Name: Respuesta auditiva del médula oblonga y la célula de pelo externa celulares parche abrazadera grabación en ratas postnatales (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-24T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Aprende a registrar la respuesta auditiva del tronco encefálico y realizar grabaciones de patch clamp en células ciliadas externas de ratas postnatales. Este método permite evaluar la función individual de las células ciliadas durante el desarrollo auditivo.

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Este trabajo fue financiado por becas del programa 973 (2014CB943002) y la nacional Ciencias naturales Fundación de China (11534013, 31500841).

Todos los protocolos experimentales con sujetos animales fueron aprobados por el Comité de ética Animal de la Universidad de médica sur.
1. Preparar soluciones para experimentos
<ol><li>Preparar la anestesia (véase Tabla de materiales): 1,5% pentobarbital sódico disuelto en ddH2O.</li>
	<li>Preparar la solución de disección (véase Tabla de materiales): disolver una bolsa de polvo de L-15 de Leiboviz en 1 L de ddH2O. Ajuste del pH a 7.3 con 1 M NaOH. Ajuste la osmolaridad a 300-330 mOsm mediante un osmómetro y 10 mM HEPES antes de su uso.</li>
	<li>Disolver 2 mg/mL colagenasa IV (véase Tabla de materiales) en la solución de disección preparada en el paso 1.2.</li>
	<li>Preparar las soluciones de inmunotinción (véase Tabla de materiales): disolver el paraformaldehído al 4% en tampón fosfato salino (PBS). PRECAUCIÓN: Paraformaldehido es tóxica; usar protección adecuada.</li>
	<li>Diluir al agente de permeabilidad de 0.3% en PBS. Diluir el suero de cabra normal de 10% en PBS como el amortiguador de bloqueo. Diluir el anticuerpo de prestin 1: 200 en solución amortiguadora de bloqueo. Diluir el anticuerpo conjugado con Alexa488 1: 600 en solución amortiguadora de bloqueo. Diluir el Phalloidin-Tetramethylrhodamine B isotiocianato 1: 200 en PBS.</li>
	<li>Preparar la solución extracelular (véase Tabla de materiales): preparar medio de L-15 de Leiboviz como se describe anteriormente (paso 1.2).</li>
	<li>Preparar la solución intracelular (véase Tabla de materiales).</li>
</ol>2. grabación de ABR
Nota: Grabación de ABR se ha descrito previamente en detalle en nuestro anterior estudio9.
<ol><li>Anestesiar ratas Sprague Dawley (SD) (cachorros de 1-14 días y 2 meses de edad adultos, ambos sexos) con una sola inyección de pentobarbital de sodio 1.5% (22 mg/kg para crías y 30 mg/kg para los adultos, intraperitoneales (i.p.)).</li>
	<li>Colocar el animal anestesiado en un molde de espuma de polietileno para inmovilizar el cuerpo del animal. Coloque el animal en una mesa antivibración en una sala de atenuación de sonido. Mantener la temperatura corporal del animal a 37,5 ° C con una almohadilla de calefacción.</li>
	<li>Limpie el área de la cabeza con etanol al 70% (vol/vol). Utilizando unas tijeras finas, realizar una incisión de 1-2 mm ventrolateral en el pabellón auricular externo para colocar el electrodo de referencia o tierra. Un electrodo de aguja subdérmicos (electrodo de la grabación) está situado sobre el vértice del cráneo (figura 1A).</li>
	<li>Utilizando el generador de funciones, generar explosiones de tono calibrado (1 ms de subida/bajada, meseta de 3 ms) de distintas frecuencias (2, 4, 8, 16, 24 y 32 kHz) e intensidades (se redujo de 85 a 10 dB SPL en el paso de 5 dB). Variar la frecuencia y amplitud manualmente o utilizando un ordenador. Entregan estímulos de sonido a través de un altavoz electrostático situado 10 cm a hacia la cabeza del animal.</li>
	<li>Filtro (100-1.000 Hz), amplificar y promedio (256 veces) el potencial provocó sonido usando un procesador de múltiples funciones para conseguir el ABRs. Los rastros ABR se monitorea en línea y almacenados para análisis fuera de línea. Tarda unos 40 minutos para completar la grabación de un animal ABR. Nota: Generalmente, de tres a siete picos (onda onda VII) con latencias inferior a 15 ms puede ser identificado (figura 1B). El umbral ABR se define como el mínimo nivel sonoro en el que la onda I y II podríamos detectar.</li>
	<li>Eutanasia antes los animales despiertos de la anestesia (con una inyección intraperitoneal de pentobarbital de sodio de 1.5% 0,3 mL).</li>
</ol>3. la disección del órgano de Corti (OC)
<ol><li>Anestesiar crías de rata. Para las ratas menos de 6 días de edad (< P6), mantener al animal en una placa de cultivo de 100 mm y cubrir el plato con hielo durante 10 minutos. Para ratas > P6, anestesiar al animal con una sola inyección de pentobarbital de sodio 1.5% (22 mg/kg, i.p.). Decapita a las crías de rata después de la anestesia.</li>
