Name: Análisis de fenotipo esquelético de un modelo de ratón de eliminación condicional de Stat3 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-03T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: Aprenda a analizar fenotipos esqueléticos en modelos de ratón transgénicos Stat3 Ctsk mediante tinción TRAP, micro CT y marcaje doble. Este método permite estudiar la diferenciación de osteoclastos y la regulación de la masa ósea in vivo.

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Agradecemos al Prof. Weiguo Zou y A S. Kato por los reactivos y ratones y a los miembros del laboratorio Zou por sus útiles discusiones. También agradecemos al Laboratorio de Estomatología Digitalizada y al Centro de Investigación de Anomalías Craneofaciales del Noveno Hospital Popular de Shanghai por su asistencia. Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (NSFC) [81570950,81870740,81800949], Shanghai Summit &Plateau Disciplines, el fondo SHIPM-mu del Instituto de Medicina de Precisión de Shanghai, el Noveno Hospital Popular de Shanghai, la Facultad de Medicina de la Universidad Jiao Tong de Shanghai [JC201809], el Proyecto de Incentivos del Equipo de Innovación de Alto Nivel para la Facultad de Medicina de la Universidad Jiao Tong de Shanghai , el Fondo de Investigación Interdisciplinaria del Noveno Hospital Popular de Shanghai, Facultad de Medicina de la Universidad JiaoTong de Shanghai [JYJC201902]. Y L.J. es un académico de los Talentos Médicos Juveniles Sobresalientes, el Programa de Desarrollo Juvenil "Rising Stars of Medical Talent" de Shanghai y el proyecto "Chen Xing" de la Universidad Jiaotong de Shanghai.

Todos los métodos relacionados con los animales descritos aquí fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Facultad de Medicina de la Universidad Jiaotong de Shanghai.
1. Cría de ratones de deleción Stat3 específicos de osteoclasto
NOTA: Stat3fl /fl ratones se obtuvieron comercialmente. Los ratones Ctsk-Cre fueron proporcionados por S. Kato (Universidad de Tokio, Tokio, Japón12). Los ratones fueron criados y mantenidos bajo condiciones libres de patógenos específicos (SPF) en la instalación animal institucional bajo condiciones estandarizadas.
<ol><li>Emparejar un ratón macho sexualmente maduro con dos ratones hembra de la misma edad. Después de 18 días, revise los controles diarios de recién nacidos. Separe las hembras preñadas y manténgala sola si es necesario. Cambie los ratones machos entre diferentes jaulas de cría si los ratones hembra no estaban preñados dentro de 1 mes del emparejamiento.</li>
	<li>Cruza ratonesfl/fl Stat3a ratones Ctsk-Cre (F0). Recorte las colas para el genotipado y mantenga el macho Stat3fl /+; Ratones Ctsk-Cre hasta que son sexualmente maduros, que es alrededor de 6 semanas de edad (F1). Utilice los siguientes cebadores: Stat3 F-TTGACCTGTGCTCCTACAAAAA; Stat3 R-CCCTAGATTAGGCCAGCACA; Ctsk-cre F-GAACGCACTGATTTCGACCA; Ctsk-cre R-GCTAACCAGCGTTTTCGTTC.</li>
	<li>Cruz 6-semana de edad macho Stat3fl /+; Ratones Ctsk-Cre con hembras de ratones Stat3fl/fl. Recorte las colas para el genotipado y mantenga el macho Stat3 fl / fl; Ratones Ctsk-Cre hasta que son sexualmente maduros, que es alrededor de 6 semanas de edad (F2).</li>
	<li>Cruz 6-semana de edad macho Stat3 fl/fl; Ratones Ctsk-Cre con ratones hembras Stat3fl/fl (F3). Recorte las colas para el genotipado y reemplace los ratones reproductores viejos con ratones más jóvenes a tiempo (F3 + N).</li>
</ol>2. Recolección de especímenes
<ol><li>Eutanasia seis pares de ratones machos de 8 semanas de edad Stat3fl/fl y Stat3Ctsk littermate por separado con asfixia de dióxido de carbono. NOTA: El caudal de CO2 desplaza el 30% del volumen de la jaula por minuto (por ejemplo, para una jaula de 45 cm x 30 cm x 30 cm, la tasa de flujo de CO2 es de 40 L/min).</li>
