Name: Evaluación de Dictyostelium discoideum respuesta a estimulación mecánica aguda (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: Aprende a evaluar respuestas celulares agudas a estímulos mecánicos en Dictyostelium discoideum mediante ensayos de microscopía y flujo de cizallamiento. Este método permite estudiar la señalización intracelular inicial sin interferencia de la motilidad celular.

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Este trabajo fue financiado por los institutos nacionales de donación de salud GM118177 R35 para PND.

<ol><li>Swaney, K. F., Huang, C. H., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+chemotaxis%3A+a+network+of+signaling+pathways+controls+motility%2C+directional+sensing%2C+and+polarity%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic chemotaxis: a network of signaling pathways controls motility, directional sensing, and polarity.</a> Annu Rev Biophys. 39, 265-289 (2010).</li>
<li>Sasaki, A. T., Chun, C., Takeda, K., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+Ras+signaling+at+the+leading+edge+regulates+PI3K%2C+cell+polarity%2C+and+directional+cell+movement%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Localized Ras signaling at the leading edge regulates PI3K, cell polarity, and directional cell movement.</a> J Cell Biol. 167 (3), 505-518 (2004).</li>
<li>Jeon, T. J., Lee, D. -J., Merlot, S., Weeks, G., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rap1+controls+cell+adhesion+and+cell+motility+through+the+regulation+of+myosin+II%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Rap1 controls cell adhesion and cell motility through the regulation of myosin II.</a> J Cell Biol. 176 (7), 1021-1033 (2007).</li>
<li>Parent, C. A., Blacklock, B. J., Froehlich, W. M., Murphy, D. B., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G+Protein+Signaling+Events+Are+Activated+at+the+Leading+Edge+of+Chemotactic+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">G Protein Signaling Events Are Activated at the Leading Edge of Chemotactic Cells.</a> Cell. 95 (1), 81-91 (1998).</li>
<li>Funamoto, S., Meili, R., Lee, S., Parry, L., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+Temporal+Regulation+of+3-Phosphoinositides+by+PI+3-Kinase+and+PTEN+Mediates+Chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Spatial and Temporal Regulation of 3-Phosphoinositides by PI 3-Kinase and PTEN Mediates Chemotaxis.</a> Cell. 109 (5), 611-623 (2002).</li>
<li>Iijima, M., Devreotes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+Suppressor+PTEN+Mediates+Sensing+of+Chemoattractant+Gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor Suppressor PTEN Mediates Sensing of Chemoattractant Gradients.</a> Cell. 109 (5), 599-610 (2002).</li>
<li>Lim, C. J., Spiegelman, G. B., Weeks, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RasC+is+required+for+optimal+activation+of+adenylyl+cyclase+and+Akt%2FPKB+during+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">RasC is required for optimal activation of adenylyl cyclase and Akt/PKB during aggregation.</a> EMBO J. 20 (16), 4490-4499 (2001).</li>
<li>Kamimura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PIP3-Independent+Activation+of+TorC2+and+PKB+at+the+Cell%27s+Leading+Edge+Mediates+Chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">PIP3-Independent Activation of TorC2 and PKB at the Cell's Leading Edge Mediates Chemotaxis.</a> Curr Biol. 18 (14), 1034-1043 (2008).</li>
<li>Kortholt, A., King, J. S., Keizer-Gunnink, I., Harwood, A. J., Van Haastert, P. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipase+C+Regulation+of+Phosphatidylinositol+3%2C4%2C5-trisphosphate-mediated+Chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Phospholipase C Regulation of Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate-mediated Chemotaxis.</a> Molecular Biology of the Cell. 18 (12), 4772-4779 (2007).</li>
<li>Huang, C. H., Tang, M., Shi, C., Iglesias, P. A., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+excitable+signal+integrator+couples+to+an+idling+cytoskeletal+oscillator+to+drive+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">An excitable signal integrator couples to an idling cytoskeletal oscillator to drive cell migration.</a> Nat Cell Biol. 15 (11), 1307-1316 (2013).</li>
<li>Nishikawa, M., Hörning, M., Ueda, M., Shibata, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitable+Signal+Transduction+Induces+Both+Spontaneous+and+Directional+Cell+Asymmetries+in+the+Phosphatidylinositol+Lipid+Signaling+System+for+Eukaryotic+Chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Excitable Signal Transduction Induces Both Spontaneous and Directional Cell Asymmetries in the Phosphatidylinositol Lipid Signaling System for Eukaryotic Chemotaxis.</a> Biophys J. 106 (3), 723-734 (2014).</li>
<li>Gerisch, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mobile+Actin+Clusters+and+Traveling+Waves+in+Cells+Recovering+from+Actin+Depolymerization%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Mobile Actin Clusters and Traveling Waves in Cells Recovering from Actin Depolymerization.</a> Biophys J. 87 (5), 3493-3503 (2004).</li>
<li>Gerisch, G., Ecke, M., Wischnewski, D., Schroth-Diez, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+modes+of+state+transitions+determine+pattern+in+the+Phosphatidylinositide-Actin+system%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Different modes of state transitions determine pattern in the Phosphatidylinositide-Actin system.</a> BMC Cell Biol. 12 (1), 42(2011).</li>
<li>Bretschneider, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Three-Dimensional+Dynamics+of+Actin+Waves%2C+a+Model+of+Cytoskeletal+Self-Organization%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">The Three-Dimensional Dynamics of Actin Waves, a Model of Cytoskeletal Self-Organization.</a> Biophys J. 96 (7), 2888-2900 (2009).</li>