	<li>Esterilizar la cabeza rociando con etanol al 70% (vol/vol).</li>
	<li>Abrir el cráneo a lo largo de la línea media sagital con tijeras; quitar el cerebro para exponer el oído interno.</li>
	<li>De transferencia del oído interno en un plato de Petri de 35 mm con 3 mL de helado L-15 (figura 2A).</li>
	<li>Bajo el microscopio de disección, usar pinzas finas para quitar la cápsula ósea de la cóclea (figura 2B).</li>
	<li>Desenvuelva el OC y asociados estría vascular (SV) desde el modiolus.</li>
	<li>Mediante la celebración de la porción basal de la SV con pinzas, separar el OC SV totalmente desenrollando lentamente desde la base al ápice (figura 2).</li>
	<li>Trocear el OC uniformemente tres usando tijeras finas (Figura 2D).</li>
</ol>4. tinción de inmunofluorescencia de
<ol><li>Utilizando una pipeta de 200 μL, transferencia de los segmentos de OC (paso 3.8) sobre un portaobjetos de vidrio y fijar con 100 μl de paraformaldehído al 4% durante al menos 4 h a 4 ° C. PRECAUCIÓN: Paraformaldehido es tóxica; usar protección adecuada.</li>
	<li>Lavar el tejido por desplazar el paraformaldehido con 100 μl de PBS fresco. Lavar el tejido tres veces durante 10 minutos.</li>
	<li>Incubar el tejido con el agente de permeabilidad de 0.3% en PBS durante 30 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Desechar al agente de permeabilidad en PBS y lave el tejido tres veces con PBS.</li>
	<li>Bloque con 10% de suero normal de cabra en PBS durante 1 h a temperatura ambiente.</li>
	<li>Incubar con el anticuerpo anti-prestin-C-terminal (1: 200) en el bloqueo de solución por 2 h a temperatura ambiente o a 4 ° C durante la noche.</li>
	<li>Lavar tres veces con PBS durante 5 minutos.</li>
	<li>Incubar con anticuerpos secundarios conjugados con Alexa488 (1: 600) en solución de bloqueo durante 1 hora a temperatura ambiente en la oscuridad.</li>
	<li>Lavar tres veces con PBS durante 5 minutos en la oscuridad.</li>
	<li>Incubar 10 min a temperatura ambiente en la oscuridad con rodamina-phalloidin (1: 200).</li>
	<li>Lavar tres veces con PBS durante 5 minutos en la oscuridad.</li>
	<li>Montar en un portaobjetos de vidrio con medio de montaje (contiene DAPI). Imagen con microscopía confocal usando 405 nanómetro, 488 nanómetro y láseres de 594 nm. Ajustar la potencia del láser en 0.1-0.5 mW y la exploración de la velocidad en 0,5 fotogramas/s.</li>
</ol>5. Patch clamp grabación de CCE aisladas
<ol><li>Utilizar el extractor de la pipeta y micro-falsificador para hacer parche pipetas con un diámetro de punta 2-3 μm. Back-fill las pipetas con solución intracelular. Generalmente, la resistencia inicial de pipeta patch fue 2.5-3.5 MΩ en la solución del baño.</li>
	<li>Utilizando una pipeta de 200 μL, transferir un trozo de la OC (de paso 3.8) en una placa de Petri de 35 mm. Digerir el tejido con 100 μl de medio de digestión enzimática (colagenasa IV, véase Tabla de materiales) por 5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Desplazar el medio de la digestión enzimática con 100 μl de L-15. Cortar el tejido en pequeños trozos con un bisturí micro para aislar las células de pelo.</li>
	<li>Después de su uso suave, transferir las células a una pequeña cámara de plástico casera (diámetro ~ 1,5 cm) llena de solución de baño enzima (~ 1,5 mL, ver Tabla de materiales).</li>
	<li>Coloque la cámara sobre la platina de un microscopio invertido. Encontrar el CCE solitario sanos que aparecen.</li>
	<li>Cargar la pipeta de parche en el escenario principal de un amplificador 700B. Mover con cuidado la pipeta patch un micromanipulador y colocarlo alrededor de la parte inferior de la célula de pelo externa (Figura 3A).</li>
	<li>Abrazadera del remiendo de celulares la CCE sellando la pared lateral del cuerpo celular. Luz succione hasta que se rompe la membrana celular. Establecer la explotación potencial en -70 mV. Células con acceso varió de 10 a 17 MΩ resistenciaa la membrana oscilan entre 100 y 500 MΩ y se consideran una acertada configuración de celulares.</li>
	<li>Utilizando control de computadora, aplique hiperpolarizantes y despolarizantes voltaje (250 ms de duración y hasta de −140 + 94 mV en 13 pasos de mV) a la celda para obtener celulares corrientes.</li>
	<li>Amplificar las corrientes celulares, (frecuencia de 5 kHz) del filtro por un amplificador 700B. Convertir los datos de un conversor de 1440A y tienda para análisis fuera de línea.</li>
	<li>Medir la capacitancia de la membrana de CCE usando un protocolo de estímulo dos sinusoidal voltaje controlado por un software de abrazadera del remiendo. Fijar la gama de voltaje de estimular de -140 a 110 mV. Almacenar los datos para el análisis fuera de línea.</li>
</ol>

