Zuivering van extracellulaire trypanosomen, met inbegrip van Staten in Afrika, van bloed door Anion-wisselaars (Diethylaminoethyl-gemengd met cellulose kolommen)

Afrikaanse trypanosomen zijn verantwoordelijk voor menselijke Afrikaanse trypanosomiasis, of slaapziekte en dierlijke Afrikaanse trypanosomiasis. De trypanosomen die slaapziekte veroorzaken zijn tseetsevlieg overgedragen protist parasieten aanwezig in veel geografische foci in Afrika bezuiden de Sahara. De detectie van de parasiet is essentieel voor de diagnose, behandeling en follow-up.

Een serologie kan geven vals positief en helaas, valse negatieve resultaten. Om detectie in het bloed te helpen, moeten trypanosomen geconcentreerd zijn. Verschillende parasiet concentratie technieken zijn gebruikt.

De meest gevoelige methode is de scheiding van parasieten uit bloed door een kolom van anionwisselaar, DEAE cellulose gevolgd door centrifugatie en microscopische observatie. Bijgevolg is de DEAE cellulose methode de beste en blijft tot op heden, de referentiemethode voor het visualiseren en isoleren van parasieten uit bloed voor menselijke Afrikaanse trypanosomiasis diagnose, vooral in veldomstandigheden. Deze methode, de meest passende diagnose voor Afrikaanse trypanosomiasis biedt ook gezuiverde parasieten voor immunologische, biologische, biochemische, farmaceutische en moleculaire biologische onderzoeken.

Alle onderzoeken in overeenstemming met de gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren en de overeenkomst is verkregen door de Franse autoriteiten en alle gebruikte protocollen zijn goedgekeurd door onze lokale ethische commissie. Weeg elke stof af volgens het geschreven protocol. Voeg gedestilleerd water toe en pas nauwkeurig aan op pH 8 met kaliumdihydrogenfosfaat om de volgende gebufferde oplossingen te maken, geconcentreerde fosfaatbuffer zoutoplossing 2X.

Voeg gedestilleerd water en glucose toe voor fosfaatgebufferde zoutglucose. Voor 100 milliliter elutie buffer, voeg 100 eenheden per milliliter penicilline, 100 microgram per milliliter streptomycine, en vijf microgram milliliter fenol rood aan fosfaat gebufferde zoutgluurglucose. 100 gram DEAE cellulose wordt eerst gewassen met drie liter gedestilleerd water en vervolgens overgelaten om zich te vestigen.

Fijne deeltjes worden weggegooid. De wasbeurten worden herhaald totdat de supernatant duidelijk is. Geconcentreerde fosfaatgebufferde zoutoplossing 2X wordt toegevoegd en de DEAE cellulose wordt geroerd.

De pH wordt aangepast aan acht met één molair kaliumfosfaat. De cellulose wordt vervolgens twee keer gewassen met gedestilleerd water en twee maal met fosfaatgebufferde zoutglucose. De DEAE cellulose en fosfaat gebufferde zoutgluurglucose worden gemengd in gelijke volumes.

Legering gevierendeeld en opgeslagen bij kamertemperatuur of vier graden Celsius of bij min 20 graden Celsius voor langdurige opslag. Trypanosoom besmet bloed wordt opgeslagen in vloeibare stikstof. Een legeringskwart van één milliliter wordt ontdooid bij kamertemperatuur.

Parasieten worden zorgvuldig verzameld uit de cryotube met behulp van een naald en een een milliliter spuit. De levensvatbaarheid van ontdooide parasieten wordt beoordeeld door de beweeglijkheid zoals gevisualiseerd door lichtmicroscopie observatie vóór infectie. Parasieten worden geïnjecteerd in de buikholtes van twee muizen, 500 microliter per muis.

Elke dag na infectie wordt parasitemie beoordeeld door een druppel bloed uit de staart te verzamelen met een naald en gecontroleerd door microscopie. Wanneer de parasiet op een geschikt niveau is, wordt besmet bloed verzameld. Een spuit van 10 milliliter wordt ondersteund in een klem of houder en er wordt een voorgesneden stukje filterpapier toegevoegd.

Bereide DEAE cellulose wordt gegoten in de spuit tot de acht of negen milliliter niveau. De kolom wordt gewassen met de elutiebuffer. Twee milliliter besmet bloed wordt zorgvuldig geplaatst op de top van de kolom en trypanosomen worden verzameld in de kolom eluaat in een 50 milliliter centrifugatie buis.

Elution buffer wordt regelmatig toegevoegd volgens de doorvoer van trypanosomen. De doorvoer van trypanosomen door de kolom wordt gecontroleerd door het nemen van een druppel kolom eluate op regelmatige tijdstippen en observeren voor trypanosomen met behulp van lichte microscopie. Wanneer trypanosomen niet meer worden waargenomen in het eluaat, wordt de conische buis gecentrifugeerd op 1, 800 keer G gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius.

