Creando y aplicando una referencia para facilitar la discusión y clasificación de las proteínas en un grupo diverso

El objetivo general de este procedimiento es utilizar software de hoja de cálculo estándar para desarrollar una referencia para proteínas divergentes en un grupo que carece de criterios coherentes para la nomenclatura y clasificación. Este método puede ayudar a aclarar las relaciones entre proteínas relacionadas que tienen una nomenclatura confusa o inconsistente, como la superfamilia de péptidos defensivos alfa-beta estabilizados con cisteína que incluye defensas de invertebrados. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona una representación visual sencilla de las proteínas de interés.

Para comenzar, identifique las características definitorias del grupo de proteínas de interés. Por ejemplo, el pliegue alfa-beta de CS en la estructura de solución de la defensa de insectos y la ayuda de phormia terraenovae define la superfamilia de CS alfa-beta. Este pliegue también incluye un motivo más pequeño llamado hélice estabilizada con cisteína, que se identifica por CXXXC aguas arriba de un CXC.

Las cuatro cisteínas forman dos enlaces disulfuro. Para completar el motivo alfa-beta de CS, un tercer enlace disulfuro está formado por un par adicional de cisteínas. En última instancia, es fundamental conocer al menos algunas características importantes relacionadas con la estructura o función de la proteína.

Sin esto, no hay base para generar una referencia. Ahora, ingresa estas características definitorias en una hoja de cálculo. Utilice columnas para las entidades conservadas y para representar los espacios entre estas entidades.

Mantenga las columnas lo suficientemente anchas como para que quepan los números y asígneles un ancho consistente. En las filas, describa las secuencias. Para indicar una secuencia como una característica, rellene el cuadro de características con color, utilizando la función de relleno.

A continuación, para indicar el espaciado entre las características, introduzca el número de aminoácidos en el cuadro intermedio. Ahora, agregue secuencias representativas que se hayan establecido previamente como miembros del grupo en base a bases de datos estructurales y resultados publicados. Según sea necesario, agregue características que probablemente definan un subgrupo de secuencias, como una cisteína adicional.

Si faltan características en una secuencia dada, deje la caja sin rellenar y combínela con las cajas que representan los aminoácidos intermedios. Para ello, utilice la función Fusionar y Centrar. Una vez que se han introducido las secuencias representativas, identifique grupos de secuencias claramente relacionadas.

Luego, resuma las características de estos grupos. Cuando el número de aminoácidos entre las características varía, use un guión para indicar un rango o barras diagonales para indicar algunos números específicos. Según sea necesario, anote de forma creativa las características que puedan ser relevantes o que no sean lo suficientemente comunes como para incluirlas en la referencia.

Por ejemplo, dado que las cisteínas son importantes en la superfamilia, se puede marcar la presencia de cisteínas adicionales. A veces, al agregar secuencias recién identificadas a la hoja de cálculo, las secuencias de una especie caen en varios grupos diferentes de la superfamilia, como para los tardígrados. Una vez completado, las filas de la hoja de cálculo se pueden ordenar para resaltar la variación dentro de una especie, o la variación entre grupos taxonómicos.

Esta demostración utiliza el software MEGA 6 disponible gratuitamente. Sin embargo, otros programas se pueden utilizar de manera similar. Para iniciar una nueva alineación, seleccione Editar/Crear alineación en la pestaña Alinear.

A continuación, seleccione Crear una nueva alineación, en el cuadro que aparece y haga clic en Aceptar. A continuación, seleccione Proteína. Ahora, seleccione Insertar secuencia desde archivo, en el menú Editar, para importar las secuencias. Las secuencias deben estar en formato FASTA.

Los colores de fondo que reflejan diferentes tipos de aminoácidos se muestran de forma predeterminada y se pueden desactivar con un interruptor, en el menú Pantalla. Una vez introducidas todas las secuencias, haga clic en el icono del brazo flexible y, a continuación, en Alinear proteína para alinear las secuencias utilizando el algoritmo muscular. Si el mensaje No se seleccionó nada para la alineación.

Seleccione todo?, elija Aceptar. Algunos parámetros se pueden cambiar en la ventana emergente, pero para esta demostración, los valores predeterminados serán suficientes. Ahora, verifique la alineación basada en las características importantes de la superfamilia de proteínas.

La barra superior muestra un asterisco en cualquier posición en la que el aminoácido se conserve por completo. El alineamiento inicial identifica tres de las cuatro cisteínas conservadas. Una secuencia está claramente desalineada.

Para corregir una secuencia desalineada, resalte los guiones y presione la tecla Eliminar sin eliminar accidentalmente los aminoácidos. Luego, mueva los aminoácidos a su alineación adecuada agregando espacios. Después de alinear la secuencia manualmente, observe que la última cisteína del motivo CXXXC se conserva en toda la alineación.

A menudo es necesario el ajuste manual para priorizar las características más importantes de las secuencias. La alineación de la hoja de cálculo de la superfamilia CS alfa-beta previamente establecida reveló cinco patrones básicos de formación de enlaces. Las secuencias de tardígrados recién identificadas caían dentro del espectro completo de estos patrones.

A continuación, se utilizaron análisis filogenéticos para examinar cómo pudo haber evolucionado este grupo de proteínas. Sin embargo, las secuencias son generalmente cortas y muy divergentes. Por lo tanto, los árboles resultantes estaban mal resueltos y ofrecían poca información.

El alineamiento de secuencias múltiples se optimizó utilizando la referencia, pero aún hubo poca resolución en el análisis de máxima verosimilitud y en el análisis filogenético bayesiano. La mayoría de los clados tenían solo niveles bajos de soporte. Sin embargo, se apoyó a cinco pequeños grupos en al menos uno de los dos árboles.

Las secuencias con diferentes números de cisteína dentro de un grupo taxonómico pueden estar más estrechamente relacionadas que las secuencias con el mismo patrón de diferentes grupos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo usar el software de hoja de cálculo para generar una visualización simple de las características importantes de las proteínas. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que determinar las características más relevantes para el grupo de proteínas suele ser un proceso iterativo, y es probable que sea necesaria una revisión de la referencia.

Siempre se pueden agregar nuevas secuencias a una hoja de cálculo, y es fácil tener varias versiones, lo que permite agregar nuevas características que pueden ser útiles para la clasificación y el análisis. Aunque la alineación de la hoja de cálculo permite una fácil visualización de las características estructurales y funcionales, se pueden realizar otros métodos como el análisis filogenético para proporcionar información adicional sobre las relaciones evolutivas.