<ol><li>He, D. Z., Zheng, J., Kalinec, F., Sacchi Kakehata, S. S. antos-, J, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+in+to+the+amazing+outer+hair+cell%3A+membrane+wizardry+with+a+twist+and+shout%5BTitle%5D)+AND+%22J+Membr+Biol%22%5BJournal%5D)">Tuning in to the amazing outer hair cell: membrane wizardry with a twist and shout.</a> J Membr Biol. 209, 119-134 (2006).</li>
<li>Dallos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cochlear+amplification%2C+outer+hair+cells+and+prestin%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Cochlear amplification, outer hair cells and prestin.</a> Curr Opin Neurobiol. 18, 370-376 (2008).</li>
<li>Zheng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prestin+is+the+motor+protein+of+cochlear+outer+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Prestin is the motor protein of cochlear outer hair cells.</a> Nature. 405, 149-155 (2000).</li>
<li>Abe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+expression+of+the+outer+hair+cell+motor+prestin+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Membr+Biol%22%5BJournal%5D)">Developmental expression of the outer hair cell motor prestin in the mouse.</a> J Membr Biol. 215, 49-56 (2007).</li>
<li>Waguespack, J., Salles, F. T., Kachar, B., Ricci, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stepwise+morphological+and+functional+maturation+of+mechanotransduction+in+rat+outer+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Stepwise morphological and functional maturation of mechanotransduction in rat outer hair cells.</a> J Neurosci. 27, 13890-13902 (2007).</li>
<li>Zhang, L. I., Bao, S., Merzenich, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+and+specific+influences+of+early+acoustic+environments+on+primary+auditory+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Persistent and specific influences of early acoustic environments on primary auditory cortex.</a> Nat Neurosci. 4, 1123(2001).</li>
<li>De, V. -S. E., Chang, E. F., Bao, S., Merzenich, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+period+window+for+spectral+tuning+defined+in+the+primary+auditory+cortex+%28A1%29+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Critical period window for spectral tuning defined in the primary auditory cortex (A1) in the rat.</a> J Neurosci. 27, 180-189 (2007).</li>
<li>He, D. Z., Evans, B. N., Dallos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+appearance+and+development+of+electromotility+in+neonatal+gerbil+outer+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Res%22%5BJournal%5D)">First appearance and development of electromotility in neonatal gerbil outer hair cells.</a> Hearing Res. 78, 77-90 (1994).</li>
<li>Hang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronized+Progression+of+Prestin+Expression+and+Auditory+Brainstem+Response+during+Postnatal+Development+in+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Plast%22%5BJournal%5D)">Synchronized Progression of Prestin Expression and Auditory Brainstem Response during Postnatal Development in Rats.</a> Neural Plast. , 4545826(2016).</li>
<li>Ehret, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+absolute+auditory+thresholds+in+the+house+mouse+%28Mus+musculus%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Audiol+Soc%22%5BJournal%5D)">Development of absolute auditory thresholds in the house mouse (Mus musculus).</a> J Am Audiol Soc. 1, 179-184 (1976).</li>
<li>Møller, A. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aM%C3%B8ller%2C+AR+%22Hearing%3Aanatomy%2C+physiology%2C+and+disorders+of+the+auditory+system%22">Hearing:anatomy, physiology, and disorders of the auditory system</a>. , Academic Press. Dallas. (2006).</li>
<li>He, D. Z., Zheng, J., Edge, R., Dallos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+cochlear+inner+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Res%22%5BJournal%5D)">Isolation of cochlear inner hair cells.</a> Hearing Res. 145, 156-160 (2000).</li>
<li>Tang, J., Pecka, J. L., Tan, X., Beisel, K. W., He, D. Z. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+Pendrin+Protein%2C+an+Anion+Transporter+and+Molecular+Motor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biological+Chem%22%5BJournal%5D)">Engineered Pendrin Protein, an Anion Transporter and Molecular Motor.</a> J Biological Chem. 286, 31014-31021 (2011).</li>
<li>Fu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Effects+of+Urethane+on+Rat+Outer+Hair+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Plast%22%5BJournal%5D)">The Effects of Urethane on Rat Outer Hair Cells.</a> Neural Plast. 2016, 1-11 (2016).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En las ratas más jóvenes que el día 11, no pudo observarse ningún potencial de acción en respuesta a la estimulación sonora en la corteza auditiva6,7. Por lo tanto, día postnatal 11 se describe como "Inicio de la audiencia"10. El desarrollo de la función auditiva antes de inicio de la audiencia no fue estudiado bien todavía. El método similar para la grabación de ABR adultos, demostramos que abr podría ser provocada por ráfaga de tono puro...