<li>Weiner, O. D., Marganski, W. A., Wu, L. F., Altschuler, S. J., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Actin-Based+Wave+Generator+Organizes+Cell+Motility%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Biol%22%5BJournal%5D)">An Actin-Based Wave Generator Organizes Cell Motility.</a> PLOS Biol. 5 (9), e221(2007).</li>
<li>Devreotes, P., Horwitz, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+Networks+that+Regulate+Cell+Migration%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Signaling Networks that Regulate Cell Migration.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (8), (2015).</li>
<li>Artemenko, Y., Lampert, T. J., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moving+towards+a+paradigm%3A+common+mechanisms+of+chemotactic+signaling+in+Dictyostelium+and+mammalian+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Moving towards a paradigm: common mechanisms of chemotactic signaling in Dictyostelium and mammalian leukocytes.</a> Cell Mol Life Sci. 71 (19), 3711-3747 (2014).</li>
<li>Dalous, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversal+of+cell+polarity+and+actin-myosin+cytoskeleton+reorganization+under+mechanical+and+chemical+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Reversal of cell polarity and actin-myosin cytoskeleton reorganization under mechanical and chemical stimulation.</a> Biophys J. 94 (3), 1063-1074 (2008).</li>
<li>Sato, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Switching+direction+in+electric-signal-induced+cell+migration+by+cyclic+guanosine+monophosphate+and+phosphatidylinositol+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Switching direction in electric-signal-induced cell migration by cyclic guanosine monophosphate and phosphatidylinositol signaling.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (16), 6667-6672 (2009).</li>
<li>Zhao, M., Pu, J., Forrester, J. V., McCaig, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+lipids%2C+EGF+receptors%2C+and+intracellular+signals+colocalize+and+are+polarized+in+epithelial+cells+moving+directionally+in+a+physiological+electric+field%5BTitle%5D)+AND+%22Faseb+j%22%5BJournal%5D)">Membrane lipids, EGF receptors, and intracellular signals colocalize and are polarized in epithelial cells moving directionally in a physiological electric field.</a> Faseb j. 16 (8), 857-859 (2002).</li>
<li>Decave, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear+flow-induced+motility+of+Dictyostelium+discoideum+cells+on+solid+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Shear flow-induced motility of Dictyostelium discoideum cells on solid substrate.</a> J Cell Sci. 116 (Pt 21), 4331-4343 (2003).</li>
<li>Artemenko, Y., Axiotakis, L., Borleis, J., Iglesias, P. A., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+and+mechanical+stimuli+act+on+common+signal+transduction+and+cytoskeletal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Chemical and mechanical stimuli act on common signal transduction and cytoskeletal networks.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (47), E7500-E7509 (2016).</li>
<li>Artemenko, Y., Swaney, K. F., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+development+and+chemotaxis+in+Dictyostelium+discoideum+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Assessment of development and chemotaxis in Dictyostelium discoideum mutants.</a> Methods Mol Biol. 769, 287-309 (2011).</li>
<li>Gaudet, P., Pilcher, K. E., Fey, P., Chisholm, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+Dictyostelium+discoideum+with+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Transformation of Dictyostelium discoideum with plasmid DNA.</a> Nat. Protocols. 2 (6), 1317-1324 (2007).</li>
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<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Meth. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Brenner, M., Thoms, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caffeine+blocks+activation+of+cyclic+AMP+synthesis+in+Dictyostelium+discoideum%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Caffeine blocks activation of cyclic AMP synthesis in Dictyostelium discoideum.</a> Dev Biol. 101 (1), 136-146 (1984).</li>
<li>Bretschneider, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Actin+Patterns+and+Arp2%2F3+Assembly+at+the+Substrate-Attached+Surface+of+Motile+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamic Actin Patterns and Arp2/3 Assembly at the Substrate-Attached Surface of Motile Cells.</a> Curr Biol. 14 (1), 1-10 (2004).</li>
<li>Swaney, K. F., Borleis, J., Iglesias, P. A., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+protein+Callipygian+defines+the+back+of+migrating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Novel protein Callipygian defines the back of migrating cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (29), E3845-E3854 (2015).</li>
<li>Meili, R., Ellsworth, C., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+Akt%2FPKB-related+kinase+is+essential+for+morphogenesis+in+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">A novel Akt/PKB-related kinase is essential for morphogenesis in Dictyostelium.</a> Curr Biol. 10 (12), 708-717 (2000).</li>
<li>Westendorf, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+cytoskeleton+of+chemotactic+amoebae+operates+close+to+the+onset+of+oscillations%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Actin cytoskeleton of chemotactic amoebae operates close to the onset of oscillations.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (10), 3853-3858 (2013).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Los métodos descritos aquí ofrecen una manera conveniente de evaluar población y comportamiento individuales de la célula en respuesta a flujo del esquileo. Lo importante, mientras que estudios previos analizan localización de los principales y marcadores del borde del revestimiento durante la migración, el enfoque actual permite investigación de efectos inmediatos aplicando el flujo de corte agudo. Con este método hemos demostrado que, de hecho, la respuesta inicial de las células para flujo del esquileo no obliga a mig...