	<li>Coloque los ratones en decúbito supino. Dislocar las articulaciones bilaterales de la cadera suavemente con la mano. Use tijeras oftálmicas para cortar la piel verticalmente de la tibia distal y luego diseccione toda la piel de la extremidad posterior.</li>
	<li>Corte el ligamento articular de la articulación de la cadera derecha y la articulación de la rodilla con tijeras para separar la extremidad posterior. Corte el trocánter y la unión del peroné y luego sumerja el miembro posterior en paraformadehído al 4%. Mantenga las extremidades posteriores derechas para el paso 3. Corte adecuadamente el hueso en ambos extremos para sumergir completamente y fijar la médula ósea con paraformadehído al 4%.</li>
	<li>Corte el ligamento articular de la articulación izquierda de la cadera y la articulación de la rodilla con tijeras, retire suavemente el tejido blando y separe cuidadosamente la tibia y el fémur. Sumergir la tibia y el fémur por separado en etanol al 75%. Mantenga los fémures para el paso 4 y las tibias para el paso 6. Asegúrese de mantener el trocánter intacto.</li>
</ol>3. Preparación de la sección de parafina
<ol><li>Fijar el miembro posterior derecho en paraformadehído al 4% a 4 °C durante 48 h.</li>
	<li>Descalcificar: Lavar suavemente las muestras con 1x PBS durante 10 min 3 veces. Descalcificar las muestras en EDTA al 15% (150 g EDTA en 800 mL de ddH2O y 100 mL de PBS 10x) con un descalcificador ultrasónico durante 3 a 4 semanas hasta que los huesos puedan ser doblados. Reemplácelo con líquido descalcificante fresco cada dos días.</li>
	<li>Lave suavemente las muestras 3x con 1x PBS y luego sumérjalas en etanol al 75% a 4 °C durante la noche.</li>
	<li>Deshidratar: En el segundo día, sumergir secuencialmente las muestras en etanol al 95%, etanol al 100% y xileno, cada una durante 1 h dos veces.</li>
	<li>Sumergir los especímenes en 1/2 xileno 1/2 parafina durante 30 min. Sumergir los ejemplares en parafina a 65 °C durante la noche.</li>
	<li>Incrustar: Seleccione un tanque de incrustación adecuado para la incrustación. Coloque la tibia uniformemente debajo. Coloque el fémur y la tibia en un ángulo de 90°. Después de que la parafina se haya enfriado y solidificado por completo, retírela del tanque de incrustación. Numerar los especímenes y almacenarlos a -20 °C durante la noche.</li>
	<li>Cortar secciones de 5 μm de espesor continuamente usando el microtomo. Corte de 20 a 40 secciones. Extienda las secciones en agua de 37 °C, adhiérelas a los portaobjetos del microscopio y hornee a 42 °C durante la noche.</li>
</ol>4. Exploración y análisis de micro-TC
<ol><li>Escanee los fémures izquierdos con un escáner micro-CT. Resolución: 10 μm; Voltaje: 70 kV; Corriente: 114 μA; Fliter: 0.5 mm Al; Paso de rotación: 0.5°.</li>
	<li>Reconstruya imágenes 3D del hueso cortical y del hueso trabecular utilizando el software de soporte del escáner siguiendo las instrucciones del fabricante. Los ROIs están en un ancho total de 1 mm de hueso trabecular cerca de la placa de crecimiento distal y en una sección total de 1 mm de ancho de hueso cortical en el centro de los fémures.</li>
	<li>Calcule los parámetros cuantitativos de la microarquitectura: densidad mineral ósea (DMO), fracción de volumen óseo (BV/TV), espesor trabecular (Tb.Th.), número trabecular (Tb.N.), separación trabecular (Tb.Sp.) y grosor óseo cortical (Ct.Th.).</li>
</ol>5. Tinción trap
<ol><li>Hornear las secciones de parafina a 65 °C durante 30 min.</li>
	<li>Dewax: Sumergir las secciones en xileno durante 10 min. Realice este paso 3x con xileno fresco.</li>
	<li>Rehidratar: Sumergir las secciones secuencialmente en etanol al 100%, etanol al 95%, etanol al 70% y ddH2O, cada una durante 5 min dos veces.</li>
	<li>Prepare la solución de tinción utilizando el kit de tinción TRAP siguiendo las instrucciones del fabricante y caliente a 37 °C. NOTA: La solución de tinción trap debe prepararse recientemente inmediatamente antes de cada ensayo.</li>
