolium salt XTT.</a> J Immunol Methods. 142 (2), 257-265 (1991).</li>
<li>Van Tonder, A., Joubert, A. M., Cromarty, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limitations+of+the+3-%284%2C+5-dimethylthiazol-2-yl%29-2%2C+5-diphenyl-2H-tetrazolium+bromide+%28MTT%29+assay+when+compared+to+three+commonly+used+cell+enumeration+assays%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Res+Notes%22%5BJournal%5D)">Limitations of the 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) assay when compared to three commonly used cell enumeration assays.</a> BMC Res Notes. 8 (1), 1(2015).</li>
<li>Ott, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfusion-decellularized+matrix%3A+using+nature%27s+platform+to+engineer+a+bioartificial+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart.</a> Nat Med. 14 (2), 213-221 (2008).</li>
<li>Ou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-4F%2C+an+apolipoprotein+A-1+mimetic%2C+dramatically+improves+vasodilation+in+hypercholesterolemia+and+sickle+cell+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">L-4F, an apolipoprotein A-1 mimetic, dramatically improves vasodilation in hypercholesterolemia and sickle cell disease.</a> Circulation. 107 (18), 2337-2341 (2003).</li>
<li>Weihrauch, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+D-4F+on+vasodilation%2C+oxidative+stress%2C+angiostatin%2C+myocardial+inflammation%2C+and+angiogenic+potential+in+tight-skin+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of D-4F on vasodilation, oxidative stress, angiostatin, myocardial inflammation, and angiogenic potential in tight-skin mice.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 293 (3), 1432-1441 (2007).</li>
<li>Roy, S., P, P. IRF-5 - A New Link to Autoimmune Diseases. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRoy%2C+S+%22Autoimmune+Disorders+-+Pathogenetic+Aspects%22">Autoimmune Disorders - Pathogenetic Aspects</a>. Mavragani, C. , 35(2011).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

El objetivo era diseñar un inhibidor IRF5 para dilucidar el papel de IRF5 sobre la inflamación, fibrosis y la función vascular en los corazones de TSK / + ratones. Los resultados son que IRF5D no indujo la proliferación o la apoptosis. Por otra parte, la inflamación se redujo y la función vascular mejorada. Estos datos sugieren que IRF5 juega un papel mecanicista importante en el desarrollo de la inflamación y fibrosis en el corazón de TSK / + ratones y que tiene el potencial de servir como una diana terapéutica. <p...

<html> Regulación del crecimiento celular y la respuesta inmune de muerte celular es fundamental para el papel de la familia de factores de transcripción de factores reguladores de interferón. IRF5 se pone de relieve como crucial para la regulación de la respuesta inmune entre el tipo 1, la promoción de una respuesta inflamatoria y tipo 2, una reparación de tejidos respuesta inmune de orientación. IRF5 es clave en el cáncer de 1, y la autoinmunidad 2, 3, 4, 5. El ratón apretado-piel (Tsk / +) es un modelo para la fibrosis del tejido y la esclerodermia debido a una mutación de duplicación en el gen de la fibrilina-1. Esta mutación da como resultado un apretado-piel y un aumento en el tejido conectivo. Estos ratones desarrollan inflamación miocárdica, fibrosis e insuficiencia finalmente corazón 5, 6, 7,&gt; 8, 9. La esclerodermia es un trastorno fibrótico autoinmune que afecta a aproximadamente 150.000 pacientes en los Estados Unidos 6. Las características de esta enfermedad son la fibrosis de los órganos internos, incluyendo el corazón 7, 8, 9, 10, 11. La naturaleza del estudio exigía el diseño de un péptido inhibidor. El enfoque de software fue elegido sobre un enfoque tradicional usando una visualización de fagos. El enfoque de software es más fácil y menos consume mucho tiempo. El banco de datos RCSB se utiliza para identificar sitios de unión apropiados 12. Para estudiar la interacción del péptido de nuevo diseño con la proteína recombinante y centrarse en los parámetros de unión, se utilizó una técnica llamada interferometría capa biológica. Biocapa interferometría es un techniq basado biosensorue lo que determina la afinidad de unión, de asociación y disociación utilizando un biosensor y una muestra de unión. El biosensor puede ser fluorescente, luminiscentemente, etiquetado radiométricamente y colorimétricamente. La medición se basa en la adición de masa o el agotamiento se asemeja asociación y disociación 13, 14. El objetivo de este estudio fue comprender el papel de IRF5 en la inflamación y la fibrosis miocárdica. El objetivo era profundizar en el papel de IRF5 en el desarrollo de la fibrosis del tejido y la esclerodermia.