Migración de las células eucariotas está sesgada por diversas señales químicas y físicas en el medio ambiente, incluyendo gradientes de atrayentes solubles o sustrato enlazado, rigidez variable de los sustratos, campos eléctricos o flujo del esquileo. Aunque ha habido muchos avances en nuestra comprensión de los mecanismos moleculares conduce chemotaxis, menos se sabe acerca de otros tipos de migración dirigida y cómo se integran estas diversas señales a nivel celular para producir un migratorias respuesta.
Dirigido la migración hacia un aumento de la concentración de un chemoattractant implica tres componentes conductuales: motilidad, detección direccional y polaridad1. La motilidad se refiere al movimiento aleatorio de las células mediante protrusión de pseudópodos. Es la capacidad de una célula para detectar la fuente de quimioatractiva de detección direccional, que puede ocurrir incluso en inmovilizado células. La polaridad se refiere a la distribución asimétrica más estable de componentes intracelulares entre el líder y el revestimiento de borde de una célula, que conduce a mayor persistencia en movimiento.
Respuesta celular a un chemoattractant depende de la actividad de redes reguladoras expresiones definidas cuatro: receptor / G proteína, transduction de la señal, citoesqueleto de actina y polaridad1. Chemoattractant atascamiento al receptor acoplado a proteínas G transmite la señal vía heterotriméricas G proteínas α y βγ a la red de transducción de la señal descendente, que amplifica la señal direccional. Múltiples vías dentro de la red de transducción de señal actúan en paralelo y alimentan la red del citoesqueleto de actina y polimerización de la actina sesgo, protrusión de seudópodo consecuente, en la dirección del gradiente. Importantes reguladores de la quimiotaxis son Ras GTPase, TorC2, fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K), homólogo de fosfatasa y tensina (PTEN) y ciclasa guanylyl. Mecanismos de retroalimentación dentro de la red de transducción de señal y la transducción de señales y redes de citoesqueleto de actina más amplifican la respuesta. Finalmente, la red de polaridad mal definida recibe entrada desde el citoesqueleto de actina y sesgos aún más la red de transducción de señal para promover la migración persistente en la dirección del gradiente.
Gran parte de nuestra comprensión mecanicista de la quimiotaxis fue posible debido al desarrollo de biosensores con etiqueta fluorescente para diversos componentes de las redes reguladoras. Muchos reguladores de quimiotaxis tienen una distribución asimétrica de la molécula reguladora de sí mismo o de su actividad. Por ejemplo, biosensores que reconocen activación versiones de pequeño GTPases Ras y Rap1 – dominios de unión a Ras de Raf1 (denominado RBD aquí) y RalGDS, respectivamente-localizar a la vanguardia de una célula chemotaxing2,3. Del mismo modo, PI3K y su producto fosfatidilinositol (3,4,5)-trifosfato (PIP3), reconocido por un dominio de homología (PH) pleckstrin, también Mostrar localización en el frente de una célula4,5. Por el contrario, una 3-fosfatasa PTEN, que convierte PIP3 a fosfatidilinositol (4,5)-bifosfato, se localiza en el borde del revestimiento de la célula6. Lo importante, estos biosensores cambian su localización en la respuesta a la estimulación global con un chemoattractant. Marcadores de vanguardia, citosólico o en las extremidades de salientes en una celda de reclinación, relocalizar a la corteza, mientras que quedándose marcadores del borde, localización cortical y están ausentes de las puntas de salientes en una reclinación de la célula, se convierten en citosol después de estimulación. Análisis de la distribución de biosensor en respuesta a la estimulación global con un chemoattractant minimiza la contribución de motilidad y polaridad, que a menudo confundir las observaciones. Estimulación global o uniforme de una suspensión con un chemoattractant también se utiliza como una herramienta para evaluar los cambios de toda la población en la activación de la proteína, a menudo detectada por fosforilación de proteínas7,8,9 . Este análisis bioquímico se utilizan principalmente para obtener información temporal, mientras que la microscopia se utiliza para recopilar información temporal y espacial sobre el comportamiento de los diversos componentes de las redes reguladoras.
La red de transducción de señal incorpora características de un sistema excitable10,11. Respuestas a los estímulos quimiotácticos supra umbral son "escogiendo" y mostrar períodos refractarios. Las respuestas se desencadenan también estocástico y pueden mostrar comportamiento oscilatorio. Eventos de transducción de señal se localizan en las regiones de la corteza que se propagan como ondas12,13,14,15. Frente, detrás, marcadores son reclutados a o disocian de las zonas activas de las ondas de propagación. Debido a la región refractaria que se arrastra la zona activa, las olas opuesto dirigidas aniquilan como se encuentran. Las olas de transducción de señal propagación subyacen las protuberancias celulares que median la migración de la célula10.
Mucha de la información mencionada en la quimiotaxis vino de los estudios sobre la ameba social discoideum de Dictyostelium, aunque mecanismos regulatorios similares también son aplicables a los neutrófilos y otros tipos de células de mamífero16 . Dictyostelium es un organismo modelo bien establecido que cuenta con una robusta respuesta quimiotáctica durante hambre, cuando miles de células migran hacia un centro de agregación, eventualmente formando un cuerpo fructífero multicelular que contiene esporas. Chemotaxis es también esencial durante la etapa de crecimiento de la célula solo de este organismo para la localización de fuentes de alimentación bacteriana. Lo importante, migración de células de Dictyostelium solo es notable similar a la migración de neutrófilos mamíferos o de las células de cáncer metastásico, que sufren migración ameboides tipo muy rápida. De hecho, tanto la topología global de las redes de regulación, así como muchas de las vías de transducción de señal individuales implicadas en la quimiotaxis se conservan entre Dictyostelium y leucocitos mamíferos17. Además, otras células, como fibroblastos, usan quinasas de tirosina del receptor (RTK) en lugar de GPCRs; sin embargo, RTKs pueden alimentar redes similares.
En contraste con la quimiotaxis, carece de comprensión de los mecanismos de señalización que conducen a otros modos de la migración dirigida. De manera similar a las células que migran en un gradiente chemoattractant varios estudios han reportado activación o localización de marcadores típicos de vanguardia, incluyendo la polimerización de la actina, PIP3 o quinasa regulada por señal extracelular (ERK) 1/2, en el frente de las células que experimentan dirigido migración en respuesta a esfuerzo cortante flujo o cambios en campos eléctricos18,19,20,21. Sin embargo, en estos estudios la exposición continua al estímulo también dio lugar a la migración de la célula, dejando abierta la pregunta si, por ejemplo, los marcadores de punta localización específicamente en respuesta a un estímulo, o si simplemente localiza en el borde de ataque debido a aumento del número de pseudópodos en la parte delantera de una migración de la célula.
Desarrollamos análisis que nos permiten observar la respuesta de las células a perturbación mecánica aguda entregado como esquileo del flujo tanto a nivel poblacional y como células individuales22. Similar a la estimulación global con quimioatractiva, estimulación agudación con esquileo del flujo permite el estudio de la respuesta celular a un estímulo mecánico sin la contribución de la confusión de la motilidad o polaridad. Combinando estos ensayos bioquímicos y microscópicos con perturbaciones genéticas o farmacológicas nos permite aprender sobre estímulos mecánicos cómo se perciben y se transmite. Por otra parte, este enfoque también proporciona un método novedoso para aprovechar el sistema aguas abajo del receptor chemoattractant en ausencia de un chemoattractant, aislando así las señal de transducción y de la actinia citoesqueleto redes de receptor/G red de la proteína.
Utilizando las técnicas descritas a continuación recientemente demostró que corte la tensión aguda conduce a la activación de múltiples componentes de la señal quimiotáctica transducción y actinia citoesqueleto redes22. Mediante la aplicación de la estimulación mecánica aguda a intervalos diferentes, demostramos que, semejantemente a atrayentes, respuesta a estímulos mecánicos también exhibe características de un sistema excitable, incluyendo el comportamiento escogiendo de la respuesta en condiciones de saturación y la presencia de un período refractario. Finalmente, mediante la combinación de estimulación mecánica y química mostramos que dos estímulos comparten señal transducción y actinia citoesqueleto redes, que probablemente permitan la integración de múltiples estímulos a la migración de células de sesgo.