De supernatant wordt weggegooid en trypanosomen in de pallet worden geteld met een hemocytometer. Verzamelde trypanosomen worden vervolgens verdund in het medium dat nodig is voor het geplande onderzoek. Deze methode, de meest passende diagnose voor Afrikaanse trypanosomiasis biedt gezuiverde parasieten voor immunologische, biologische, biochemische, farmaceutische en moleculaire biologische onderzoeken.

Deze studies zijn ontwikkeld omdat DEAE cellulose gezuiverde parasieten gemakkelijk kunnen worden verkregen in grote hoeveelheden van natuurlijk of experimenteel geïnfecteerde gastheren en in het bijzonder knaagdieren. Trypanosoom levensvatbaarheid in aanwezigheid van farmaceutische middelen wordt beoordeeld door microscopische observatie. Parasiet levensvatbaarheid wordt geassocieerd met beweeglijkheid en daarom kan worden gecontroleerd door het oog onder een lichtmicroscoop op 40 keer of hogere vergroting.

De levensvatbaarheid van parasieten wordt beoordeeld door het percentage motilevormen te meten. Verdunningen van testverbindingen worden toegevoegd in elke put van een 96 goed weefsel kweekplaat, terwijl controle putten worden bespot. Elke concentratie wordt beoordeeld in drievoud.

Het aantal levensvatbare parasieten voor elke verdunning wordt vergeleken met het aantal parasieten in controleputten. De effecten van Pentamidine, een referentiemedicijn, gebruikt in menselijke Afrikaanse trypanosomiasis therapie wordt weergegeven in deze figuur. Trypanosoom macrofaag co-culturen maken het onderzoek van gastheer parasiet interactie op cellulair niveau.

In macrofaagparasiet co-culturen, extra cellulaire trypanosomen induceren de productie van macrofaag arginase dat hydrolyginine tot ornithine hydrolyzes. Ornithine is de voorloper van polyamines en trypanothione, essentieel voor het overleven en groeien van parasieten. Bovendien vermindert arginine-uitputting de productie van trypanocidal stikstofmonoxide.

Vervolgens vermindert toevoeging van een arginase-remmer, S-L-cysteïne aan coculturen de macrofaag geïnduceerde parasietgroei drastisch. Arginase inductie wordt bemiddeld door trypanosoom uitgescheiden en of uitgescheiden factoren. Deze arginase inducerende factor is geïdentificeerd als een orthine kinesine.

De kinesine bindt zich aan C-type lectine mannose bindingsreceptoren. Arginase wordt geïnduceerd en produceert ornithine die de groei van parasieten bevordert. Arginase wordt niet veroorzaakt door kinesine in macrofagen gekweekt met 12,5 millimolar mannose of in macrofagen van muizen waar de macrofaag mannose receptoren zijn verwijderd.

Verdere voorbeelden van celbiologie en biochemische experimenten met DAEA cellulose gezuiverde trypanosomen worden aangetoond in studies waar nieuwe cytoskeletale eiwitten zoals BILBO1 is geïdentificeerd. BILBO1 is vereist voor de biogenese van belangrijke cytoskeletale structuren en parasiet overleving. Bilbo1 is dus een belangrijk doel voor interventie in pathogene trypanosomen.

Een beeld dat immunoflourescence het etiketteren van een bloedbaancultuurvorm toont, trypanosoma brucei cel die met een anti-BILBO1 antilichaam wordt onderzocht wordt getoond in dit cijfer. Bovendien, glucose en threonine metabolisme zijn beschreven met behulp van DEAE cellulose gezuiverde trypanosomen en de enzymen die betrokken zijn bij deze processen zijn experimenteel gevalideerd. Een schematische weergave van glucose en threonine metabolisme in de bloedbaan-gevormde trypanosomen wordt weergegeven in deze figuur.

Zuivering van Afrikaanse trypanosomen uit bloed door anionuitwisselingen DEAE cellulosekolommen met recente verbeteringen blijft de gouden standaard voor trypanosoomdetectie, niet alleen bij natuurlijke gastheren met lage parasieten in endemische gebieden, maar ook voor de eis van parasieten in grote aantallen voor experimentele onderzoeken. Onderzoeken hebben het mogelijk toegestaan de identificatie van trypanosoom moleculen spelen essentiële rollen in parasiet overleving en groei. Geïdentificeerde doelen kunnen de basis vormen voor een toekomstig vaccin met potentiële antigenen voor zowel mensen als dieren in een één-gezondheidsbenadering.