<table><tbody><tr><td>&nbsp; Triton X 100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100- 100 ml</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 488 con anticuerpo IgG anti-ratón de cabra &nbsp;</td><td>Reactivo Thermo Fisher</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>Bardford</td><td>Thermo Fisher</td><td>23200</td><td>Pierce&nbsp;</td></tr><tr><td>Biosensores</td><td>Forte-Bio</td><td>MR18-0009</td><td></td></tr><tr><td>CD64 (H-250)</td><td>Santa Cruz Biotechnologies</td><td>sc-15364</td><td></td></tr><tr><td>CellEvent Caspasa-3/7 Sustrato</td><td>Thermo Fisher/Life Technologies</td><td>C10427</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter AQueous One Solution Cell Proliferation Kit de ensayo</td><td>Promega</td><td>G3580</td><td>Promega</td></tr><tr><td>DAPI (4&prime;,6-diamidino-2-fenilindol)</td><td>Thermo Fisher</td><td>D-1306</td><td>dilución 1:1.000 en PBS</td></tr><tr><td>burro anti ratas Alexa 488</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-21208</td><td>dilución 1:1.000 en PBS</td></tr><tr><td>ECL más</td><td>GE healthcare/Amersham</td><td>RPN2133</td><td>Después de mucho ensayo y error, volvimos a este</td></tr><tr><td>Microscopio Eclipse TE 200-U con software de escaneo láser EZ C1</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cabra anti conejo Alexa 488</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-11008</td><td>dilución 1:1.000 en PBS</td></tr><tr><td>HRP&nbsp; anti-cabra</td><td>Santa Cruz Biotechnologies</td><td>sc-516086</td><td>!:10.000 dilución en TBS</td></tr><tr><td>HRP burro anti-ratón</td><td>Santa Cruz Biotechnologies</td><td>sc-2315</td><td>dilución 1:10.000 en</td></tr><tr><td>TBS ICAM-1 anticuerpo</td> Santa <td>Cruz Biotechnologies</td><td>sc-1511</td><td>dilución 1:200 en PBS</td></tr><tr><td>anticuerpo IRF5 (H56)</td><td>Santa Cruz Biotechnologies</td><td>sc-98651</td><td></td></tr><tr><td>Lector de microplacas Elx800</td><td>Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NIMP marcador de neutrófilos</td><td>Santa Cruz Biotechnologies</td><td>sc-133821</td><td>dilución 1:200 en PBS</td></tr><tr><td>Octet RED</td><td>Forte Bio</td><td></td><td>proteína-proteína unión a proteína</td></tr><tr><td>Diseño de péptidos&nbsp; Software Medit SA</td><td>RCSB.org</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Síntesis de proteínas IRF5 recombinantes</td><td>TopGene Technologies</td><td>expresión de proteínas</td><td></td>, servicio de síntesis</tr><tr><td>dodecilo fosfato de sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>436143</td><td>detergente</td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>Pharmacy</td><td></td><td>Schedule III sustancia controlada, se requiere presencia&nbsp;</td></tr><tr><td>Xilacina</td><td>MedVet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3.5X-45X Microscopio estereoscópico con zoom de disección trinocular con luces LED de cuello de cisne</td><td>Am Scope</td><td>SKU: SM-1TSX-L6W</td><td></td></tr><tr><td>Columnas de desalinización Zeba</td><td>Thermofisher</td><td>2161515</td><td></td></tr><tr><td>Endotelial Basal Media EBM Bullet kit El kit</td><td>Lonza</td><td>CC-3124</td><td>contiene suplementos de crecimiento</td></tr><tr><td>VIA-100K</td><td>&nbsp; Boeckeler Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 - 15% TGX gel</td><td>Bio-Rad</td><td>5671081</td><td></td></tr><tr><td>MedSuMo software</td><td>Medit, Palaiseau, Francia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laemmli Buffer</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

vasodilatación de los vasos aislados y el aislamiento de la matriz extracelular de la piel-apretado ratones

Vasodilation of Isolated Vessels and the Isolation of the Extracellular Matrix of Tight-skin Mice

