Zuivering van Inheemse Complexen voor de structurele studie Met behulp van een Tandem Affinity Tag Method

Het algemene doel van dit protocol is het zuiveren van een nat macromoleculair complex van een kwaliteit die geschikt is voor biofysische studies. Dit protocol dient niet alleen als een methode om een complex te zuiveren, maar ook als een gedetailleerde handleiding voor het beoordelen van de structurele kwaliteit van het monster tijdens de zuivering. Het belangrijkste voordeel van dit protocol is dat het in staat stelt om eenvoudig en snel een nat assemblage te zuiveren onder bijna fysiologische buffercondities, om zo compositionele homogeniteit te waarborgen.

Na centrifugatie van S.cerevisiae-cellen en het afgieten van het supernatant volgens het tekstprotocol, worden twee milliliter gekoelde lysisbuffer toegevoegd; draai de buis rond en/of gebruik een serologische pipet van 10 milliliter om het pellet te resuspenderen. Breng de celsuspensie over naar een lege conische centrifugebuis van 50 milliliter van polypropyleen die op ijs is bewaard. Gebruik vervolgens nog eens twee milliliter gekoelde lysisbuffer om elke centrifugebuis uit te spoelen en voeg deze oplossing toe aan de buis van 50 milliliter.

Nadat het natgewicht van het celpellet is bepaald, wordt er een bad van vloeibare stikstof gemaakt in en rondom een conische centrifugebuis van polypropyleen van 50 milliliter. Trek vervolgens de gesuspendeerde cellen op in een spuit van vijf milliliter en bevestig een naald van 16 gauge aan de spuit. Bevries daarna de celsuspensie door deze met een snelheid van ongeveer één milliliter per minuut via de spuit en naald in het bad te brengen om druppeltjes te genereren.

Om de gistcellen te lyseren, begint u met het voor koelen van een koffiemolen met vloeibare stikstof. Voeg vervolgens tot 40 gram gistcellen toe en maal gedurende 25 seconden, waarbij het malen acht of negen keer wordt herhaald. Het wordt aanbevolen om niet meer dan 10 liter celcultuur tegelijkertijd te zuiveren.

Dit minimaliseert de zuiveringstijd en zorgt ervoor dat de structurele integriteit van het complex behouden blijft. Voeg na elke twee ronden malen een dunne laag vloeibare stikstof toe aan de maler en laat deze verdampen. Om te voorkomen dat de cellen gaan klonteren, moet worden voorkomen dat de cellen ontdooien door een met vloeibare stikstof gekoelde spatel te gebruiken om de cellen te roeren.

Na lyse moeten de cellen eruitzien als een fijn wit poeder. Nadat de cellyse is gecontroleerd en de lysebuffer met PMSF, DTT en protease-remmers volgens het tekstprotocol is voorbereid, gebruikt u een met vloeibare stikstof gekoelde spatel om het bevroren gelyseerde celpoeder stapsgewijs in de voorbereide 50 milliliter buisjes met buffer te scheppen. Draai de 50 milliliter buisjes bij elke toevoeging voorzichtig bij kamertemperatuur om de cellen te ontdooien en op te lossen en om te voorkomen dat er bellen ontstaan.

Voeg meer celpoeder toe zodra de cellen oplossen. Nadat alle cellen zijn toegevoegd, gaat u door met het ontdooien en oplossen van de cellen totdat er geen bevroren celklonters meer in de buisjes worden waargenomen. Dit zou ongeveer 50 minuten in beslag nemen.

Centrifuge vervolgens het cellysaat 20 minuten lang bij 25.000 ×g en vier graden Celsius. Zodra de cellen zijn gelyseerd en na centrifugatie, kan er een kleine donkere laag in het onoplosbare pellet waarneembaar zijn. Breng de supernatant over naar polycarbonaat ultracentrifugebuisjes en voeg 10 µL 200 mM PMSF toe aan elk vol buisje.

Centrifugeer de monsters bij 100.000 ×g en vier graden Celsius gedurende één uur. Aan het einde van de centrifugatie zouden vier lagen zichtbaar moeten zijn. Een harde, heldere pellet die voornamelijk ribosomale complexen bevat; een zachte, lipiderijke pellet; een grote, heldere, geelachtige laag die de meeste oplosbare eiwitten en complexen van de cel bevat; en een schilferige bovenlaag bestaande uit lipiden.

Verwijder in een koelruimte bij vier graden Celsius met een pipet van één milliliter zoveel mogelijk van de bovenste schilferige lipidelaag en gooi dit weg. Gebruik een serologische pipet van 10 milliliter om het grootste deel van de heldere gele laag op te vangen. Gebruik vervolgens een pipet van één milliliter om de laatste milliliters van deze laag op te vangen, om te voorkomen dat de onderste twee lagen worden verstoord.

Van 40 gram nat celpellet wordt doorgaans ongeveer 48 milliliter van de middenlaag teruggewonnen. Nadat de IgG-sepharose volgens het tekstprotocol is voorbereid, wordt de IgG-hars gecombineerd met het supernatant van de middenfase en twee mini-proteaseremmertabletten per 40 gram cellen. Plaats dit vervolgens gedurende twee uur op een rotator bij vier graden Celsius.