	<li>Añadir una solución de tinción de 50–100 μL a cada muestra e incubar en una cámara húmeda de 37 °C durante 20–30 min. Compruebe el estado de tinción de los osteoclastos bajo un microscopio de luz cada 5 minutos hasta que se puedan ver osteoclastos multinucleados rojos. Finalizar la reacción con ddH2O.</li>
	<li>Contratendía en solución de hematoxilina durante 30 s. Crear un color azul estable por inmersión en 1% solución de amoníaco durante 1 min. Enjuague en agua del grifo que corre lentamente.</li>
	<li>Monte las secciones con cubrebocas usando bálsamo neutro y seco durante la noche.</li>
	<li>Captura de 3 a 5 campos de interés mediante un microscopio. Analice el perímetro trabecular por la Imagen J: mida la longitud de la barra de escala (Ls) usando la herramienta 'línea recta' como L1, luego mida la longitud del perímetro trabecular usando la herramienta 'línea segmentada' como L2, la longitud física (Lp)= Ls*L2 /L1). Cuente el número de células TRAP-positivas con más de tres núcleos.</li>
</ol>6. Calein y alizarin rojo doble etiquetado
<ol><li>Preparación de la muestra: Inyecte por vía intraperitoneal 20 mg/kg de caleína (1 mg/mL en solución de NaHCO3 al 2%) el día 0, y 25 mg/kg de alizarina roja S (AL, 2 mg/mL en H2O) el día 4. Sacrificar ratones el día 7. Desasocie cuidadosamente las tibias y fije en paraformadehído al 4% a 4 °C durante 48 h.</li>
	<li>Deshidratar: Después de la fijación, lavar suavemente las tibias 3x con 1x PBS. Sumergir secuencialmente las muestras en etanol al 95%, etanol al 100% y xileno durante 5 min dos veces por separado.</li>
	<li>Sumergir las muestras en acetona durante 12 h, en 1/2 acetona 1/2 resina durante 2 h, y en resina pura en un horno de secado durante la noche. NOTA: La resina fue preparada por resina disponible comercialmente (por ejemplo, Embed 812 Resin) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.</li>
	<li>Incrustar: Agregue resina pura en un tanque de incrustación de gel de sílice adecuado y coloque las muestras suavemente para evitar burbujas. Polimerizar la resina en un horno de secado a 60 °C durante 48 h.</li>
	<li>Corte las muestras en secciones de 5 μm de espesor continuamente con un microtomo rotatorio. Guarde el resto de las muestras con desecante a temperatura ambiente.</li>
	<li>Adherir las secciones con pinzas en una gota de 75% de alcohol. Monte las secciones con cubrebocas usando bálsamo neutro. Capture el etiquetado de fluorescencia rojo y verde con un microscopio de fluorescencia.</li>
	<li>Mida el ancho entre dos líneas de etiquetado (Ir.L.Wi), perímetro trabecular de etiqueta simple (sL.Pm), perímetro trabecular de doble etiqueta (dL.Pm) y perímetro trabecular total (Tb.Pm). Calcular la tasa de aposición mineral (MAR) y la tasa de formación ósea (BFR/BS). MAR = Ir.L.Wi/días de intervalo. BFR/BS= (dL.Pm±sL.Pm/2)*MAR/Tb.Pm*100 %.</li>
</ol>

<ol><li>Zaidi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+remodeling+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Skeletal remodeling in health and disease.</a> Nature Medicine. 13 (7), 791-801 (2007).</li>
<li>Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoclast+differentiation+and+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Osteoclast differentiation and activation.</a> Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).</li>
<li>Cummings, S. R., Melton, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+and+outcomes+of+osteoporotic+fractures%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Epidemiology and outcomes of osteoporotic fractures.</a> Lancet. 359 (9319), 1761-1767 (2002).</li>
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<li>Yu, H., Lee, H., Herrmann, A., Buettner, R., Jove, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+STAT3+signalling+in+cancer%3A+new+and+unexpected+biological+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Revisiting STAT3 signalling in cancer: new and unexpected biological functions.</a> Nature Reviews Cancer. 14 (11), 736-746 (2014).</li>