Dos funciones distintas de las células de pelo sensoriales cocleares son esenciales para mamíferos de audición: transducción de mechanoelectric (MET) y electromotilidad1,2. Por MET canales en el paquete de cabello, ciliadas (CCI) y CCE convertir la vibración sonora en cambios de potencial de membrana, así como las señales eléctricas de las neuronas del ganglio espiral inervada. OHCs cambian su longitud de la célula con el potencial de membrana y amplifican la vibración del sonido de bajo nivel. Esta actividad denominada electromotilidad es derivada por la proteína motora prestin situado en la pared lateral del CCE3.
En muchas especies como roedores, la función auditiva es inmadura en la época postnatal temprana4,5. Ningún potencial de acción en respuesta a señales de sonido podría ser detectado en la corteza auditiva antes de la audiencia Inicio6,7. Desarrollo de la morfología y función de la cóclea ha sido ampliamente estudiadas en el ratón, jerbo y rata4,5,8. La mecanotransducción y electromotilidad de las células de pelo también se desarrollan en la primera época de vida5.
Para evaluar la sensibilidad auditiva de ratas a diferentes edades postnatales, hemos desarrollado un método de respuesta auditiva del médula oblonga (ABR) en crías de rata. Abrazadera del remiendo de celulares es una tecnología ideal para investigar la CCE electrophysiologically. Sin embargo, en comparación con la abrazadera del remiendo en las neuronas y otras células epiteliales, la baja tasa de células completas sellado limitada la investigación de electromotilidad de CCE aislada.
Aquí describimos un procedimiento para investigar la CCE morfológicamente y electrophysiologically en agudo disociado cóclea de ratas postnatales. Este método puede ser modificado para estudiar los mecanismos moleculares que regulan la función y el desarrollo de la célula de pelo interna.

