Zuivering van Inheemse Complexen voor de structurele studie Met behulp van een Tandem Affinity Tag Method

Het algemene doel van dit protocol is om een natuurlijk macromoleculair complex van geschikte kwaliteit te zuiveren voor biofysische studies. Dit protocol dient niet alleen als een manier om een complex te zuiveren, maar ook als een gedetailleerde gids voor het beoordelen van de structurele kwaliteit van het monster tijdens de zuivering. Het belangrijkste voordeel van dit protocol is dat het iemand toestaat om een natuurlijke samenstelling onder bijna fysiologische bufferomstandigheden eenvoudig en snel te zuiveren, om zo de homogene samenstelling te garanderen.

Na centrifugatie van S.cerevisiae cellen, en het decanteren van het supernatant volgens het tekstprotocol, voegt u twee milliliter gekoelde lysebuffer toe en draait en/of gebruikt een 10 milliliter serologische pipet om de pellet te suspenderen. Breng de celsuspensie over in een lege 50 milliliter conische polypropyleen centrifugeerbuis die op ijs wordt bewaard. Gebruik vervolgens een extra twee milliliter gekoelde lysebuffer om elke centrifugeerfles te wassen en voeg de oplossing toe aan de 50 milliliter buis.

Na het bepalen van het natte gewicht van de celpellet, creëer een vloeibare stikstofbad in en rond een 50 milliliter conische polypropyleen centrifugeerbuis. Trek vervolgens gesuspendeerde cellen in een vijf milliliter spuit en sluit een 16 gauge naald aan op de spuit. Bevriest vervolgens de celsuspensie door het met een snelheid van ongeveer één milliliter per minuut door de spuit en naald in het bad te laten passeren om druppels te genereren.

Om de gistcellen te lyseren, begint u door vloeibare stikstof te gebruiken om een koffiemolen voor te koelen. Voeg vervolgens tot 40 gram gistcellen toe en maal gedurende 25 seconden, herhaal het malen acht of negen keer. Het wordt aanbevolen om niet meer dan 10 liter celcultuur tegelijk te zuiveren.

Dit minimaliseert de zuiveringstijd en zorgt ervoor dat de structurele integriteit van het complex wordt gehandhaafd. Voeg na elke twee rondes malen een ondiepe laag vloeibare stikstof toe aan de molen en laat deze verdampen. Om te voorkomen dat de cellen klonteren, voorkom dat de cellen ontdooien door een met vloeibare stikstof gekoelde spatel te gebruiken om de cellen te roeren.

Na de lyse zouden de cellen eruit moeten zien als een fijn wit poeder. Controleer de cellyse en bereid lysebuffer met PMSF, DTT en proteaseremmers volgens het tekstprotocol. Gebruik vervolgens een met vloeibare stikstof gekoelde spatel om het bevroren geliseerde celpoeder incrementeel in de voorbereide 50 milliliter buizen van de buffer te scheppen. Draai bij elke toegevoegde increment de 50 milliliter buizen bij kamertemperatuur voorzichtig zodat de cellen ontdooien en oplossen en om het vormen van bellen te voorkomen.

Naarmate de cellen oplossen, voegt u meer celpoeder toe. Nadat alle cellen zijn toegevoegd, blijft u de cellen ontdooien en oplossen totdat er geen bevroren celklonters meer in de buizen worden waargenomen. Dit zou ongeveer 50 minuten duren.

Centrifugeer vervolgens het cellysaat bij 25.000 keer g en vier graden Celsius gedurende 20 minuten. Nadat de cellen zijn gelyseerd en na centrifugatie, kunt u een kleine donkere laag in het onoplosbare pellet observeren. Breng het supernatant over naar polycarbonate ultracentrifugebuizen en voeg 10 microliters van 200 millimolair PMSF toe aan elke volle buis.

Centrifugeer de monsters bij 100.000 keer g en vier graden Celsius gedurende een uur. Aan het einde van de spin moeten vier lagen zichtbaar zijn. Een harde heldere pellet die voornamelijk ribosoomcomplexen bevat;een zachte lipiderijke pellet;een grote, heldere, gelig getinte laag die de meeste oplosbare eiwitten en complexen van de cel bevat;en een schilferige toplaag die uit lipiden bestaat.

Gebruik in een koude kamer bij vier graden Celsius een een milliliter pipet om zoveel mogelijk van de bovenste schilferige lipidelaag te verwijderen en weg te gooien. Gebruik een 10 milliliter serologische pipet om het grootste deel van de heldergele laag te herstellen. Gebruik vervolgens een een milliliter pipet om de onderste twee lagen niet te verstoren, en herstel de laatste paar milliliter van deze laag.

Uit 40 gram natte celpellet wordt doorgaans ongeveer 48 milliliter van de middelste laag hersteld. Na het bereiden van IgG sepharose volgens het tekstprotocol, combineert u de IGG-hars met de middelste fase supernatant en twee mini proteaseremmertabletten per 40 gram cellen. Plaats vervolgens op een rotator bij vier graden Celsius gedurende twee uur.

Dit is de IgG-batchoplossing. Bereid twee 10 milliliter polyprep kolommen voor door de uiteinden van de kolommen af te knippen om een platte opening te produceren. Giet de 24 milliliter gesuspendeerde IgG-harsslurry of batchoplossing in elke kolom en laat deze door zwaartekracht sedimenteren.

Dit komt overeen met 200 microliter gepakte IgG-hars. Als sedimentatie langer duurt dan 30 minuten, is de middelste fase mogelijk verontreinigd geraakt door lipiden. Wanneer sedimentatie voltooid is, gebruikt u vier opeenvolgende volumes van 10 milliliter IgG D150-buffer om de gepakte kolom te wassen.

Om tabaksrandenvirus of TEV-proteaseschaving op de kolom uit te voeren, verzegelt u de onderkant van de kolom en voegt u één milliliter IgG D150-buffer en 100 microliters TEV-protease toe. Verzegeld de bovenkant van de kolom en gebruikt een thermische mixer bij 750 RPM en 18 graden Celsius, mengt u gedurende 20 minuten. Herstelt de hars en mengt nogmaals gedurende 20 minuten.

Herstelt vervolgens en herhaalt u de 20 minuten durende menging een derde keer. Brengt de kolom terug naar vier graden Celsius en gebruikt u zwaartekracht om het eiwitcomplex te elueren. Voeg vervolgens 200 microliters IgG D150 toe om het dode volume te elueren.

Na het bereiden van calmoduline-affiniteitshars volgens het tekstprotocol, voegt u de calmoduline-bindingsbuffer en het monster toe aan de hars en gebruikt u een buisrotator om bij vier graden Celsius gedurende een