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<li>Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoblast%2Fosteocyte-specific+inactivation+of+Stat3+decreases+load-driven+bone+formation+and+accumulates+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Osteoblast/osteocyte-specific inactivation of Stat3 decreases load-driven bone formation and accumulates reactive oxygen species.</a> Bone. 49 (3), 404-411 (2011).</li>
<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAT3+controls+osteoclast+differentiation+and+bone+homeostasis+by+regulating+NFATc1+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">STAT3 controls osteoclast differentiation and bone homeostasis by regulating NFATc1 transcription.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (42), 15395-15407 (2019).</li>
<li>Nakamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+prevents+bone+loss+via+estrogen+receptor+alpha+and+induction+of+Fas+ligand+in+osteoclasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Estrogen prevents bone loss via estrogen receptor alpha and induction of Fas ligand in osteoclasts.</a> Cell. 130 (5), 811-823 (2007).</li>
<li>Kim, H., Kim, M., Im, S. K., Fang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Cre-LoxP+system%3A+general+principles+to+determine+tissue-specific+roles+of+target+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+animal+research%22%5BJournal%5D)">Mouse Cre-LoxP system: general principles to determine tissue-specific roles of target genes.</a> Laboratory animal research. 34 (4), 147-159 (2018).</li>
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<li>Vaaraniemi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+machinery+for+matrix+degradation+in+bone-resorbing+osteoclasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Intracellular machinery for matrix degradation in bone-resorbing osteoclasts.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 19 (9), 1432-1440 (2004).</li>
<li>Ljusberg, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteolytic+excision+of+a+repressive+loop+domain+in+tartrate-resistant+acid+phosphatase+by+cathepsin+K+in+osteoclasts%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Proteolytic excision of a repressive loop domain in tartrate-resistant acid phosphatase by cathepsin K in osteoclasts.</a> The Journal of Biological Chemistry. 280 (31), 28370-28381 (2005).</li>
<li>Janckila, A. J., Takahashi, K., Sun, S. Z., Yam, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naphthol-ASBI+phosphate+as+a+preferred+substrate+for+tartrate-resistant+acid+phosphatase+isoform+5b%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Naphthol-ASBI phosphate as a preferred substrate for tartrate-resistant acid phosphatase isoform 5b.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 16 (4), 788-793 (2001).</li>
<li>Janckila, A. J., Li, C. Y., Lam, K. W., Yam, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cytochemistry+of+tartrate-resistant+acid+phosphatase.+Technical+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Clinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">The cytochemistry of tartrate-resistant acid phosphatase. Technical considerations.</a> American Journal of Clinical Pathology. 70 (1), 45-55 (1978).</li>
<li>Janckila, A. J., Simons, R. M., Yam, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+immunoassay+for+tartrate-resistant+acid+phosphatase+isoform+5b+using+the+fluorogenic+substrate+naphthol+ASBI-phosphate+and+heparin%5BTitle%5D)+AND+%22Clinica+Chimica+Acta%3A+International+Journal+of+Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Alternative immunoassay for tartrate-resistant acid phosphatase isoform 5b using the fluorogenic substrate naphthol ASBI-phosphate and heparin.</a> Clinica Chimica Acta: International Journal of Clinical Chemistry. 347 (1-2), 157-167 (2004).</li>