<table><tbody><tr><td><fuerte>anestésico</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital sódico</td><td>Sigma</td><td>P3761</td><td>1.5% en agua</td></tr><tr><td><fuerte>Nombre</fuerte></td><td><fuerte>Empresa</fuerte></td><td><fuerte>Número de catálogo</fuerte></td><td><fuerte>Comentarios</fuerte></td></tr><tr><td><fuerte>Solución de disección</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leiboviz's L-15 Medium</td><td>Life Technologies</td><td>41300-039</td><td>1 paquete en 1 L de agua</td></tr><tr><td>Colagenasa IV</td><td>Sigma</td><td>C5138</td><td>2 mg/mL en L-15</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>7365-45-9</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Nombre</td><td>Company</strong</td><td>>Número de catálogo</td><td>Comentarios</ strong</td></tr><tr><td>>Immunostaining solutions</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td>PH 7.3</td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Sigma</td><td>158127</td><td>4% en PBS</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Amresco</td><td>ZS-0694</td><td>0.3% en PBS</td></tr><tr><td>Suero de cabra normal</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10000C</td><td>10% en PBS</td></tr><tr><td>anticuerpo prestin</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-22694</td><td>dil 1:200</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-anticuerpo conjugado</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11055</td><td>dil 1:600</td></tr><tr><td>Faloidina-tetrametilrodamina B isotiocianato Sigma</td><td></td><td>P1951</td><td>dil 1:200</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Solarbio</td><td>C0060</td><td>dil 1:20</td></tr><tr><td>Name</td><td> Compañía<</td><td>strong>Número de catálogo</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Solución extracelular</td>Leiboviz's <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-15 Medium</td><td>Life Technologies</td><td>41300-039</td><td>1 paquete en 1 L de agua</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>7365-45-9</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Solución intracelular</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CsCl</td><td>Sigma</td><td>7647-17-8</td><td>140 mM</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>7791-18-6</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>67-42-5</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>7365-45-9</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Nombre</td><td>Compañía</strong</td><td>>Número de catálogo</strong</td><td>>Comentarios</td></tr><tr><td>Equipo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Osmómetro</td><td>Gonotec</td><td>OSMOMAT 3000 basic</td><td></td></tr><tr><td>Forcep</td><td>WPI</td><td>14095</td><td>Pinzas dumont</td></tr><tr><td>Extractor de micropipetas</td><td>Sutter Instrument</td><td>MODLE-P97</td><td></td></tr><tr><td>Micro Forge</td><td>Narishigen</td><td>MF-830</td><td></td></tr><tr><td>Mini Sistema Operativo</td><td>Sutter Instrument</td><td>MP-285</td><td></td></tr><tr><td>MultiClamp</td><td>Axon</td><td>700B</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de adquisición de datos de bajo ruido</td><td>Axon</td><td>1440A</td><td></td></tr><tr><td>ES1 altavoz</td> Sistema TDT <td>de Tucker-Davis Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3</td><td>Tucker-Davis Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</strong</td><td>>Número de catálogo</strong</td><td>>Comentarios</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SigGenRP software</td> Software BioSigRP de <td>Tucker-Davis Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Tucker-Davis Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>jClamp</td><td>Scientific Solutions</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</strong</td><td>>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentarios</td></tr><tr><td>Animal</td><td></td><td></td><td></td></tr>SD <tr><td>rata</td><td>Centro de Animales Experimentales de la Universidad</td><td></td><td></td> Médica del Sur</tr></tbody></table>

respuesta auditiva del médula oblonga y la célula de pelo externa celulares parche abrazadera grabación en ratas postnatales