<table><tbody><tr><td><reactivos fuertes></dextrosa fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Fisher</td><td>D16-1</td><td>Úselo para preparar medios HL-5 y placas SM (pasos 1.1, 1.2)</td></tr><tr><td>Proteosa peptona</td><td>Fisher</td><td>DF0120-17-6</td><td>Úselo para preparar medios HL-5 (paso 1.1)</td></tr><tr><td>Extracto de levadura</td><td>Fisher</td><td>50-550-445</td><td>Úselo para preparar medios HL-5 y placas SM (pasos 1.1, 1.2)</td></tr><tr><td>Na2HPO4&middot; 7H2O</td><td>Fisher</td><td>S373-500</td><td>Úselo para preparar medios HL-5 y tampón de fosfato 10X (pasos 1.1, 1.3)</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Fisher</td><td>P386-500</td><td>Úselo para preparar medios HL-5, placas SM y tampón de fosfato 10X (pasos 1.1-1.3)</td></tr><tr><td>Estreptomicina (sulfato de dihidroestreptomicina)</td><td>Fisher</td><td>ICN10040525</td><td>Úselo para preparar medios HL-5 (paso 1.1)</td></tr><tr><td>Peptona (Bacto)</td><td>Fisher</td><td>DF0118-17-0</td><td>Úselo para preparar placas SM (paso 1.2)</td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Fisher</td><td>P288-100</td><td>Úselo para preparar placas SM (paso 1.2)</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher</td><td>BP1423-500</td><td>Úselo para preparar placas SM (paso 1.2)</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Fisher</td><td>M65-500</td><td>Úselo para preparar DB Buffer (paso 1.4)</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fisher</td><td>C79-500</td><td>Úselo para preparar DB Buffer (paso 1.4)</td></tr><tr><td>Cafeína</td><td>Fisher</td><td>O1728-500</td><td>Úselo para preparar cafeína (paso 1.5)</td></tr><tr><td>cAMP (EMD Millipore Calbiochem Adenosine 3 pies, 5 pies-monofosfato cíclico, sal de sodio)</td><td>Fisher</td><td>11-680-1100MG</td><td>Úselo para preparar cAMP (paso 1.6)</td></tr><tr><td>Ácido fólico</td><td>Sigma</td><td>F7876</td><td>Úselo para preparar fólico ácido (paso 1.7)</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher</td><td>BP152-500</td><td>Úselo para preparar tampón de muestra 3X (paso 1.8)</td></tr><tr><td>Dodecil sulfato de sodio (SDS)</td><td>Fisher</td><td>BP166-500</td><td>Úselo para preparar tampón de muestra 3X (paso 1.8)</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher</td><td>G33-500</td><td>Úselo para preparar tampón de muestra 3X (paso 1.8)</td></tr><tr><td>Ditiothreitol (DTT)</td><td>Bio-Rad</td><td>1610610</td><td>Úselo para preparar tampón de muestra 3X (paso 1.8)</td></tr><tr><td>Azul de bromofenol</td><td>Bio-Rad</td><td>1610404</td><td>Úselo para preparar tampón de muestra 3X (paso 1.8)</td></tr><tr><td>NaF</td><td>Fisher</td><td>S299-100</td><td>Úselo para preparar tampón de muestra con inhibidores de proteasa y fosfatasa (paso 1.8)</td></tr><tr><td>Na3VO4</td><td>Fisher</td><td>50-994-911</td><td>Úselo para preparar tampón de muestra con inhibidores de proteasa y fosfatasa (paso 1.8)</td></tr><tr><td>Pirofosfato de sodio decahidratado</td><td>Fisher</td><td>S390-500</td><td>Úselo para preparar tampón de muestra con inhibidores de proteasa y fosfatasa (paso 1.8)</td></tr><tr><td>Cóctel completo de inhibidores de proteasa sin EDTA (Roche)</td><td>Sigma</td><td>11873580001</td><td>Úselo para preparar tampón de muestra con inhibidores de proteasa y fosfatasa (paso 1.8)</td></tr><tr><td>Latrunculina A</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>BML-T119-0100</td><td>Úselo para preparar latrunculina A (paso 1.9)</td></tr><tr><td>4-15% Tris-HCl gel de poliacrilamida</td><td>Bio-Rad</td><td>3450029</td><td>Uso para inmunotransferencia (paso 3.3)</td></tr><tr><td>Membrana de fluoruro de polivinilideno</td><td>Bio-Rad</td><td>1620177</td><td>Uso para inmunotransferencia (paso 3.3)</td></tr><tr><td>Phospho-PKC (pan) (zeta Thr410) (190D10) Anticuerpo de conejo</td><td>Cell Signaling</td><td>2060</td><td>Anticuerpo primario para uso en inmunotransferencia (paso 3.3)</td></tr><tr><td>Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) ( D13.14.4E) Anticuerpo XP</td><td>Cell Signaling</td><td>4370</td><td>Anticuerpo primario para uso en inmunotransferencia (paso 3.3)</td></tr><tr><td>Conejo IgG HRP Linked Whole Ab (de Burro)</td><td>GE Healthcare</td><td>NA934-100UL</td><td>Anticuerpo secundario para uso en inmunotransferencia (paso 3.3)</td></tr><tr><td>Sustrato de quimioluminiscencia mejorada (Clarity Western ECL Substrate)</td><td>Bio-Rad</td><td>1705060</td><td>Uso para inmunotransferencia (paso 3.3)</td></tr><tr><td>Tampón de extracción (Restore Plus tampón de eliminación de Western blot)</td><td>Pierce</td><td>PI46430</td><td>Uso para inmunotransferencia (paso 3.3)</td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue</td><td>Fisher</td><td>PI20278</td><td>Uso para inmunotransferencia (paso 3.3)</td></tr><tr><td>Cepa de K. aerogenes (no patógena)</td><td>Dicty Stock Center (dictybase.org)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Materials and Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Orbital shaker (modelo G-33, o una alternativa comparable)</td><td>New Brunswick Scientific Uso</td><td></td><td>para cultivar K. aerogenes (paso 2.1.1), y para basalar y estimular células D. discoideum (paso 3). El radio de giro de este agitador es de 9,5 mm.