Dit is de IgG-batchoplossing. Bereid twee polyprep-kolommen van 10 milliliter door de uiteinden van de kolommen af te snijden om een vlakke opening te creëren. Giet de 24 milliliter IgG-hars-suspensie of batchoplossing in elke kolom en laat deze door zwaartekracht bezinken.

Dit komt overeen met 200 µL gepakte IgG-hars. Als de sedimentatie langer dan 30 minuten duurt, kan de middenfase zijn verontreinigd met lipiden. Wanneer de sedimentatie voltooid is, gebruik dan vier opeenvolgende volumes van 10 mL IgG D150-buffer om de gepakte kolom te wassen.

Om de splitsing door tobacco etch virus of TEV-protease op de kolom uit te voeren, wordt de onderkant van de kolom afgesloten en wordt één milliliter IgG D150-buffer en 100 microliters TEV-protease toegevoegd. Sluit de bovenkant van de kolom af en meng gedurende 20 minuten met een thermische menger op 750 RPM en 18 graden Celsius. Resuspendeer de hars en meng opnieuw gedurende 20 minuten.

Resuspendeer vervolgens en herhaal het 20 minuten mengen voor een derde maal. Plaats de kolom terug bij vier graden Celsius en gebruik zwaartekracht om het proteïnecomplex te elueren. Voeg daarna 200 microliters IgG D150 toe om het dode volume te elueren.

Nadat de calmodulin-affiniteithars volgens het tekstprotocol is voorbereid, voegt u de calmodulin-bindbuffer en het monster toe aan de hars en gebruikt u een buisrotator om dit gedurende één uur bij vier graden Celsius te incuberen. Bereid een polyprep-kolom van twee milliliter per 100 microliter calmodulin-suspensie voor door het uiteinde van de kolom af te snijden om een vlakke opening te creëren. Het protocol beschrijft specifieke buffer- en residentievolumes die zijn gekozen om het complex geconcentreerd te houden en de verblijftijd op de hars te minimaliseren.

Indien het cultuurvolume wordt gewijzigd, wordt aanbevolen om de hoeveelheden hars en buffer van de zwaartekrachtkolommen aan te passen om rekening te houden met deze wijziging. Vul de kolom met maximaal 100 µL calmoduline-slurry en gebruik, door middel van zwaartekracht, 5 mL calmoduline-bindingsbuffer om de hars drie keer te wassen. Elueer het eiwit drie keer met 200 µL calmoduline-elutiebuffer.

Sluit vervolgens de onderkant van de kolom af, voeg 20 µL elutiebuffer toe en laat dit 2,5 minuten incuberen voordat de afsluiting wordt verwijderd en het eiwit door zwaartekracht kan elueren. Sluit de onderkant van de kolom opnieuw af en voeg 200 µL elutiebuffer toe voor een incubatie van vijf minuten. Verwijder daarna de afsluiting aan de onderkant van de kolom en elueer de oplossing.

Sluit voor de zesde en laatste elutie de onderkant van de kolom af en incubeer 10 minuten met elutiebuffer. Open daarna de afsluiting en elueer. Voer de analyse na zuivering uit en bewaar de monsters volgens het tekstprotocol.

Zoals hier wordt getoond, leverde een initiële TAP-zuivering van het complex volgens een gepubliceerd protocol een complex op dat als drie banden migreerde op een zilvergekleurde gel. Meerdere optimalisatierondes van de TAP-methode resulteerden in een complex dat als een enkele band migreerde op een native gel, wat duidt op een homogenere assemblage. In overeenstemming met het resultaat van de native gel toonde western blotting, met gebruik van een TAP-antilichaam tegen het complex dat volgens het gepubliceerde protocol was gezuiverd, proteolyse aan van het TAP-getagde eiwit SNU-71.

Modificaties van de TAP-methode verminderden de mate van proteolyse aanzienlijk, aangezien bijna alle 17 eiwitten in het U1 snRNP-complex werden gescheiden door SDS-PAGE en positief werden geïdentificeerd via multi-massaspectrometrie. Negatieve contrast elektronensmicroscopie toont monodisperse deeltjes van een succesvolle zuivering na de eerste en tweede TAP-stappen. In tegenstelling hiermee worden er geen deeltjes van de juiste grootte waargenomen wanneer de zuivering niet succesvol is.

De uiteindelijke kwaliteit van het complex werd beoordeeld op een veld van gezuiverde deeltjes, hier getoond, die monodispers verschijnen in het ruwe EM-beeld met negatieve kleuring. Daarnaast onthullen klassegemiddelden van de deeltjes duidelijke kenmerken die erop wijzen dat het monster mogelijk geschikt is voor structurele analyse. Eenmaal beheerst, kan dit protocol binnen 10 tot 12 uur na het ontdooien van het bevroren gelyseerde celpoeder worden voltooid.

Tijdens het volgen van dit protocol is het belangrijk om ervoor te zorgen dat alle oplossingen vrij zijn van proteasen en nucleasen, en om snel te werken om aggregatie of dissociatie van het complex te voorkomen. Na het bekijken van deze video zou u moeten begrijpen hoe u een natief complex van geschikte kwaliteit voor structurele studie zuivert, en hoe u kunt beoordelen of dit is bereikt.