Evaluación de la Viabilidad Neuronal Utilizando Colorante de Fluoresceína-Ioduro de Propidio Doble Coloración en Gránulos Cerebelosos Cultura de Neuronas

El objetivo general de este procedimiento es medir con precisión la viabilidad celular en un cultivo de neuronas granulares cerebelosas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurociencia y la neurofarmacología. La principal ventaja de esta técnica es que podemos distinguir las células gliales indeseadas de las neuronas en los cultivos celulares MISTA.

Las personas que demostrarán los procedimientos serán Lin Jiajia, Wang Jialing y Xu Dilin, tres estudiantes universitarios de mi laboratorio. Comience la disección de las cabezas de ratones de ocho días de edad insertando primero tijeras en el foramen magno y cortando ambos lados del cráneo desde las orejas hasta los ojos. Luego, utilice pinzas para levantar el cráneo.

Utilice pinzas para aislar el cerebelo y colóquelo en una placa de 35 milímetros que contenga solución de disección. Transfiera la placa al platino del microscopio de disección y use dos pares de pinzas para eliminar las meninges y los vasos sanguíneos. Use una hoja para picar los tejidos y luego transfiera el tejido a un tubo de centrífuga que contenga 30 mililitros de solución de disección.

Centrifugar durante cinco minutos a temperatura ambiente a 1.500 x g. Tras la centrifugación, aspirar el sobrenadante y conservar el sedimento. A continuación, añadir la solución de tripsina al sedimento y resuspender agitando suavemente.

Luego, coloque el tubo en un baño de agua a 37 grados Celsius durante 15 minutos. Después de 15 minutos, agregue una solución de DNasa I, inhibidor de tripsina de soja y sulfato de magnesio, y agite. Luego, centrifugue durante cinco minutos a temperatura ambiente a 1.500 × g.

Después de aspirar el sobrenadante, resuspenda el sedimento en una solución menos diluida de DNasa I, inhibidor de la tripsina de soja y sulfato de magnesio. A continuación, prepare dos tubos de 15 mililitros. Coloque la mitad de las células en cada tubo y pipetee hacia arriba y hacia abajo entre 60 y 70 veces utilizando una pipeta de Pasteur con tapón de algodón para homogeneizar las células.

Después de la homogenización, agregue tres mililitros de solución de sulfato de magnesio y cloruro de calcio a cada tubo de 15 mililitros. Deje los tubos reposar a temperatura ambiente durante 10 minutos. Una vez transcurrido el tiempo, retire cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta Pasteur tapada con algodón y transfiera a nuevos tubos de 15 mililitros.

Centrifugar durante cinco minutos a temperatura ambiente y 1,500 x g. Añadir medio de cultivo al precipitado para diluirlo hasta una densidad celular de aproximadamente 1,5 x 10⁶ células por mililitro. Pipetear las células en una placa de 6 pocillos y cultivar en el incubador a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono.

Después de 24 horas, agregue la solución stock de AraC hasta una concentración final de un milimolar para inhibir el crecimiento de las células gliales antes de devolver las placas al incubador. Luego, el día siete, agregue 50 microlitros de solución stock de D-glucosa hasta una concentración final de un milimolar. Comience la tinción mezclando diacetato de fluoresceína hasta una concentración final de 10 microgramos por mililitro y yoduro de propidio hasta una concentración final de 50 microgramos por mililitro en 10 mililitros de PBS.

Mezcle la solución de FDA/PI mediante vortex y coloque en hielo. Coloque la placa de cultivo en hielo. Aspire cuidadosamente el medio de cultivo sin tocar las células con la punta de la pipeta, luego agregue lentamente PBS frío.

Aspire el PBS, luego agregue FDA/PI frío, o la solución de trabajo de FDA/PI o FDA/PI/Hoechst. Coloque la placa en hielo durante cinco minutos. A continuación, después de aspirar la solución de trabajo de FDA/PI o FDA/PI/Hoechst, agregue PBS frío a cada pocillo.

Asegúrese de que el microscopio de fluorescencia esté configurado correctamente. Detecte las emisiones fluorescentes de FDA, PI y Hoechst a 520, 620 y 460 nanómetros, respectivamente, utilizando un tiempo de exposición entre 100 y 300 milisegundos y una ganancia analógica de 2.8 x. Después de obtener las imágenes de fluorescencia, tome una imagen con luz normal utilizando el modo de contraste de fase.

Para la doble tinción con FDA/PI, superponga las imágenes de las células arrastrando la capa positiva para FDA sobre la capa positiva para PI en un software de edición gráfica. Ajuste la opacidad de la capa positiva para FDA ingresando 50 % en el campo de Opacidad del panel de Capas. Combine las dos capas abriendo el menú Capa y haciendo clic en el botón Combinar visible.

Establezca el contraste de las imágenes superpuestas ingresando 50 en el campo Contraste bajo Imagen, Ajustes, Brillo/Contraste. Verifique que no haya células doblemente positivas para FDA y PI en las imágenes superpuestas. Para la tinción triple con FDA/PI/Hoechst, superponga las imágenes de las células arrastrando nuevamente la capa positiva para FDA sobre la capa positiva para PI, ajuste la opacidad de la capa positiva para FDA y combine las imágenes como antes.

Luego arrastre la capa positiva para Hoechst sobre la capa combinada. Ajuste la opacidad de la capa positiva para Hoechst ingresando 50 % en el campo Opacidad del panel Capas, y combine las dos capas abriendo el menú Capa y haciendo clic en el botón Combinar visible. Distinga visualmente las células gliales grandes e irregulares de las neuronas granulares cerebelosas comparando las imágenes tomadas en modo fluorescente con las tomadas en modo de contraste de fase.

Las siguientes imágenes muestran que tanto neuronas pequeñas como células gliales grandes e irregulares están presentes en el cultivo de CGN. Esta imagen muestra la tinción amino de GAP-43 en un cultivo de CGN a los ocho días in vitro. Las flechas azules indican neuronas.

Aquí se muestra la tinción amino de GFAP en células gliales. La flecha blanca indica una célula glial. Esta imagen de contraste de fase muestra la morfología de las células.

La tinción con gancho de FDA/PI, que puede distinguir células gliales de neuronas, es ventajosa para la evaluación precisa de la viabilidad neuronal en cultivos de CGN. Esta es una imagen fusionada de células teñidas con triple coloración crecidas en medio de crecimiento normal. La flecha muestra una célula glial típica.

Aquí, un cultivo similar ha sido tratado con medio que contiene bajo contenido de potasio, y la flecha indica nuevamente una célula glial típica. Además, observe la aparición de la tinción roja con yoduro de propidio. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en dos horas si se lleva a cabo adecuadamente.

Una estrategia similar puede aplicarse a otros cultivos celulares mixtos, como cultivos corticales primarios y cultivos hipocampales primarios, para analizar con precisión la viabilidad neuronal.