<li>Janckila, A. J., Yam, L. T., Li, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoalkaline+phosphatase+cytochemistry.+Technical+considerations+of+endogenous+phosphatase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Clinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">Immunoalkaline phosphatase cytochemistry. Technical considerations of endogenous phosphatase activity.</a> American Journal of Clinical Pathology. 84 (4), 476-480 (1985).</li>
<li>Solberg, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+tartrate-resistant+Acid+phosphatase+expression+in+osteoblasts+and+osteocytes+in+experimental+osteoporosis+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Calcified+Tissue+International%22%5BJournal%5D)">Increased tartrate-resistant Acid phosphatase expression in osteoblasts and osteocytes in experimental osteoporosis in rats.</a> Calcified Tissue International. 94 (5), 510-521 (2014).</li>
<li>Tambutté, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcein+labelling+and+electrophysiology%3A+insights+on+coral+tissue+permeability+and+calcification%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings.+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Calcein labelling and electrophysiology: insights on coral tissue permeability and calcification.</a> Proceedings. Biological Sciences. 279 (1726), 19-27 (2012).</li>
<li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lkb1+deletion+in+periosteal+mesenchymal+progenitors+induces+osteogenic+tumors+through+mTORC1+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Lkb1 deletion in periosteal mesenchymal progenitors induces osteogenic tumors through mTORC1 activation.</a> Journal of Clinical Investigation. 130 (5), 1895-1909 (2019).</li>
<li>Dai, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTOR%2FRaptor+signaling+is+critical+for+skeletogenesis+in+mice+through+the+regulation+of+Runx2+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">mTOR/Raptor signaling is critical for skeletogenesis in mice through the regulation of Runx2 expression.</a> Cell Death and Differentiation. 24 (11), 1886-1899 (2017).</li>
<li>Sun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+demethylase+LSD1+regulates+bone+mass+by+controlling+WNT7B+and+BMP2+signaling+in+osteoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Research%22%5BJournal%5D)">Histone demethylase LSD1 regulates bone mass by controlling WNT7B and BMP2 signaling in osteoblasts.</a> Bone Research. 6, 14(2018).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Los modelos de ratón genéticamente modificados se utilizan comúnmente para estudiar el mecanismo y el tratamiento farmacéutico de las enfermedades humanas13. Los ratones Ctsk-Cre han sido ampliamente utilizados para estudios funcionales de osteoclastos6. El actual estudio describió los protocolos de los métodos para analizar fenotipo esquelético y para estudiar los genes críticos que controlaban actividad osteoclasta in vivo.
El análisis...

El hueso esquelético es el principal órgano de carga del cuerpo humano y está bajo la presión del entorno interno y externo durante la marcha y el ejercicio1. A lo largo de la vida, los huesos pasan continuamente por la auto-renovación, que es equilibrada por osteoblastos y osteoclastos. El proceso de los osteoclastos que limpian los huesos viejos y los osteoblastos que forman el hueso nuevo mantiene la homeostasis y la función mecánica del sistema esquelético2. La alteración en el equilibrio puede inducir enfermedades metabólicas óseas, como la osteoporosis. La osteoporosis, que es causada por el exceso de actividad osteoclástica, es prevalente a nivel mundial y causa pérdidas económicas sustanciales a la sociedad2,3,4. De acuerdo con el número limitado de fármacos disponibles para el tratamiento de la osteoporosis y su riesgo de efectos adversos4,es importante desvelar los detalles de la formación y actividad de los osteoclastos.
