Respuesta auditiva del médula oblonga y la célula de pelo externa celulares parche abrazadera grabación en ratas postnatales

El objetivo general de este ensayo electrofisiológico es investigar los cambios morfológicos y funcionales de las células ciliadas cocleares durante el desarrollo postnatal. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del departamento de asistentes auditivos, como ¿cuándo adquieren nuestras células ciliadas sus funciones durante el inicio de la audición? La principal ventaja de esta técnica es que podemos evaluar la función de las células ciliadas individuales, aisladas de las crías de rata postnatales.

Demostrando el procedimiento estarán Wenlu Pan, Shasha Guo y Nana Xu, que fueron estudiantes de nuestro laboratorio. Para comenzar este procedimiento, coloque el animal anestesiado en un molde de espuma de polietileno para inmovilizar el cuerpo del animal. Luego, coloque al animal en una mesa antivibratoria en una habitación que atenúe el sonido.

Mantenga la temperatura corporal del animal a 37,5 grados centígrados con una almohadilla térmica. A continuación, limpie el área de la cabeza con etanol al 70%. Realice una incisión de uno a dos milímetros ventral-lateralmente al pabellón auricular externo para colocar el electrodo de referencia o el electrodo de tierra.

Luego, coloque un electrodo de registro subdérmico sobre el vértice del cráneo. Usando el generador de funciones, genere ráfagas de tonos calibradas de varias frecuencias e intensidades. Emitir los estímulos sonoros a través de un altavoz electrostático situado a 10 centímetros de distancia de la cabeza del animal.

Para obtener las respuestas auditivas del tronco encefálico, los potenciales provocados por el sonido se filtran, amplifican y promedian utilizando un procesador multifunción. La grabación ABR de 40 minutos se monitorea en línea y se almacena para su análisis fuera de línea. En esta sección, esterilice la cabeza del animal rociándola con etanol al 70%.

A continuación, abra el cráneo a lo largo de la línea media sagital con unas tijeras y extraiga el cerebro para exponer el oído interno. Luego, transfiera el oído interno a una placa de Petri de 35 milímetros llena de tres mililitros de L-15 Medium helado de Leibovitz. Bajo el microscopio de disección, use pinzas finas para extraer la cápsula ósea de la cóclea.

Después de eso, desenvuelva OC y SV asociados a modiolus. Al sujetar la porción basal de SV con pinzas, separe completamente el OC del SV desenrollando lentamente desde la base hasta el ápice. Posteriormente, corte OC uniformemente en tres trozos con unas tijeras finas.

Todos los pasos deben realizarse en L-15 helado lo más rápido posible para minimizar la degradación y el deterioro de los tejidos. En este paso, con una punta de pipeta de 200 microlitros, transfiera los segmentos de OC a un portaobjetos de vidrio. Fíjelos con 100 microlitros de paraformaldehído al 4% durante al menos cuatro horas a cuatro grados centígrados.

A continuación, lave el pañuelo desplazando el paraformaldehído con 100 microlitros de PBS fresco. Luego, lave el pañuelo tres veces durante 10 minutos cada vez. Posteriormente, incubar el tejido con un agente de permeabilidad al 0,3% en PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente.

Después de 30 minutos, deseche el agente de permeabilidad y lave el pañuelo tres veces con PBS. Posteriormente, bloquee el tejido con suero de cabra normal al 10% y PBS durante una hora a temperatura ambiente. Incubar el tejido con anticuerpo anti-prestina C terminal y solución bloqueante durante dos horas a temperatura ambiente o a cuatro grados centígrados durante la noche.

Luego, lave el pañuelo tres veces con PBS durante cinco minutos cada vez. Después, incuba el tejido con el anticuerpo secundario conjugado Alexa 488 en solución bloqueante durante una hora a temperatura ambiente en la oscuridad. Lave el pañuelo tres veces con PBS durante cinco minutos cada vez en la oscuridad.

A continuación, incube el tejido con rodamina faloidina durante 10 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Lave el pañuelo tres veces con PBS durante cinco minutos en la oscuridad. Luego, monte la muestra en un portaobjetos de vidrio con medio de montaje.

Visualícelo con microscopía confocal utilizando láseres de 405 nanómetros, 488 nanómetros y 594 nanómetros. En este procedimiento, utilice el extractor de pipetas y el microforjador. Fabrica pipetas de parche con un diámetro de punta de dos a tres micras.

A continuación, rellene las pipetas con solución intracelular. Con una punta de pipeta de 200 microlitros, transfiera un trozo de OC a una placa de Petri de 35 milímetros. Digiera el tejido con 100 microlitros de medio de digestión enzimática durante cinco minutos a temperatura ambiente.

A continuación, desplazar el medio de digestión enzimática por 100 microlitros de L-15. Corta el tejido en trozos pequeños con un microbisturí para aislar las células ciliadas. Después de un pipeteo suave, transfiera las células a una pequeña cámara de plástico casera llena de solución de baño sin enzimas.

Luego, coloque la cámara en la platina de un microscopio invertido y encuentre los OHC solitarios de apariencia saludable. A continuación, cargue la pipeta de parche en la platina principal de un amplificador 700B. Coloque la pipeta de parche alrededor de la parte inferior de la célula ciliada externa.

Después de eso, el parche de célula completa sujeta el OHC sellando la pared lateral del cuerpo celular. Aplique una succión ligera hasta que se rompa la membrana celular. Luego, establezca el potencial de retención en 70 milivoltios.

Las celdas con una resistencia de acceso que oscila entre 10 y 17 megaohmios y una resistencia de membrana que oscila entre 100 y 500 megaohmios se consideran una configuración de celda completa exitosa. Aplique voltaje de hiperpolarización y despolarización a la celda para provocar corrientes de toda la celda. Mida la capacitancia de membrana de los OHC utilizando un protocolo de estímulo de voltaje de dos ondas sinusoidales controlado por el software de fijación de parche.

Establezca el rango de voltaje de estimulación de 140 a 110 milivoltios y almacene los datos para el análisis fuera de línea. Después de una digestión suave, los OHC se aislaron del CO. Se realizaron registros de pinzas de voltaje de celda completa a partir de OHC aisladas agudamente de la cóclea de rata. Aquí se muestra un ejemplo representativo de la corriente de toda la celda registrada desde un OHC P9 aislado en respuesta al potencial de membrana cambiado de 140 a 107 milivoltios.

Esta figura muestra la capacitancia de membrana no lineal obtenida de dos OHC a diferentes edades. Las respuestas de voltaje de capacitancia se ajustaron a la función de Boltzmann. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en dos horas, si se realiza adecuadamente.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otras medidas como el Western blot y la PCR para responder a preguntas adicionales como evaluar el nivel de expresión de alguna proteína, como la prestina en nuestras células ciliadas. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de las células ciliadas exploraran las propiedades electrofisiológicas en la cóclea y el sistema vestibular. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo investigar los cambios morfológicos y funcionales de las células ciliadas cocleares durante el desarrollo postnatal.