对急性机械刺激的网柄反应的评估

该程序的总体目标是在短暂的机械扰动后检查细胞内信号转导网络的各个组分的活性。这种方法可以帮助回答细胞迁移领域的关键问题，例如细胞如何感知和定向迁移到包括机械刺激在内的各种环境线索。这种技术的主要优点是它允许检查对机械刺激的初始反应，而不会产生运动或极性对反应的混淆贡献。

当我们测试贴壁细胞对化学引诱剂的反应时，我们首先想到了这种方法，化疗引诱剂以轻微的搅动传递，我们注意到用载体对照刺激的细胞有强烈的反应。首先，通过将少量细胞从冷冻原液中接种到不含抗生素的 HL5 培养基中来制备产气克雷伯菌，并将培养物孵育过夜。在产气克雷伯菌存在下，盘基网柄菌的生长将减少巨噬菌体的数量，这将提高细胞对外部刺激的反应性。

安排实验时间，以便当细菌准备好时，Dictyostelium 呈指数级增长。收集这些 Dictyostelium 细胞并使用血细胞计数器对其进行计数。然后，将含有 260， 100， 000 个 Dictyostelium 细胞的细菌悬浮液涂抹到 SM 板上。

同样为了保险，准备具有两倍和一半的 Dictyostelium 细胞的板。在室温下生长一天后，倒置板并继续培养板，直到 Dictyostelium 细胞开始清理细菌草坪但尚未开始聚集。然后，向板中加入 5 毫升 DB 缓冲液，并使用玻璃涂抹器刮掉 Dictyostelium。

将细胞和溶液转移到 50 毫升聚丙烯管中，然后再用 5 毫升 DB 冲洗板，并将其添加到 50 毫升管中。如有必要，请重复此作。要洗涤 Dictyostelium，请在试管中加入 DB 至 50 毫升，沉淀细胞，然后吸出并丢弃上清液。

反复洗涤细胞，直到上清液澄清。最后，将 Dictyostelium 在 DB 缓冲液中重悬至每毫升约 500 万个细胞。首先，将 200 万具有聚集能力的 Dictyostelium 接种到 35 毫米培养皿上，加入 2 毫升 DB。为每个时间点准备一个板和一个未刺激的对照。

在室温下，让细胞附着在板上 10 分钟。然后，用 1 毫升 DB 冲洗两次，将未附着的细胞从板上洗掉。清除板中未附着的 Dictyostelium 后，将附着的细胞在分离缓冲液中孵育 30 分钟，不要干扰板。在半小时的孵育过程中避免板的任何移动以防止细胞过早刺激非常重要。

现在，要施加受控量的机械刺激，将板单独转移到轨道摇床上，并以 150 rpm 的速度运行摇床 5 秒钟。然后，在所需的时间后，吸出缓冲液并立即将板放在冰上。立即加入 100 μL 含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的样品缓冲液，然后刮掉细胞。

将裂解液收集到 1.5 mL 试管中，并立即在 95 摄氏度下加热 10 分钟。继续分析裂解物或将其转移至零下 20 摄氏度进行储存。在制备营养细胞或聚集感受态细胞的悬浮液后，将约 600 μL 加载到微流体室载玻片中。

入口必须完全填充，因此如果需要，请用缓冲液加满它们。让细胞附着 10 分钟。将设备的输入线连接到带有 15 毫升储液罐的电子泵。

使用泵的软件控制，关闭阀门，然后用 DB 填充储液罐。现在，将压力设置为 50 毫巴并打开泵。通过单击阀门打开，用 DB 填充并冲洗管路。冲洗约 30 秒后，将压力调回零，然后关闭阀门。

接下来，将管路连接到载玻片一侧的三个入口之一。不要捕获任何气泡，一旦建立连接，就盖住载玻片那一侧的另外两个入口。现在，通过将排水管连接到载玻片另一侧的单个出口来完成设置。

然后，在荧光显微镜上的明场或相位照明下，用 20 倍空气物镜观察通道并冲洗通道。接下来，将压力设置为约 50 毫巴并打开阀门。液体从排水管中流出后，将外部压力降至零，等待约 30 秒，然后关闭阀门。

接下来，切换到 40 倍油物镜，专注于通道的最宽部分，并准备软件以使用 RFP 或 GFP 照明每三秒收集一次图像。在阀门关闭的情况下，将压力设置为所需的值。然后，以 3 秒的间隔获取 5 张刺激前图像。

接下来，短暂打开阀门以传递刺激。现在，在 45 秒内至少再收集 15 帧数据。按照文本协议中的描述量化响应。

首先，如上一节所述，用 Dictyostelium 加载微流体载玻片。对于此实验，准备两条输入线。要关闭管线，请在输送处理液的管线上使用物理夹子，并使用软件控制的阀门关闭输送 DB 溶液的管线和车辆。

现在，用适当的溶液填充两条线，单独使用缓冲液加载体或用抑制剂等处理的缓冲液填充。冲洗管路后，将它们连接到载玻片侧面带有通道的两个入口，并盖上未使用的入口。然后，将排水管连接到对面的出口。

现在，如前所述使用缓冲液加载体洗涤载玻片。然后，用处理剂填充通道。首先，将流量减少到零毫巴。

接下来，切换阀门，将处理液流化约 15 秒，然后开始计时孵育。每 10 分钟左右，将新鲜的处理液流过细胞约 15 秒，以补充腔室中的氧气水平。使用轨道摇床将贴壁聚集感受态细胞暴露于 5 秒的剪切流中。

Dictyostelium 用咖啡因预处理以降低其基础活性。结果，PKBR1 和 ERK2 的基础活性非常低，并且在刺激下这些激酶的关键残基磷酸化强烈增加。在表达各种荧光标记生物传感器的聚集感受态细胞中，由 PIP3 或新聚合的肌动蛋白募集的两个前沿标志物 PHcrac 和 LimE 在静息细胞中均显示出大部分胞质定位。

在 5 秒的剪切流之后，这些生物传感器迅速重新定位到皮层并返回到胞质溶胶中。使用类似的剪切力实验测试肌动蛋白解聚药物 Latrunculin A 的效果。在这种情况下，营养细胞首先暴露于对照条件下，然后切换到包含所需测试剂的缓冲液中。

Latrunculin A 治疗阻断了前缘标志物向皮层的重新定位。有趣的是，如果流在两秒后没有关闭，而是在实验期间保持开启状态，则仍然观察到瞬态全局响应。在整体响应之后，营养细胞逆流迁移。

正确制备细胞对于这些检测的成功极为重要。营养细胞必须与细菌一起生长，以确保它们对机械刺激的反应性。对于聚集感受态细胞，发育不足或过度发育的细胞往往反应不佳。

生化和显微方法相辅相成，这使我们能够评估大量信号转导中间体对机械刺激的反应。通过添加药理学和遗传扰动，我们可以了解机械刺激是如何被感知和传递的。这对于理解由物理刺激（如剪切流）引导的定向细胞迁移非常重要。

由于机械刺激触发了与化学引诱剂相同的信号转导网络的激活，因此我们现在可以检查各种刺激在细胞上的整合。最终，这些研究将帮助我们了解迁移细胞（例如我们自己的免疫细胞和转移性癌细胞）如何在体内导航。