Los osteoclastos derivados del linaje hematopoyético monocitos/macrófagos tienen múltiples núcleos (pueden tener de 2 a 50 núcleos) y son grandes (generalmente mayores de 100 μm de diámetro)2. Aunque la exploración de mecanismos y la investigación de las drogas para los desordenes osteoclastic se hayan mejorado extensamente vía cultura osteoclasta in vitro, las reacciones orgánicas complicadas hacen in vivo la evidencia indispensable para la terapia apuntada. Debido a las similitudes genéticas y fisiopatológicas entre ratones y humanos, los modelos de ratón genéticamente modificados se utilizan comúnmente para estudiar los mecanismos y los tratamientos farmacéuticos de las enfermedades humanas in vivo6. El sistema Cre-loxP es una tecnología ampliamente utilizada para la edición de genes de ratón y ha permitido a los investigadores investigar las funciones de los genes de una manera específica de tejidos/células5. La catepsina K (CSTK) es una cisteína proteasa secretada por osteoclastos que puede degradar el colágenoóseo 8. Está bien aceptado que CTSK se expresa selectivamente en osteoclastos maduros; por lo tanto, los ratones Ctsk-Cre son considerados como una herramienta útil para estudios funcionales de osteoclastos y se ha utilizado6.
La familia del transductor de señales y activador de la transcripción (STAT) es clásica y altamente significativa en la inmunidad y en la progresión y desarrollo del cáncer7,8. Entre siete ESTAT, STAT3 se divulga para ser el más relevante al homeostasis del hueso9,10. Varios estudios in vivo han reportado que la inactivación específica de STAT3 en osteoblastos disminuye la formaciónósea 9,10. Sin embargo, la evidencia sólida con respecto a la participación de STAT3 en la formación de osteoclastos y el metabolismo óseo in vivo todavía es limitada. Recientemente, proporcionamos evidencia in vivo con un modelo de ratón de deleción Stat3 osteoclasta específico(Stat3fl / fl; Ctsk-Cre, en adelante llamado Stat3Ctsk) que STAT3 participa en la diferenciación osteoclasta y metabolismo óseo11. En el presente estudio, describimos los métodos y protocolos que utilizamos para analizar los cambios en la masa ósea, la histomorfología ósea y el anabolismo óseo y el catabolismo de los ratones Stat3Ctsk con el fin de estudiar la influencia de la deleción osteoclasta-específica de STAT3 en la homeostasis ósea.

<table><tbody><tr><td>Solución de paraformaldehído al 4%</td><td>Sangon biotech Co., Ltd.</td><td></td><td></td>E672002</tr><tr><td>Acetona</td><td>Shanghai Reactivo Experimental Co., Ltd.</td><td></td><td></td>80000360</tr><tr><td>Alizarina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5533</td><td></td></tr><tr><td>Solución de amoníaco</td><td>Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calceína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0875</td><td></td></tr><tr><td>Ctsk-Cre ratones</td><td></td><td></td><td>un regalo de S. Kato, Universidad de Tokio, Tokio, Japón Ciencias de</td></tr><tr><td>Microscopía Electrónica</td><td>DDSA</td><td>13710</td><td></td></tr><tr><td>DeCa RapidlyDescalcificador</td><td>Pro-Cure</td><td>DX1100</td><td></td></tr><tr><td>DMP-30</td><td>Ciencias de Microscopía Electrónica</td><td>13600</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Shanghai Reactivo Experimental Co., Ltd.