El factor regulador del interferón 5 (IRF5) es crucial para que las células determinen si responden de manera proinflamatoria o antiinflamatoria. La capacidad de IRF5 para cambiar las células de una vía a otra es muy atractiva como diana terapéutica. Diseñamos un péptido señuelo IRF5D con un software de modelado molecular para el diseño de moléculas y péptidos pequeños.
IRF5D inhibió IRF5, redujo las alteraciones en la matriz extracelular y mejoró la vasodilatación endotelial en el ratón de piel tensa (Tsk/+). El Kd de IRF5D para IRF5 recombinante es de 3,72 ± 0,74 x 10-6 M, determinado por experimentos de unión utilizando experimentos de interferometría de biocapas. La proliferación y apoptosis de las células endoteliales (CE) se mantuvieron sin cambios utilizando concentraciones crecientes de IRF5D (0 a 100 μg/mL, 24 h). Los ratones Tsk/+ fueron tratados con IRF5D (1 mg/kg/d por vía subcutánea, 21 d). Las expresiones de IRF5 e ICAM disminuyeron después del tratamiento con IRF5D. La función endotelial mejoró según la vasodilatación de las arterias faciales de los ratones Tsk/+ tratados con IRF5D en comparación con los ratones Tsk/+ sin tratamiento con IRF5D. Como factor de transcripción, IRF5 trafica desde el citosol hasta el núcleo. La translocación se evaluó mediante inmunohistoquímica en miocitos cardíacos cultivados en las diferentes matrices extracelulares cardíacas. El tratamiento con IRF5D del ratón Tsk/+ dio lugar a una reducción del número de núcleos positivos para IRF5 en comparación con los animales sin tratamiento con IRF5D (50 μg/mL, 24 h). Estos hallazgos demuestran el importante papel que desempeña IRF5 en la inflamación y la fibrosis en ratones Tsk/+.

Los resultados demostrados en la Figura 1 muestran cómo diseñar un péptido. La Figura 1, parte superior izquierda, muestra la región (entre las 2 flechas amarillas, los aminoácidos (aa) 425 a 436) en IRF5 que es fosforilada por una serie de quinasas. La figura 1, parte superior derecha, muestra un óvalo de color amarillo donde dominio fosforilada de IRF5 une. La estructura dimérica de 3DSH se hizo girar para observar una hendidura o vall...

Describimos el aislamiento de la matriz extracelular cardíaca de ratones control C57Bl/6J, ratones de piel tensa y ratones de piel tensa tratados con el péptido inhibidor IRF5. También describimos los estudios de vasodilatación en los vasos aislados de C57Bl/6J, ratones de piel tensa y ratones de piel tensa tratados con el péptido inhibidor IRF5.

Vasodilatación de los vasos aislados y el aislamiento de la matriz extracelular de la piel-apretado ratones

The interferon regulatory factor 5 (IRF5) is crucial for cells to determine if they respond in a pro-inflammatory or anti-inflammatory fashion. IRF5's ...

El objetivo general de estos procedimientos para el aislamiento de la matriz extracelular y la vasodilatación ex vivo es estudiar el tratamiento con péptidos inhibidores de IRF5 en roedores. Este método puede ayudar a responder cómo los cambios en la matriz extracelular pueden aumentar o atenuar la progresión de la enfermedad. La principal ventaja de los estudios de vasodilatación es que nos proporcionan una visión de los procesos in vivo sin necesidad de considerar todos los componentes de la señalización.El aislamiento de la matriz extracelular cardíaca puede aplicarse a otros órganos, como la extremidad trasera o el pulmón. Tuvimos la idea por primera vez cuando comenzamos a centrarnos en la duplicación de la fibrilina uno en el ratón de piel tensa, y reconocimos el impacto del cambio en la matriz extracelular y en el comportamiento celular. Después de anestesiar al ratón y prepararlo para la cirugía, abra la piel utilizando un par de tijeras.Cortar desde el pecho hacia lateral del hueso maxilar inferior con cuidado para no alterar el tejido subyacente en la parte frontal de la mandíbula. Luego, diseccionar la arteria fascialis eliminando el tejido blando que la rodea. Durante e

vasodilation-isolated-vessels-isolation-extracellular-matrix-tight

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Presentamos una preparación para la visualización y manipulación de la señalización del calcio en el endotelio microvascular intacta nativo. Tubos endoteliales recién aisladas de las arterias de resistencia de ratones que suministran el músculo esquelético a retener en la morfología vivo y señalización dinámica dentro y entre las células vecinas. Tubos endoteliales pueden prepararse a partir de los microvasos de otros tejidos y órganos.

Aislamiento de microvascular endotelial Tubos de arterias de resistencia Ratón

La matriz extracelular se somete a la remodelación sustancial durante la cicatrización de heridas, la inflamación y la tumorigénesis. Se presenta un novedoso enfoque de inmunofluorescencia microscopía intravital de visualizar la dinámica de fibrilar, así como componentes de la matriz de tipo malla con una alta resolución espacial y temporal mediante epifluorescencia o microscopía de dos fotones.