</td></tr><tr><td>Placa de Petri de 10 cm</td><td>Fisher FB0875712</td><td></td><td>Úselo para preparar placas SM (paso 1.2)</td></tr><tr><td>Hemocitómetro</td><td>Fisher</td><td>02-671-51B</td><td>Úselo para contar células D. discoideum (paso 2.1.2)</td></tr><tr><td>Plato de 35 mm (Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dish)</td><td>Fisher</td><td>08-772A</td><td>Úselo para colocar células D. discoideumcells para la estimulación mecánica seguida de lisis celular (paso 3.1.1)</td></tr><tr><td>Vaso de poliestireno (5 ml)</td><td>VWR</td><td>13915-985</td><td>Úselo para estimular la suspensión de células D. discoideum con un quimioatrayente (paso 3.2.2)</td></tr><tr><td>Unidad de fluidos con bomba (ibidi Pump System)</td><td>Ibidi</td><td>10902</td><td>Úselo para administrar estimulación mecánica a las células D. discoideum en un canal (pasos 4.1, 4.2 y 5)</td></tr><tr><td>Portaobjetos con canal (&mu;-Slide III 3in1 ibiTreat: #1.5 cubreobjetos de polímero, tratados con cultivo de tejidos, esterilizados)</td><td>Ibidi</td><td>80316</td><td>Úselo para colocar células D. discoideum para la estimulación mecánica administrada por un dispositivo fluídico (pasos 4.1, 4.2 y 5)</td></tr><tr><td>Depósitos de 50 mL (Ibidi Reservoir Holder for Fluidic Unit)</td><td>Ibidi</td><td>10978</td><td>Utilícelo para configurar el dispositivo fluídico para administrar estimulación mecánica a las células D. discoideum en un canal (pasos 4.1, 4.2 y 5)</td></tr><tr><td>Líneas para la unidad fluídica (Juego de perfusión AMARILLO-y-VERDE)</td><td>Ibidi</td><td>10964</td><td>Utilícelo para configurar el dispositivo fluídico para administrar estimulación mecánica a las células D. discoideum en un canal (pasos 4.1, 4.2 y 5). Nota: las dos líneas también se pueden cortar del tubo de 1,6 mm (número de catálogo 10842).</td></tr><tr><td>Línea para el drenaje (tubo de 1,6 mm de diámetro interior)</td><td>Ibidi</td><td>10842</td><td>Utilícelo para configurar el dispositivo fluídico para administrar estimulación mecánica a las células D. discoideum en un canal (pasos 4.1, 4.2 y 5).</td></tr><tr><td>Microscopio invertido Zeiss Observer.Z1 equipado con un objetivo de aceite de 40X/1.3 y un objetivo de aire de 20X/0.3 (o una alternativa comparable)</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Se utiliza para obtener imágenes de células D. discoideum con iluminación de contraste de fase o fluorescencia (pasos 4 y 5)</td></tr><tr><td>Microscopio confocal de disco giratorio UltraView equipado con un microscopio confocal de disco giratorio 40&times;/1.25&ndash; 0,75 objetivo de aceite (o una alternativa comparable)</td><td>Perkin-Elmer</td><td>DM 16000</td><td>Una alternativa utilizada para obtener imágenes de células D. discoideum (paso 4.1.4)</td></tr><tr><td>Microinyector FemtoJet (Eppendorf; modelo 5247, o una alternativa comparable) con Eppendorf InjectMan</td><td>Eppendorf</td><td>5252000021D y 5192000027</td><td>Se utiliza para administrar estimulación mecánica a las células D. discoideum mediante una micropipeta (paso 4.3). Nota: el número de catálogo corresponde a la versión más reciente del equipo (4i).</td></tr><tr><td>Micropipeta (Femtotip; 1 &mu; m diámetro exterior, 0,5 &mu; m de diámetro interior )</td><td>Eppendorf</td><td>930000035</td><td>Úselo para administrar estimulación mecánica a las células D. discoideum mediante una micropipeta (paso 4.3)</td></tr><tr><td>Puntas de microcargador (Eppendorf Femtotips Microloader Tips for Femtojet Microinjector)</td><td>Eppendorf</td><td>5242956.003</td><td>Úselo para llenar la micropipeta (femtotip) con tampón (paso 4.3.1)</td></tr><tr><td>Cámara de 1 pocillo (Thermo Scientific Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass)</td><td>Fisher</td><td>12-565-472</td><td>Úselo para colocar células D. discoideum para la estimulación mecánica administrada por una micropipeta (paso 4.3.2)</td></tr><tr><td>Cámara de 8 pocillos (Thermo Scientific Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass)</td><td>Fisher</td><td>12-565-338</td><td>Úselo para colocar células D. discoideum para la estimulación mecánica administrada por adición masiva de tampón (paso 4.4.1)</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</strong</td><td>>Comments</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image Analysis Software (Fiji)</td><td>NIH</td><td>https://fiji.sc/</td> <td>Uso para cuantificar la respuesta a la estimulación mecánica (paso 4.5)</td></tr><tr><td>Software de análisis de migración (Tracking Tool PRO)</td><td>Gradientech</td><td>http://gradientech.se/tracking-tool-pro/</td> <td>Úselo para cuantificar la velocidad y la persistencia de la celda (paso 5.4)</td></tr></tbody></table>