Auditory Brainstem Response and Outer Hair Cell Whole-cell Patch Clamp Recording in Postnatal Rats

La célula de pelo externa es uno de los dos tipos de células de pelo sensoriales en la cóclea mamífera. Modificar la longitud de su celular con el receptor potencial para amplificar la vibración débil de señal de bajo nivel sonoro. La morfología y propiedades electrofisiológicas de las células ciliadas externas (CCE) se convierten en edad postnatal. La maduración de la célula de pelo externa puede contribuir al desarrollo del sistema auditivo. Sin embargo, el proceso de desarrollo de la CCE no se estudia bien. Esto es en parte debido a la dificultad para medir su función mediante un método electrofisiológico. Con el fin de desarrollar un método simple para solucionar el problema anterior, aquí se describe un protocolo paso a paso para estudiar la función del CCE en agudo disociado cóclea de ratas postnatales. Con este método, podemos evaluar la respuesta coclear al estímulo de tono puro y examinar el nivel de expresión y la función de la proteína motora prestin en CCE. Este método también puede utilizarse para investigar las células ciliadas internas (CCI).

ABR puede sacado de rata anestesiados cachorros mayores de día postnatal 7 (P7) utilizando ráfagas de tono puro (figura 1A). Como se muestra en la figura 1B, las formas de onda ABR obtienen de crías de rata demostradas solamente tres o cuatro distintas ondas con amplitud pequeña. Generalmente, hasta siete picos se observaron en las formas de onda ABR de animales adultos (figura 1B).
<p class="jov...

Este protocolo describe métodos para registrar la respuesta auditiva del médula oblonga de crías de rata postnatal. Para examinar el desarrollo funcional de las células de pelo externas, el procedimiento experimental de la abrazadera del remiendo de célula entera en aisladas células de pelo externas se describe paso a paso.

Respuesta auditiva del médula oblonga y la célula de pelo externa celulares parche abrazadera grabación en ratas postnatales

The outer hair cell is one of the two types of sensory hair cells in the mammalian cochlea. They alter their cell length with the receptor potential to ...

El objetivo general de este ensayo electrofisiológico es investigar los cambios morfológicos y funcionales de las células ciliadas cocleares durante el desarrollo postnatal. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del departamento de asistentes auditivos, como ¿cuándo adquieren nuestras células ciliadas sus funciones durante el inicio de la audición? La principal ventaja de esta técnica es que podemos evaluar la función de las células ciliadas individuales, aisladas de las crías de rata postnatales.Demostrando el procedimiento estarán Wenlu Pan, Shasha Guo y Nana Xu, que fueron estudiantes de nuestro laboratorio. Para comenzar este procedimiento, coloque el animal anestesiado en un molde de espuma de polietileno para inmovilizar el cuerpo del animal. Luego, coloque al animal en una mesa antivibratoria en una habitación que atenúe el sonido.Mantenga la temperatura corporal del animal a 37,5 grados centígrados con una almohadilla térmica. A continuación, limpie el área de la cabeza con etanol al 70%. Realice una incisión de uno a dos milímetros ventral-lateralmente al pabellón auricular externo para colocar el electrodo de referencia o el electrodo de tierra.

auditory-brainstem-response-outer-hair-cell-whole-cell-patch-clamp

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Plenario de células patch-clamp grabaciones de las dendritas de fibras nerviosas auditivas en la sinapsis cinta del pelo interior de células de la cóclea de los mamíferos.

Grabaciones postsinápticos en las dendritas aferentes cocleares ponerse en contacto con las células ciliadas internas: Comunicado de Vigilancia multivesiculares en una sinapsis cinta

Un método fiable para investigar células ciliadas externas (OHC) las respuestas de móviles, incluyendo electromotility, motilidad lenta y flexión, se describe. Motilidad OHC es provocado por la estimulación con un campo externo eléctrica alterna, y el método tiene la ventaja de la grabación de imágenes a alta velocidad, la iluminación basada en LED, y el software de última generación de imágenes de análisis.