A largo plazo intravital Inmunofluorescencia imágenes de tejido Componentes de Matriz con epifluorescencia y microscopía de dos fotones

La ventana de la cámara de pliegue cutáneo dorsal murino presentado visualiza una zona de isquemia aguda persistente de un colgajo musculocutáneo. Intravital permisos de microscopía de fluorescencia para epi-evaluación directa y repetitiva de la microvasculatura y la cuantificación de la hemodinámica. Morfológicas y resultados hemodinámicos más pueden ser correlacionados con los análisis histológicos y moleculares.

Lesiones tejido isquémico en la Cámara de los pliegues cutáneos dorsal del ratón: Un modelo de la piel de la aleta para Investigar la isquemia aguda persistente

El objetivo de este protocolo es demostrar las técnicas de aislamiento y cultivo de las células del músculo liso vascular primaria murino (CMLV) de la circulación coronaria. Una vez que se han aislado CMLV, que se pueden utilizar para muchas técnicas de cultivo estándar.

Aislamiento de murino coronaria células musculares lisas vasculares

Se presenta un protocolo para estudiar las interacciones del endotelio de pericitos humanos en ratón usando una variación del ensayo de angiogénesis tapón de gel de matriz.

Estudio in vivo de Interacción Humano-endotelial de pericitos Utilización de Plug Ensayo matriz de gel en el ratón

Protocolos para el estudio de la aorta murina embrionaria y perinatal mediante análisis clonal de en vivo y asignación de destino, explantes aórticos y aislada del músculo liso células se detallan aquí. Estos diversos enfoques facilitan la investigación de la morfogénesis de la aorta embrionaria y perinatal en el desarrollo normal y la patogénesis en la enfermedad.

Utilizan en Vivo y tejido y célula explante enfoques para el estudio de la morfogénesis y la patogenesia de la Aorta embrionaria y Perinatal

Aquí, presentamos un protocolo para el aislamiento de entero, intacto el ratón glándulas mamarias para investigar la expresión de matriz extracelular (ECM) y morfología ductal. Las glándulas abdominales de ratón #4 se extrajeron de ratones femeninos nulíparas del 8-10 semanas de edad fijado en formalina tamponada neutra, seccionadas y teñido mediante inmunohistoquímica para las proteínas de la ECM.

Aislamiento de las glándulas mamarias del ratón intacto, todo para el análisis de expresión de la matriz extracelular y la morfología de la glándula

Aquí, presentamos un protocolo para medir la salida vascular inducida por la administración intradérmica de agentes de promoción de permeabilidad en la piel murina. Esta técnica puede utilizarse para determinar la capacidad de las moléculas para promover o inhibir la salida vascular o a estudiar los mecanismos moleculares que regulan la permeabilidad vascular.

Evaluación de agentes inductores de la hiperpermeabilidad Vascular en la piel con el ensayo de millas

Este manuscrito describe un protocolo simple para el aislamiento de las arteriolas de la retina de rata que puede utilizarse en, calcio presión y proyección de imagen de miografía estudios electrofisiológicos.

Aislamiento de arteriolas retinianas por estudios de fisiología celular Ex Vivo

Aquí, presentamos un protocolo para un ensayo de arañazos in vitro utilizando fibroblastos primarios y para un ensayo de cicatrización de heridas de piel in vivo en ratones. Ambos ensayos son métodos sencillos para evaluar la cicatrización in vitro e in vivo de heridas.

Ensayo de migración de arañazos y cámara dorsal Skinfold para análisis In Vitro e In Vivo de sanación de heridas

La preparación intensiva de "tubos" endoteliales cerebrales intactos de ratón de las arteriolas del parénquima cerebral se ilustra para estudiar la regulación del flujo sanguíneo cerebral. Además, demostramos las fortalezas experimentales de este modelo de estudio endotelial para imágenes de fluorescencia y medición electrofisiológica de vías clave de señalización celular, incluidos los cambios en el [Ca2+] intracelular y el potencial de membrana.

Aislamiento y análisis funcional del endotelio arteriolar del parénquima cerebral de ratón

Aprende a aislar la matriz extracelular cardíaca y realizar estudios de vasodilatación ex vivo en ratones de piel tensa para evaluar el efecto del péptido inhibidor de IRF5 en la función vascular.

Vasodilatación de los vasos aislados y el aislamiento de la matriz extracelular de la piel-apretado ratones

Explorar más videos