Evaluación de la Viabilidad Neuronal Utilizando Colorante de Fluoresceína-Ioduro de Propidio Doble Coloración en Gránulos Cerebelosos Cultura de Neuronas

El objetivo general de este procedimiento es medir con precisión la viabilidad celular en un cultivo de neuronas granulosas cerebelosas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurociencia y la neurofarmacología. La principal ventaja de esta técnica es que podemos distinguir las células gliales no deseadas de las neuronas en cultivos celulares MISTA.

Demostrando los procedimientos estarán Lin Jiajia, Wang Jialing, Xu Dilin, tres estudiantes de pregrado de mi laboratorio. Comience a diseccionar las cabezas de las crías de rata de ocho días insertando primero unas tijeras en el foramen magnum y cortando los dos lados del cráneo desde las orejas hasta los ojos. Luego, use fórceps para levantar el cráneo.

Use fórceps para aislar el cerebelo y colóquelo en un plato de 35 milímetros que contenga solución de disección. Transfiera la placa a la etapa del microscopio de disección y use dos pares de pinzas para extraer las meninges y los vasos sanguíneos. Use una cuchilla para cortar los tejidos y luego transfiera el tejido a un tubo de centrífuga que contenga 30 mililitros de solución de disección.

Centrifugar durante cinco minutos a temperatura ambiente a 1.500 x g. Después de la centrifugación, aspire el sobrenadante y guarde el pellet. A continuación, agregue la solución de tripsina al pellet y vuelva a suspender agitando suavemente.

A continuación, coloque el tubo en un baño de agua a 37 grados centígrados durante 15 minutos. Después de 15 minutos, agregue una solución de DNase One, inhibidor de tripsina de soja y sulfato de magnesio y agite. A continuación, centrifugar durante cinco minutos a temperatura ambiente a 1.500 x g.

Después de aspirar el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet en una solución menos diluida de DNasa One, inhibidor de tripsina de soja y sulfato de magnesio. A continuación, prepara dos tubos de 15 mililitros. Coloque la mitad de las células en cada tubo y pipetee hacia arriba y hacia abajo de 60 a 70 veces con una pipeta Pasteur con tapón de algodón para homogeneizar las células.

Después de la homogeneización, agregue tres mililitros de solución de sulfato de magnesio y cloruro de calcio a cada tubo de 15 mililitros. Deje que los tubos se asienten a temperatura ambiente durante 10 minutos. Una vez transcurrido el tiempo, retire con cuidado el sobrenadante con una pipeta Pasteur taponada en algodón y transfiéralo a nuevos tubos de 15 mililitros.

Centrifugar durante cinco minutos a temperatura ambiente y 1.500 x g. Añadir medio de cultivo al pellet para diluir hasta una densidad celular de alrededor de 1,5 x 10 a la sexta célula por mililitro. Pipetear las células en una placa de 6 pocillos y cultivarlas en la incubadora a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono.

Después de 24 horas, agregue la solución madre de AraC a una concentración final de un milimolar para inhibir el crecimiento de las células gliales antes de devolver las placas a la incubadora. Luego, en el día siete, agregue 50 microlitros a la solución madre de D-glucosa hasta una concentración final de un milimolar. Comience la tinción mezclando diacetato de fluoresceína hasta una concentración final de 10 microgramos por mililitro y yoduro de propidio hasta una concentración final de 50 microgramos por mililitro y 10 mililitros de PBS.

Mezcle la solución FDA/PI por vórtice y colóquela en hielo. Coloque la placa de cultivo sobre hielo. Aspire cuidadosamente el medio de cultivo sin tocar las células con la punta de la pipeta, luego agregue lentamente PBS frío.

Aspire el PBS, luego agregue la solución de trabajo fría FDA/PI o FDA/PI Hoechst. Pon el plato en hielo durante cinco minutos. A continuación, después de aspirar la solución de trabajo FDA/PI o FDA/PI/Hoechst, agregue PBS frío a cada pocillo.

Asegúrese de que el microscopio fluorescente esté configurado correctamente. Detecte las emisiones fluorescentes para FDA, PI y Hoechst a 520, 620 y 460 nanómetros, respectivamente, utilizando un tiempo de exposición de entre 100 y 300 milisegundos y una ganancia analógica de 2,8 x. Después de recopilar imágenes de fluorescencia, tome una imagen con luz normal utilizando el modo de contraste de fase.

Para la tinción doble FDA/PI, superponga las imágenes de las células arrastrando la capa positiva de FDA sobre la capa positiva de PI en el software de edición de gráficos. Ajuste la opacidad de la capa positiva FDA ingresando 50% en el campo Opacidad del panel Capas. Fusiona dos capas abriendo el menú Capa y haciendo clic en el botón Fusionar visible.

Establezca el contraste de las imágenes superpuestas ingresando 50 en el campo Contraste en Imagen, Ajustes, Brillo/Contraste. Compruebe que no haya células dobles positivas FDA y PI en las imágenes superpuestas. Para la tinción triple de FDA/PI/Hoechst, superponga las imágenes de las células arrastrando de nuevo la capa positiva de FDA sobre la capa positiva de PI, ajustando la opacidad de la capa positiva de la FDA y fusionando las imágenes como antes.

A continuación, arrastre la capa positiva de Hoechst sobre la capa fusionada. Ajusta la opacidad de la capa positiva de Hoechst ingresando 50% en el campo Opacidad del panel Capas, y fusiona las dos capas abriendo el menú Capa y haciendo clic en el botón Fusionar visible. Distinga visualmente las células gliales grandes e irregulares de las neuronas granulares cerebelosas comparando las imágenes tomadas en modo fluorescente con las tomadas en modo de contraste de fase.

Las siguientes imágenes muestran que tanto las neuronas pequeñas como las células gliales grandes e irregulares están presentes en el cultivo de CGN. Esta imagen muestra la tinción de aminoácidos de GAP-43 de un cultivo de CGN a los ocho días in vitro. Las flechas azules indican neuronas.

Aquí, se muestra la tinción de aminoácidos GFAP de células gliales. La flecha blanca indica una célula glial. Esta imagen de contraste de fase muestra la morfología de las células.

La tinción con gancho FDA/PI, que puede distinguir las células gliales de las neuronas, es ventajosa para la evaluación precisa de la viabilidad neuronal en el cultivo de CGN. Esta es una imagen combinada de células triplemente teñidas que crecen en un medio de crecimiento normal. La flecha muestra una célula glial típica.

En este caso, se ha tratado un cultivo similar con un medio que contiene poco potasio, y la flecha indica de nuevo una célula glial típica. Además, observe la aparición de tinciones de yoduro de propidio rojo. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en dos horas si se realiza correctamente.

Una estrategia similar se puede aplicar a otros cultivos celulares mixtos, como los cultivos corticales primarios y los cultivos primarios de hipocampo para analizar con precisión la viabilidad neuronal.