evaluación de dictyostelium discoideum respuesta a estimulación mecánica aguda

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Quimiotaxis, o migración a un gradiente de quimioatractiva, es el mejor modo de entender de migración dirigida. Estudios social ameba Dictyostelium discoideum reveló que una red de transducción de la señal compleja de caminos paralelos amplifica la respuesta a atrayentes y lleva a la polimerización de la actina sesgada y saliente de un seudópodo en la Dirección de un degradado. En cambio, no se conocen mecanismos moleculares conducir otros tipos de migración dirigida, por ejemplo, debido a la exposición a flujo o campos eléctricos, de cizalla. Muchos reguladores de quimiotaxis exhiben localización en el revestimiento de borde o de una migración de la célula, así como mostraron cambios transitorios en la localización o la activación después del estímulo global con un chemoattractant. Para entender los mecanismos moleculares de otros tipos de migración dirigida se desarrolló un método que permite la examinación de la respuesta celular al estímulo mecánico agudo basado en la exposición breve (2-5 s) a flujo del esquileo. Esta estimulación se puede entregar en un canal mientras que las células con marcada con fluorescencia biosensores para examinar el comportamiento de células individuales de la proyección de imagen. Además, la población celular puede ser estimulado en una placa, lisis y immunoblotted utilizando anticuerpos que reconocen las versiones activadas de proteínas de interés. Mediante la combinación de ambos ensayos, uno puede examinar una amplia gama de moléculas activadas por cambios en la localización subcelular o fosforilación. Con este método determinamos que la estimulación mecánica aguda desencadena la activación de las redes de citoesqueleto de actinia y transducción de señal quimiotáctica. La capacidad de examinar las respuestas celulares a la estimulación mecánica aguda es importante para comprender los eventos Inicio necesarios para motilidad inducida por el flujo del esquileo. Este enfoque también proporciona una herramienta para el estudio de la red de transducción de señal quimiotáctica sin la influencia de la confusión del receptor chemoattractant.