</td><td>60-00-4</td><td></td></tr><tr><td>EMBED 812 RESINA</td><td>Microscopía electrónica Sciences</td><td>14900</td><td></td></tr><tr><td>microscopio de fluorescencia</td><td>Olympus</td><td>IX73</td><td></td></tr><tr><td>Solución de hematoxilina</td><td>Beyotime Biotechanology</td><td>C0107</td><td></td></tr><tr><td>Micro-CT</td><td>Scanco Medical AG</td><td>&mu; CT 80</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Shanghai Reactivo experimental Co., Ltd.</td><td></td><td></td>10018918</tr><tr><td>Bálsamo neutro</td><td>Sangon biotech Co., Ltd.</td><td></td><td></td>E675007</tr><tr><td>NMA</td><td>Ciencias de Microscopía Electrónica</td><td>19000</td><td></td></tr><tr><td>Parafina</td><td>Sangon biotech Co., Ltd.</td><td></td><td></td>A601889</tr><tr><td>micrótomo rotatorio</td><td>Leica</td><td>RM2265</td><td></td></tr><tr><td>Stat3fl/fl</td><td>ratones GemPharmatech Co., Ltd</td><td>D000527</td><td></td></tr><tr><td>TRAP kit de tinción</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>387A</td><td></td></tr><tr><td>xileno</td><td>Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd.</td><td>1330-20-7</td><td></td></tr></tbody></table>

análisis de fenotipo esquelético de un modelo de ratón de eliminación condicional de stat3

Skeletal Phenotype Analysis of a Conditional Stat3 Deletion Mouse Model

Los modelos transgénicos del ratón son potentes para entender los genes críticos que controlan la diferenciación y la actividad del osteoclast, y para estudiar mecanismos y tratamientos farmacéuticos de la osteoporosis. Los ratones de catepsina K (Ctsk)-Cre han sido ampliamente utilizados para estudios funcionales de osteoclastos. El transductor de señales y activador de la transcripción 3 (STAT3) es relevante en la homeostasis ósea, pero su papel en los osteoclastos in vivo sigue estando mal definido. Para proporcionar la evidencia in vivo de que STAT3 participa en la diferenciación de osteoclastos y el metabolismo óseo, se generó un modelo de ratón de deleción Stat3 osteoclasta específico(Stat3 fl / fl; Ctsk-Cre) y analizó su fenotipo esquelético. La exploración de Micro-CT y la reconstrucción 3D implicaron la masa creciente del hueso en los ratones condicionales del golpe de gracia. La coloración de H&E, la coloración doble roja de la caleína y del alizarin, y la coloración ácida tartrato-resistente de la fosfatasa (TRAMPA) fueron realizadas para detectar metabolismo del hueso. En definitiva, este protocolo describe algunos métodos y técnicas canónicas para analizar el fenotipo esquelético y estudiar los genes críticos que controlan la actividad osteoclasta in vivo.

Usando el actual protocolo, los ratones específicos osteoclast de la canceladura Stat3 fueron generados para estudiar la influencia de la canceladura STAT3 en la diferenciación osteoclasta. Los ratones Stat3Ctsk y sus compañeros de camada de tipo salvaje (WT) fueron criados y mantenidos después del genotipado. Los macrófagos de médula ósea se aislaron y cultivaron en osteoclastos, y se demostró la deleción de STAT3en ratones Stat3Ctsk <strong class="xfig"...

Este protocolo describe un método canónico para entender los genes críticos que controlan la actividad osteoclasta in vivo. Este método utiliza un modelo de ratón transgénico y algunas técnicas canónicas para analizar el fenotipo esquelético.

Análisis de fenotipo esquelético de un modelo de ratón de eliminación condicional de Stat3

Transgenic mouse models are powerful for understanding the critical genes controlling osteoclast differentiation and activity, and for studying mechanisms ...

