Evaluación de Dictyostelium discoideum respuesta a estimulación mecánica aguda

Aquí describimos los métodos para evaluar la respuesta celular al estímulo mecánico agudo. En el análisis de microscopía, examinamos localización de biosensores marcada con fluorescencia Tras estimulación breve con esquileo del flujo. También probamos la activación de diversas proteínas de interés en respuesta a la estimulación mecánica aguda bioquímicamente.

El objetivo general de este procedimiento es examinar la actividad de varios componentes de la red de transducción de señales intracelulares después de una breve perturbación mecánica. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la migración celular, como la forma en que las células perciben y migran direccionalmente hacia diversas señales ambientales, incluidos los estímulos mecánicos. La principal ventaja de esta técnica es que permite examinar la respuesta inicial al estímulo mecánico sin la contribución confusa de la motilidad o la polaridad a la respuesta.

La primera vez que tuvimos la idea de este método fue cuando probamos la respuesta de las células adherentes al quimioatrayente, que se administró con una ligera agitación, y observamos una respuesta robusta de las células estimuladas con el control del vehículo. Para comenzar, prepare Klebsiella aerogenes inoculando un pequeño número de células de stock congelado en medio HL5 sin antibióticos e incube el cultivo durante la noche. El crecimiento de Dictyostelium en presencia de la bacteria Klebsiella aerogenes reducirá el número de macropinosomas, lo que mejorará la capacidad de respuesta de las células a los estímulos externos.

Cronometra el experimento para que cuando las bacterias estén listas, haya Dictyostelium creciendo exponencialmente. Recoja estas células de Dictyostelium y cuéntelas con un hemocitómetro. A continuación, esparce 260 microlitros de la suspensión bacteriana que contiene 100.000 células de Dictyostelium en una placa SM.

También para el seguro, prepare placas con el doble y la mitad de pilas de Dictyostelium. Después de un día de crecimiento a temperatura ambiente, invierta la placa y continúe cultivando la placa hasta que las células de Dictyostelium comiencen a limpiar el césped bacteriano pero aún no hayan comenzado a agregarse. A continuación, añada cinco mililitros de tampón DB a la placa y raspe el Dictyostelium con un esparcidor de vidrio.

Transfiera las celdas y la solución a un tubo de polipropileno de 50 mililitros, luego enjuague la placa con cinco mililitros más de DB y también agregue esto al tubo de 50 mililitros. Repita si es necesario. Para lavar el Dictyostelium, llene el tubo hasta 50 mililitros con DB, granule las células y luego aspire y deseche el sobrenadante.

Lave las células repetidamente hasta que el sobrenadante esté claro. Finalmente, resuspenda el Dictyostelium en el tampón DB a aproximadamente cinco millones de células por mililitro. Para empezar, coloque dos millones de Dictyostelium competente para la agregación en placas de 35 milímetros con dos mililitros de DB. Prepare una placa para cada punto de tiempo y un control no estimulado.

A temperatura ambiente, deje que las celdas se adhieran a la placa durante 10 minutos. A continuación, lave las células sueltas de la placa con dos enjuagues con un mililitro de DB. Una vez que las placas estén limpias de Dictyostelium suelto, incube las células adheridas en tampón de basolación durante 30 minutos sin alterar las placas. Es muy importante evitar cualquier movimiento de las placas durante la media hora de incubación para evitar la estimulación prematura de las células.

Ahora, para aplicar una cantidad controlada de estimulación mecánica, transfiera individualmente una placa a un agitador orbital y haga funcionar el agitador a 150 rpm durante cinco segundos. Luego, después del tiempo deseado, aspire el tampón y coloque rápidamente la placa en hielo. Agregue inmediatamente 100 microlitros de tampón de muestra con inhibidores de proteasa y fosfatasa y raspe las células.

Recoja el lisado en tubos de 1,5 mililitros y caliéntelos rápidamente a 95 grados centígrados durante 10 minutos. Proceda con el análisis del lisado o transfiéralos a menos 20 grados centígrados para su almacenamiento. Después de hacer suspensiones de células vegetativas o competentes para la agregación, cargue unos 600 microlitros en el portaobjetos de la cámara microfluídica.

Las entradas deben estar completamente llenas, así que llénelas con un tampón si es necesario. Deje que las celdas se adhieran durante 10 minutos. Conecte una línea de entrada para el dispositivo a una bomba electrónica con un depósito de 15 mililitros.

Usando el control de software para la bomba, cierre la válvula y luego llene el depósito con DB. Ahora, ajuste la presión a 50 milibares y encienda la bomba. Llene y enjuague la línea con DB haciendo clic en la válvula para abrirla. Después de enjuagar durante unos 30 segundos, vuelva a poner la presión a cero y luego cierre la válvula.