Respuesta temporal de los reguladores de quimiotaxis a estimulación mecánica aguda
Para evaluar la respuesta de D. discoideum las células al estímulo mecánico, células adherentes de agregación competentes fueron expuestas a un breve pulso de esquileo del flujo. Agregación-competente D. discoideum células secretan cAMP, que puede ser detectado por vecinos células. Para superar la contribución de la señalización de ...

Aquí describimos los métodos para evaluar la respuesta celular al estímulo mecánico agudo. En el análisis de microscopía, examinamos localización de biosensores marcada con fluorescencia Tras estimulación breve con esquileo del flujo. También probamos la activación de diversas proteínas de interés en respuesta a la estimulación mecánica aguda bioquímicamente.

Evaluación de Dictyostelium discoideum respuesta a estimulación mecánica aguda

Chemotaxis, or migration up a gradient of a chemoattractant, is the best understood mode of directed migration. Studies using social amoeba Dictyostelium ...

El objetivo general de este procedimiento es examinar la actividad de varios componentes de la red de transducción de señales intracelulares después de una breve perturbación mecánica. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la migración celular, como la forma en que las células perciben y migran direccionalmente hacia diversas señales ambientales, incluidos los estímulos mecánicos. La principal ventaja de esta técnica es que permite examinar la respuesta inicial al estímulo mecánico sin la contribución confusa de la motilidad o la polaridad a la respuesta.La primera vez que tuvimos la idea de este método fue cuando probamos la respuesta de las células adherentes al quimioatrayente, que se administró con una ligera agitación, y observamos una respuesta robusta de las células estimuladas con el control del vehículo. Para comenzar, prepare Klebsiella aerogenes inoculando un pequeño número de células de stock congelado en medio HL5 sin antibióticos e incube el cultivo durante la noche. El crecimiento de Dictyostelium en presencia de la bacteria Klebsiella aerogenes reducirá el número de macropinosomas, lo que mejorará la capacidad de respuesta de las células a los estímulos externos.Cronometra el experimento para que cuando las bacterias estén listas, haya Dictyostelium creciendo exponencialmente. Recoja estas células de Dictyostelium y cuéntelas con un hemocitómetro. A continuación, esparce 260 microlitros de la suspensión bacteriana que contiene 100.000 células de Dictyostelium en una placa SM.También para el seguro, prepare placas con el doble y la mitad de pilas de Dictyostelium. Después de un día de crecimiento a temperatura ambiente, invierta la placa y continúe cultivando la placa hasta que las células de Dictyostelium comiencen a limpiar el césped bacteriano pero aún no hayan comenzado a agregarse. A continuación, añada cinco mililitros de tampón DB a la placa y raspe el Dictyostelium con un esparcidor de vidrio.Transfiera las celdas y la solución a un tubo de polipropileno de 50 mililitros, luego enjuague la placa con cinco mililitros más de DB y también agregue esto al tubo de 50 mililitros. Repita si es necesario. Para lavar el Dictyostelium, llene el tubo hasta 50 mililitros con DB, granule las células y luego aspire y deseche el sobrenadante.Lave las células repetidamente hasta que el sobrenadante esté claro. Finalmente, resuspenda el Dictyostelium en el tampón DB a aproximadamente cinco millones de células por mililitro. Para empezar, coloque dos millones de Dictyostelium competente para la agregación en placas de 35 milímetros con dos mililitros de DB. Prepare una placa para cada punto de tiempo y un control no estimulado.A temperatura ambiente, deje que las celdas se adhieran a la placa durante 10 minutos. A continuación, lave las células sueltas de la placa con dos enjuagues con un mililitro de DB. Una vez que las placas estén limpias de Dictyostelium suelto, incube las células adheridas en tampón de basolación durante 30 minutos sin alterar las placas. Es muy importante evitar cualquier movimiento de las placas durante la media hora de incubación para evitar la estimulación prematura de las células.Ahora, para aplicar una cantidad controlada de estimulación mecánica, transfiera individualmente una placa a un agitador orbital y haga funcionar el agitador a 150 rpm durante cinco segundos. Luego, después del tiempo deseado, aspire el tampón y coloque rápidamente la placa en hielo. Agregue inmediatamente 100 microlitros de tampón de muestra con inhibidores de proteasa y fosfatasa y raspe las células.Recoja el lisado en tubos de 1,5 mililitros y caliéntelos rápidamente a 95 grados centígrados durante 10 minutos. Proceda con el análisis del lisado o transfiéralos a menos 20 grados centígrados para su almacenamiento. Después de hacer suspensiones de células vegetativas o competentes para la agregación, cargue unos 600 microlitros en el portaobjetos de la cámara microfluídica.Las entradas deben estar completamente llenas, así que llénelas con un tampón si es necesario. Deje que las celdas se adhieran durante 10 minutos. Conecte una línea de entrada para el dispositivo a una bomba electrónica con un depósito de 15 mililitros.Usando el control de software para la bomba, cierre la válvula y luego llene el depósito con DB. Ahora, ajuste la presión a 50 milibares y encienda la bomba. Llene y enjuague la línea con DB haciendo clic en la