Técnicas de micromanipulación que permite el análisis de las dinámicas morfogenéticas y facturación de los reguladores citoesqueléticos

El objetivo general de utilizar una combinación de técnicas de micromanipulación y microscopía óptica como FRAP y fotoactivación es monitorear la dinámica espaciotemporal de las proteínas involucradas en la regulación y migración del citoesqueleto en condiciones distintas o de una manera dependiente de la vía de señalización. Los métodos de micromanipulación discutidos aquí son útiles para la entrega directa de cualquier tipo de molécula a las células, así como para la manipulación inducida por la luz de la actividad de las proteínas dentro de ubicaciones subcelulares definidas. Por lo tanto, la principal ventaja de las técnicas aquí presentadas es que permiten determinar los efectos instantáneos que las proteínas ejercen sobre las células, junto con el seguimiento de su movilidad a través de la célula.

Para comenzar este procedimiento, pase células B16-F1 previamente cultivadas en una proporción de uno a cinco a un plato de plástico de tres centímetros. Aspirar el medio de cultivo celular. Lavar las células con PBS, aspirar el PBS y añadir tripsina EDTA para separar las células.

Añadir medio de cultivo celular a las células tripsinizadas. Vuelva a suspender y transfiera las celdas a tubos de halcón, después de esta centrífuga a 1000 rpm durante tres a cinco minutos. Después de colocar las células B16-F1 en un plato de tres centímetros y dejar que se propaguen durante al menos seis horas, transfecte las células B16-F1 agregando una mezcla de 500 nanogramos de construcción de ADN y un microlitro de reactivo de transfección en una solución que contenga cloruro de sodio de 150 milimolares.

En el caso de las células B16-F1, recubra cubra cubreobjetos de 15 milímetros con 150 microlitros de solución de laminina e incube durante una hora a temperatura ambiente. En el caso de las células NIH 3T3, recubra los cubreobjetos con una solución de fibronectina e incube durante una hora a temperatura ambiente. Después de la incubación, lave los cubreobjetos incubados de laminina y fibronectina con PBS y luego aspire el PBS.

Siembre dos mililitros de los fibroblastos NIH 3T3 en una proporción de uno a 20 desde un plato confluente en los cubreobjetos recubiertos de fibronectina. Pipetear dos mililitros de las células B16-F1 transfectadas en una proporción de uno a 30 desde una placa confluente sobre los cubreobjetos recubiertos de laminina. Después de esto, permita que las células se extiendan en cubreobjetos recubiertos de laminina y fibronectina durante la noche en una incubadora de cultivo de tejidos a 37 grados Celsius antes de la microscopía.

Coloque la cubierta de vidrio con las celdas hacia arriba sobre una cámara de imágenes de aluminio RC-26 conductora de calor. A continuación, coloque un sellador de plástico encima del vidrio de la cubierta para hacer un sello seguro entre el cubreobjetos y la cámara, fije atornillando el sellador de plástico con las abrazaderas deslizantes de la cámara para evitar fugas del medio. Ahora, pipetee medio de microscopía precalentado a 37 grados centígrados en el área central.

Inserte el detector de calor en la ranura designada de la cámara y conecte los electrodos de la cámara a un controlador de temperatura automático TC-324B manteniendo una temperatura constante de 37 grados Celsius. Centrifugar una solución de proteína previamente descongelada a 10.000 g durante al menos 30 minutos para eliminar los agregados de proteínas que pueden provocar la obstrucción de la aguja si están presentes en el capilar de microinyección. Con una punta de pipeta flexible, cargue una aguja de microinyección con un microlitro de solución de proteínas desde la parte posterior.

Si hay burbujas de aire en la punta de la aguja, golpee suavemente la base de la aguja para eliminarlas. A continuación, ajuste con cuidado el soporte de la aguja en el dispositivo de micromanipulación. Al enroscar la aguja de microinyección en el soporte de la aguja, aplique presión a la aguja utilizando un dispositivo de presión de microinyección antes de trasladar la punta de la aguja al medio de cultivo celular.

A continuación, coloque la aguja en el campo de visión utilizando un objetivo de bajo aumento, luego encuentre una celda de interés y baje gradualmente la aguja por encima de la celda. Para la microinyección, toque suavemente la membrana plasmática de la célula, que puede ser suficiente para penetrar en la célula o ayudar a la ruptura transitoria de la membrana mediante un golpecito muy suave en la configuración del microscopio. Detenga el proceso de inyección tan pronto como el flujo hacia la célula sea visible moviendo la punta de la aguja hacia arriba en el medio.

Antes de activar el láser, cambie al canal GFP e inicie la adquisición de lapso de tiempo de imagen. A continuación, dibuje manualmente la región que se va a fotoblanquear en el canal GFP mientras visualiza la pantalla. Inicie el fotoblanqueo mediante un disparo manual del láser de 405 nanómetros al menos tres o cuatro fotogramas después del inicio de la adquisición de la imagen.

Establezca la adquisición de imágenes GFP de 488 nanómetros en el software en una exposición de 500 milisegundos y un intervalo de tiempo de 1500 milisegundos. A continuación, ajuste la configuración del software para adquirir películas de lapso de tiempo de doble canal o de triple canal marcando la serie de longitud de onda en cuadrado y seleccionando el número deseado de canales en el menú de adquisición de longitud de onda. Antes de activar el láser, inicie la adquisición de lapso de tiempo de la imagen y dibuje manualmente la región que se va a fotoactivar en el canal de contraste de fase mientras visualiza la pantalla.