A continuación, conecte la línea a una de las tres entradas de un lado de la corredera. No atrape ninguna burbuja de aire y una vez realizada la conexión, cubra las otras dos entradas de ese lado de la corredera. Ahora, complete la configuración conectando la línea desde el desagüe a la salida única en el lado opuesto de la corredera.

Luego, bajo un campo claro o iluminación de fase en un microscopio fluorescente, observe el canal con un objetivo de aire 20X y enjuague el canal. A continuación, ajuste la presión a unos 50 milibares y abra la válvula. Una vez que el líquido salga del desagüe, reduzca la presión externa a cero, espere unos 30 segundos y cierre la válvula.

A continuación, cambie al objetivo de aceite 40X, concéntrese en la parte más ancha del canal y prepare el software para recopilar imágenes cada tres segundos con iluminación RFP o GFP. Con la válvula cerrada, ajuste la presión al valor deseado. A continuación, adquiera cinco imágenes de preestimulación en intervalos de tres segundos.

A continuación, abra brevemente la válvula para entregar el estímulo. Ahora, recopile al menos 15 fotogramas más de datos durante 45 segundos. Cuantifique la respuesta como se describe en el protocolo de texto.

Primero, cargue un portaobjetos microfluídico con Dictyostelium como se describe en la sección anterior. Para este experimento, prepare dos líneas de entrada. Para cerrar las líneas, utilice una abrazadera física en la línea que transporta la solución de tratamiento y la válvula controlada por software para cerrar la línea que transporta la solución DB con el vehículo.

Ahora, llene las dos líneas con la solución adecuada, tampón más vehículo solo o tampón con el tratamiento como un inhibidor. Después de enjuagar las líneas, conéctelas a dos entradas en el costado del portaobjetos con el canal y tape la entrada no utilizada. Luego, conecte la línea de drenaje a la salida en el lado opuesto.

Ahora, lave el portaobjetos usando el tampón más el vehículo como se describió anteriormente. A continuación, llene el canal con el tratamiento. Primero, reduzca el flujo a cero milibares.

A continuación, cambie las válvulas, haga fluir el tratamiento durante unos 15 segundos y comience a cronometrar la incubación. Cada 10 minutos aproximadamente, fluya una solución de tratamiento fresca sobre las células durante unos 15 segundos para reponer los niveles de oxígeno en la cámara. Las células adherentes competentes para la agregación se expusieron a cinco segundos de flujo de cizallamiento utilizando un agitador orbital.

Los Dictyostelium fueron tratados previamente con cafeína para reducir su actividad basal. Como resultado, hubo una actividad basal muy baja de PKBR1 y ERK2 y un aumento robusto en la fosforilación de los residuos clave de estas quinasas con la estimulación. En células competentes para la agregación que expresan varios biosensores marcados con fluorescencia, dos marcadores de borde de ataque, PHcrac y LimE, que son reclutados por PIP3 o actina recién polimerizada, mostraron principalmente una localización citosólica en células en reposo.

Después de cinco segundos de flujo de cizallamiento, estos biosensores se relocalizaron rápidamente en la corteza y regresaron al citosol. Los efectos del fármaco despolimerizante de actina Latrunculin A se probaron utilizando un experimento de fuerza de cizallamiento similar. En este caso, las células vegetativas se expusieron primero a condiciones de control y luego se cambiaron al tampón que contenía el agente de prueba deseado.

El tratamiento con latrunculina A bloqueó la relocalización de los marcadores del borde de ataque en la corteza. Curiosamente, si el flujo no se apagaba después de dos segundos, sino que permanecía encendido durante la duración del experimento, aún se observaba una respuesta global transitoria. Tras la respuesta global, las células vegetativas migraron a contracorriente.

La preparación adecuada de las células es extremadamente importante para el éxito de estos ensayos. Las células vegetativas deben cultivarse en asociación con bacterias para garantizar su capacidad de respuesta a la estimulación mecánica. En el caso de las células competentes para la agregación, las células que están subdesarrolladas o sobredesarrolladas tienden a responder mal.

Los enfoques bioquímicos y microscópicos se complementan entre sí y eso nos ha permitido evaluar un gran número de intermediarios de transducción de señales por su respuesta a la estimulación mecánica. Al agregar perturbaciones farmacológicas y genéticas, podemos aprender cómo se perciben y transmiten los estímulos mecánicos. Esto es importante para comprender la migración celular dirigida que es guiada por estímulos físicos como el flujo de cizallamiento.

Dado que la estimulación mecánica desencadena la activación de la misma red de transducción de señales que los quimioatrayentes, ahora podemos examinar la integración de varios estímulos en las células. En última instancia, estos estudios nos ayudarán a comprender cómo las células migratorias, como nuestras propias células inmunitarias y las células cancerosas metastásicas, navegan por el cuerpo.