Análisis de fenotipo esquelético de un modelo de ratón de eliminación condicional de Stat3

Los modelos de ratón modificados genéticamente son herramientas poderosas para estudiar los mecanismos de las enfermedades humanas in vivo. El análisis del fenotipo esquelético de los ratones es la base de la investigación esquelética. Esta partícula describe algunas técnicas típicas para analizar el fenotipo esquelético que pueden ser interesantes para aquellos que son nuevos en la investigación del tejido esquelético.

Cuando intentes esta partícula, ten en cuenta que los experimentos con animales llevan tiempo, así que recoge tantas muestras de alta calidad como sea posible durante cada experimento, incluso si no las necesitas a corto plazo. Comience colocando un ratón sacrificado en posición supina y dislocando suavemente las articulaciones bilaterales de la cadera con la mano. Use tijeras oftálmicas para cortar verticalmente la piel de la tibia distal y luego retire toda la piel de la extremidad posterior.

Cortar el ligamento articular de la articulación de la cadera derecha y la articulación de la rodilla con unas tijeras para separar la extremidad posterior. A continuación, corte el hueso en ambos extremos para sumergirlo completamente en un 4% de PFA. Corta el trocánter y la unión del peroné.

Sumerja la extremidad posterior en PFA al 4%, manteniendo la extremidad trasera derecha para el corte en parafina. Corta los ligamentos articulares de las articulaciones de la cadera izquierda y la rodilla con unas tijeras y retira suavemente el tejido blando. Separe la tibia y el fémur y sumérjalos por separado en etanol al 75%.

Conserve el fémur para la micro tomografía computarizada y las tibias para el doble marcaje de calceína y rojo alizarina. Para preparar las secciones de parafina, lave suavemente la extremidad trasera derecha fija tres veces con PBS durante 10 minutos por lavado. A continuación, descalcificarlo en EDTA al 15% con un descalcificador ultrasónico durante tres o cuatro semanas hasta que los huesos se puedan doblar, sustituyendo el líquido descalcificador cada dos días.

Después de la descalcificación, lave las muestras tres veces con PBS y sumérjalas en etanol al 75% a cuatro grados centígrados durante la noche. El segundo día, sumerja secuencialmente las muestras en etanol al 95%, etanol al 100% y xileno durante una hora cada uno. Sumerja las muestras en mitad xileno y mitad parafina durante 30 minutos, luego en parafina a 65 grados centígrados durante la noche.

Para incrustar el espécimen, sumérjalo en parafina, colocando el fémur y la tibia en un ángulo de 90 grados. Cuando la parafina se haya enfriado por completo, retire las muestras del tanque de inclusión. Numere y guárdelos a menos 20 grados centígrados durante la noche.

Hornee las secciones de parafina a 65 grados centígrados durante 30 minutos, luego desceralas sumergiéndolas en xileno durante 10 minutos. Sumerja las secciones tres veces con xileno fresco cada vez. Rehidratar las secciones sumergiéndolas secuencialmente en etanol al 100%, etanol al 95%, etanol al 70% y agua destilada durante cinco minutos cada una.

Prepare la solución de tinción con el kit de tinción TRAP y caliéntela a 37 grados centígrados. Agregue de 50 a 100 microlitros de solución de tinción a cada sección e incube en una cámara húmeda a 37 grados centígrados durante 20 a 30 minutos. Verifique el estado de tinción de los osteoclastos bajo un microscopio óptico cada cinco minutos hasta que se puedan ver osteoclastos multinucleados rojos.

Luego termine la reacción con agua. Contratiñe las secciones en solución de hematoxilina durante 30 segundos y cree un color azul estable sumergiéndolas en una solución de amoníaco al 1% durante un minuto. Luego enjuáguelos con agua del grifo que corre lentamente.

Monta las secciones con cubreobjetos con bálsamo neutro y sécalas durante la noche. Capture de tres a cinco campos de visión con un microscopio y analice el perímetro trabecular con la imagen J.Utilice la herramienta de línea recta para medir la longitud de la barra de escala como L1. A continuación, utilice la herramienta de línea segmentada para medir la longitud del perímetro trabecular como L2. Calcule la longitud física y cuente el número de células TRAP positivas con más de tres núcleos. Después de la fijación, lave suavemente las tibias tres veces con PBS y sumerja secuencialmente las muestras en etanol al 95%, etanol al 100% y xileno durante cinco minutos cada una.

Sumerge los especímenes en acetona durante 12 horas y mitad acetona y mitad resina durante dos horas, y en resina pura en un horno de secado durante la noche. Agregue resina pura en un tanque de inclusión de gel de sílice adecuado y coloque las muestras en el tanque evitando burbujas. Polimerizar la resina en un horno de secado a 60 grados centígrados durante 48 horas.

Corte las muestras en secciones de cinco micrómetros de espesor de forma continua con un micrótomo rotatorio y almacene el resto de las muestras con desecante a temperatura ambiente. Adherir las secciones con pinzas en una gota de etanol al 75% y montarlas con cubreobjetos utilizando bálsamo neutro. Capture el marcaje de fluorescencia roja y verde con un microscopio de fluorescencia.

Se generaron ratones con deleción de Stat3 específicos de osteoclastos para estudiar la influencia de la deleción de Stat3 en la diferenciación de osteoclastos. La reconstrucción femoral y el análisis cuantitativo mediante micro TC indicaron que la masa ósea de los ratones Stat3 Ctsk aumentó en comparación con los ratones de tipo salvaje. La morfología histológica del fémur de ratones de tipo salvaje y Stat3 Ctsk se examinó mediante tinción H y E.

La actividad osteoclastogénica se detectó mediante tinción TRAP. Los osteoclastos son células grandes TRAP positivas con múltiples núcleos. El número de osteoclastos positivos para TRAP fue menor en los ratones Stat3 Ctsk, en comparación con los ratones de tipo salvaje, lo que indica que la deficiencia de Stat3 alteró la formación de osteoclastos.

La osteogénesis se midió con doble marcaje de calceína y rojo de alizarina. El área entre la calceína y la fluorescencia roja de alizarina representa el hueso recién formado. La deleción de Stat3 en los osteoclastos no influyó en el anabolismo óseo.

Secciones de parafina sagital en las que el cartílago más tarde era simétrico y que mostraban que aquí se utilizaba una línea clara en forma de M. Para los estudios, incluiremos más características del sistema esquelético, como las propiedades mecánicas.