Después de esto, inicie la fotoactivación mediante un disparo manual del láser de 405 nanómetros al menos tres o cuatro fotogramas después del inicio de la adquisición de la imagen. Para analizar los resultados de FRAP, abra las películas de lapso de tiempo derivadas de VisiView en el software MetaMorph. Dive los valores de intensidad de las regiones fotoblanqueadas para cada punto de tiempo de recuperación de fluorescencia dibujando manualmente las regiones respectivas con MetaMorph.

Dibuje una forma en la punta del laminupidio que cubra la totalidad o parte del área fotoblanqueada y ajuste manualmente su posición en los fotogramas posteriores si es necesario para rastrear los cambios en las intensidades lamelipodiales de la región respectiva a lo largo del tiempo durante el desplazamiento de la punta que avanza. Para la corrección del fondo y la adquisición de fotoblanqueo, analice las regiones fuera y dentro de las celdas, respectivamente. Una vez seleccionada una región de interés, extraiga sus valores de intensidad en MetaMorph utilizando el menú medir las mediciones de la región.

Asegúrese de que las opciones de tiempo transcurrido e intensidad media estén seleccionadas en el menú de configuración. Haga clic en abrir registro y seleccione intercambio dinámico de datos. A continuación, haga clic en Aceptar para abrir una hoja de cálculo de Excel y vuelva a hacer clic en el botón Abrir registro para pegar los valores de MetaMorph en Excel.

Utilice los valores de intensidad derivados de MetaMorph para calcular las curvas de recuperación de fluorescencia FRAP pegando los valores de intensidad en una hoja de cálculo de Excel que contenga las fórmulas adecuadas. La recuperación de fluorescencia de la región fotoblanqueada se normaliza a las regiones de fondo e interiores. Para calcular el tiempo medio de la recuperación de fluorescencia, pegue los valores de las curvas de recuperación de fluorescencia con los tiempos correspondientes en SigmaPlot, luego realice un ajuste de curva utilizando la herramienta de aumento exponencial al máximo del asistente de ajuste dinámico, seleccionando la función mono o bi-exponencial según el mejor ajuste de la curva.

Los parámetros obtenidos al resolver la función seleccionada se pueden pegar en una hoja de cálculo de Excel que contiene la fórmula adecuada que permite calcular el tiempo medio de recuperación respectivo en segundos. Para medir la difusión de la actina fotoactivable tras la activación, así como su acumulación dentro de una región específica, como el lamelipodio, utilice MetaMorph para determinar las intensidades a lo largo del tiempo en las regiones respectivas, así como fuera de la célula, con el fin de determinar la fluorescencia de fondo para la normalización. Para examinar la tasa precisa de desplazamiento de la actina fotoactivable lejos de la región de activación, o su tasa de incorporación dentro del lamelipodio, genere curvas de fluorescencia a partir de datos previamente derivados de MetaMorph.

Pegue los valores de intensidad de la región de fondo utilizada para la normalización, la región citosólica fotoactivada o la región lamelipodial que se va a investigar en una hoja de cálculo de Excel que contenga las fórmulas adecuadas. Aquí se muestran imágenes de contraste facial de una célula de fibroblasto NIH 3T3 antes y después de la microinyección de la pequeña GTPasa Rac1. Aproximadamente 12 minutos después de la microinyección, la célula ha cambiado su morfología, lo que indica una inyección exitosa.

Aquí se muestra el reciclaje de EGFP VASP blanqueado por moléculas no blanqueadas en la punta del lamelipodio. En este ejemplo en particular, la fluorescencia de recuperación se estabiliza en aproximadamente el 80% de la fluorescencia antes del blanqueo. Tras la fotoactivación, la actina GFP fotoactivada se difunde rápidamente fuera de la región citosólica.

Una fracción de los monómeros de actina fotoactivados se transloca al frente, creando un rápido estallido de fluorescencia en los lamelipodios. La incorporación de fluorescencia es deliciosamente menor en los lamelipodios distantes de la región fotoactivada a medida que la fracción de monómeros de actina fotoactivados se diluye con monómeros no activados en su viaje a través del citosol. A medida que la actina GFP fotoactivada se difunde lejos de la región fotoactivada con el tiempo, es reemplazada continuamente por actina no fotoactivada y no fluorescente.

Como consecuencia, se observa una disminución gradual de la intensidad de fluorescencia de esta región. Con el tiempo, los lamelópodos cercanos a la región de activación citosólica incorporan rápidamente actina fluorescente. La siguiente caída en la fluorescencia se debe simplemente a la despolimerización de la actina y a la difusión del monómero lejos del laminipodio.

Por lo tanto, cuando los experimentos se realizan en un solo sistema de microscopía, la combinación de técnicas de microinyección y FRAP o fotoactivación se puede realizar de manera realista en cuestión de unos pocos minutos, dependiendo de la naturaleza de las proteínas investigadas. Recuerde siempre mantenerse contento antes, durante y después de la micromanipulación o después de la exposición a la luz láser. En el caso de FRAP y la fotoactivación, es especialmente importante que la región seleccionada mantenga su integridad estructural durante toda la película.

El procedimiento de microinyección puede complementarse con la aplicación local de fármacos permeables a la membrana plasmática o inhibidores del citoesqueleto para abordar las consecuencias inmediatas de los tratamientos administrados a nivel subcelular. Las técnicas de micromanipulación han allanado el camino para explorar las propiedades de difusión y la dinámica subcelular de los componentes y complejos del citoesqueleto y para comprender las vías de segunda mano que regulan la morfogénesis celular. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo rastrear y monitorear la dinámica espacio-temporal de las proteínas citosólicas, de las proteínas incorporadas al acto dentro del citoesqueleto o que residen en diferentes orgánulos subcelulares, lo que en última instancia desentraña la cinética de la regulación celular.