La investigación de la motilidad células ciliadas externas, con una combinación de la estimulación externa alterna de campo eléctrico de alta velocidad y Análisis de Imágenes

El propósito de este video es para demostrar los procedimientos para obtener las células sanas, intactas pelo de los órganos del oído interno de pez cebra adultos y luego usarlos para estudios de patch clamp objetivo de caracterizar las propiedades biofísicas de los canales dependientes de voltaje.

Grabaciones de patch clamp en Inner células del oído pelo Aislado de pez cebra

Este video muestra un método para registrar las respuestas auditivas del tronco encefálico (ABRs) de las crías de rata. Describe los pasos para la colocación de electrodos, la aplicación de estímulos sonoros y el análisis de procesamiento de señales en el tronco encefálico para evaluar las respuestas neuronales.

Registro de las respuestas auditivas del tronco encefálico en un cachorro de rata

Este video muestra el procedimiento para implantar un dispositivo coclear en un ratón sordo y aplicar estímulos eléctricos para registrar las respuestas auditivas del tronco encefálico. Este procedimiento permite comprender los mecanismos básicos de la audición eléctrica y puede contribuir a los avances en la tecnología de implantes cocleares y la neurociencia auditiva.

Registro de las respuestas auditivas del tronco encefálico evocadas eléctricamente en un ratón sordo

Este video muestra la técnica de patch-clamp para medir las corrientes iónicas en los cuerpos de las células de las neuronas sensoriales del oído interno. En él se detalla la preparación y el uso de una pipeta de pinza parche pulida rellena con una solución interna que contiene anfotericina B, que perfora la membrana para permitir el movimiento de los iones mientras se conservan las condiciones intracelulares. Los pulsos de voltaje se aplican para activar y registrar la actividad del canal...

Grabaciones de patch-clamp perforado de cuerpos de células de neuronas sensoriales del oído interno

Este video demuestra el examen de la excitabilidad de las neuronas sensoriales en los ganglios de la raíz dorsal utilizando la técnica de pinza de parche para medir la reobase y el potencial de membrana, analizando las respuestas de las neuronas a las inyecciones incrementales de corriente.

Registros de pinzamiento de parche de célula completa en ganglios de la raíz dorsal de rata intacta

Este manuscrito describe cómo preparar ganglios de raíz dorsal intactos para grabaciones de pinza de parche. Esta preparación mantiene el microambiente para las neuronas y las células gliales satélite, evitando así los cambios fenotípicos y funcionales observados con las neuronas DRG disociadas.

Patch Clamp grabaciones en Intacto dorsal ganglios de la raíz de ratas adultas

Presentamos una técnica de administración localizada de fármacos a través de la ruta trans-timpánica en la cóclea. Administración de fármacos por esta vía no interferiría con la eficacia de la lucha contra el cáncer de los medicamentos quimioterapéuticos como el cisplatino.

Trans-timpánica fármaco para el tratamiento de la ototoxicidad

La audiometría de respuesta evocada por el tronco cerebral es una herramienta importante en la neurofisiología clínica. Hoy en día, la audiometría de respuesta evocada con tronco encefálico también se aplica en la ciencia básica y los estudios preclínicos que involucran modelos animales farmacológicos y genéticos. Aquí proporcionamos una descripción detallada de cómo las respuestas del tronco cerebral auditivo se pueden registrar y analizar con éxito en ratones.

Adquisición y análisis de datos en Brainstem Evocada Audiometría de Respuesta en Ratones

A continuación se presentan métodos que proporcionan instrucciones detalladas para la disección, la disociación, el cultivo y el registro de pinzas de parche de las neuronas ganglionares vestibulares y ganglionares espirales del oído interno.

Aislamiento y cultivo de somas vestibulares y ganglionares espirales de roedores neonatales para registros de patch-clamp

Aprende a registrar la respuesta auditiva del tronco encefálico y realizar grabaciones de patch clamp en células ciliadas externas de ratas postnatales. Este método permite evaluar la función individual de las células ciliadas durante el desarrollo auditivo.

Respuesta auditiva del médula oblonga y la célula de pelo externa celulares parche abrazadera grabación en ratas postnatales

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