válvula para abrirla. Después de enjuagar durante unos 30 segundos, vuelva a poner la presión a cero y luego cierre la válvula.A continuación, conecte la línea a una de las tres entradas de un lado de la corredera. No atrape ninguna burbuja de aire y una vez realizada la conexión, cubra las otras dos entradas de ese lado de la corredera. Ahora, complete la configuración conectando la línea desde el desagüe a la salida única en el lado opuesto de la corredera.Luego, bajo un campo claro o iluminación de fase en un microscopio fluorescente, observe el canal con un objetivo de aire 20X y enjuague el canal. A continuación, ajuste la presión a unos 50 milibares y abra la válvula. Una vez que el líquido salga del desagüe, reduzca la presión externa a cero, espere unos 30 segundos y cierre la válvula.A continuación, cambie al objetivo de aceite 40X, concéntrese en la parte más ancha del canal y prepare el software para recopilar imágenes cada tres segundos con iluminación RFP o GFP. Con la válvula cerrada, ajuste la presión al valor deseado. A continuación, adquiera cinco imágenes de preestimulación en intervalos de tres segundos.A continuación, abra brevemente la válvula para entregar el estímulo. Ahora, recopile al menos 15 fotogramas más de datos durante 45 segundos. Cuantifique la respuesta como se describe en el protocolo de texto.Primero, cargue un portaobjetos microfluídico con Dictyostelium como se describe en la sección anterior. Para este experimento, prepare dos líneas de entrada. Para cerrar las líneas, utilice una abrazadera física en la línea que transporta la solución de tratamiento y la válvula controlada por software para cerrar la línea que transporta la solución DB con el vehículo.Ahora, llene las dos líneas con la solución adecuada, tampón más vehículo solo o tampón con el tratamiento como un inhibidor. Después de enjuagar las líneas, conéctelas a dos entradas en el costado del portaobjetos con el canal y tape la entrada no utilizada. Luego, conecte la línea de drenaje a la salida en el lado opuesto.Ahora, lave el portaobjetos usando el tampón más el vehículo como se describió anteriormente. A continuación, llene el canal con el tratamiento. Primero, reduzca el flujo a cero milibares.A continuación, cambie las válvulas, haga fluir el tratamiento durante unos 15 segundos y comience a cronometrar la incubación. Cada 10 minutos aproximadamente, fluya una solución de tratamiento fresca sobre las células durante unos 15 segundos para reponer los niveles de oxígeno en la cámara. Las células adherentes competentes para la agregación se expusieron a cinco segundos de flujo de cizallamiento utilizando un agitador orbital.Los Dictyostelium fueron tratados previamente con cafeína para reducir su actividad basal. Como resultado, hubo una actividad basal muy baja de PKBR1 y ERK2 y un aumento robusto en la fosforilación de los residuos clave de estas quinasas con la estimulación. En células competentes para la agregación que expresan varios biosensores marcados con fluorescencia, dos marcadores de borde de ataque, PHcrac y LimE, que son reclutados por PIP3 o actina recién polimerizada, mostraron principalmente una localización citosólica en células en reposo.Después de cinco segundos de flujo de cizallamiento, estos biosensores se relocalizaron rápidamente en la corteza y regresaron al citosol. Los efectos del fármaco despolimerizante de actina Latrunculin A se probaron utilizando un experimento de fuerza de cizallamiento similar. En este caso, las células vegetativas se expusieron primero a condiciones de control y luego se cambiaron al tampón que contenía el agente de prueba deseado.El tratamiento con latrunculina A bloqueó la relocalización de los marcadores del borde de ataque en la corteza. Curiosamente, si el flujo no se apagaba después de dos segundos, sino que permanecía encendido durante la duración del experimento, aún se observaba una respuesta global transitoria. Tras la respuesta global, las células vegetativas migraron a contracorriente.La preparación adecuada de las células es extremadamente importante para el éxito de estos ensayos. Las células vegetativas deben cultivarse en asociación con bacterias para garantizar su capacidad de respuesta a la estimulación mecánica. En el caso de las células competentes para la agregación, las células que están subdesarrolladas o sobredesarrolladas tienden a responder mal.Los enfoques bioquímicos y microscópicos se complementan entre sí y eso nos ha permitido evaluar un gran número de intermediarios de transducción de señales por su respuesta a la estimulación mecánica. Al agregar perturbaciones farmacológicas y genéticas, podemos aprender cómo se perciben y transmiten los estímulos mecánicos. Esto es importante para comprender la migración celular dirigida que es guiada por estímulos físicos como el flujo de cizallamiento.Dado que la estimulación mecánica desencadena la activación de la misma red de transducción de señales que los quimioatrayentes, ahora podemos examinar la integración de varios estímulos en las células. En última instancia, estos estudios nos ayudarán a comprender cómo las células migratorias, como nuestras propias células inmunitarias y las células cancerosas metastásicas, navegan por el cuerpo.

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Investigación

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Biology

Biología

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