Los modelos de ratón modificados genéticamente son herramientas poderosas para estudiar los mecanismos de las enfermedades humanas in vivo. El análisis del fenotipo esquelético de los ratones es la base de la investigación esquelética. Esta partícula describe algunas técnicas típicas para analizar el fenotipo esquelético que pueden ser interesantes para aquellos que son nuevos en la investigación del tejido esquelético.Cuando intentes esta partícula, ten en cuenta que los experimentos con animales llevan tiempo, así que recoge tantas muestras de alta calidad como sea posible durante cada experimento, incluso si no las necesitas a corto plazo. Comience colocando un ratón sacrificado en posición supina y dislocando suavemente las articulaciones bilaterales de la cadera con la mano. Use tijeras oftálmicas para cortar verticalmente la piel de la tibia distal y luego retire toda la piel de la extremidad posterior.Cortar el ligamento articular de la articulación de la cadera derecha y la articulación de la rodilla con unas tijeras para separar la extremidad posterior. A continuación, corte el hueso en ambos extremos para sumergirlo completamente en un 4% de PFA. Corta el trocánter y la unión del peroné.Sumerja la extremidad posterior en PFA al 4%, manteniendo la extremidad trasera derecha para el corte en parafina. Corta los ligamentos articulares de las articulaciones de la cadera izquierda y la rodilla con unas tijeras y retira suavemente el tejido blando. Separe la tibia y el fémur y sumérjalos por separado en etanol al 75%.Conserve el fémur para la micro tomografía computarizada y las tibias para el doble marcaje de calceína y rojo alizarina. Para preparar las secciones de parafina, lave suavemente la extremidad trasera derecha fija tres veces con PBS durante 10 minutos por lavado. A continuación, descalcificarlo en EDTA al 15% con un descalcificador ultrasónico durante tres o cuatro semanas hasta que los huesos se puedan doblar, sustituyendo el líquido descalcificador cada dos días.Después de la descalcificación, lave las muestras tres veces con PBS y sumérjalas en etanol al 75% a cuatro grados centígrados durante la noche. El segundo día, sumerja secuencialmente las muestras en etanol al 95%, etanol al 100% y xileno durante una hora cada uno. Sumerja las muestras en mitad xileno y mitad parafina durante 30 minutos, luego en parafina a 65 grados centígrados durante la noche.Para incrustar el espécimen, sumérjalo en parafina, colocando el fémur y la tibia en un ángulo de 90 grados. Cuando la parafina se haya enfriado por completo, retire las muestras del tanque de inclusión. Numere y guárdelos a menos 20 grados centígrados durante la noche.Hornee las secciones de parafina a 65 grados centígrados durante 30 minutos, luego desceralas sumergiéndolas en xileno durante 10 minutos. Sumerja las secciones tres veces con xileno fresco cada vez. Rehidratar las secciones sumergiéndolas secuencialmente en etanol al 100%, etanol al 95%, etanol al 70% y agua destilada durante cinco minutos cada una.Prepare la solución de tinción con el kit de tinción TRAP y caliéntela a 37 grados centígrados. Agregue de 50 a 100 microlitros de solución de tinción a cada sección e incube en una cámara húmeda a 37 grados centígrados durante 20 a 30 minutos. Verifique el estado de tinción de los osteoclastos bajo un microscopio óptico cada cinco minutos hasta que se puedan ver osteoclastos multinucleados rojos.Luego termine la reacción con agua. Contratiñe las secciones en solución de hematoxilina durante 30 segundos y cree un color azul estable sumergiéndolas en una solución de amoníaco al 1% durante un minuto. Luego enjuáguelos con agua del grifo que corre lentamente.Monta las secciones con cubreobjetos con bálsamo neutro y sécalas durante la noche. Capture de tres a cinco campos de visión con un microscopio y analice el perímetro trabecular con la imagen J.Utilice la herramienta de línea recta para medir la longitud de la barra de escala como L1. A continuación, utilice la herramienta de línea segmentada para medir la longitud del perímetro trabecular como L2. Calcule la longitud física y cuente el número de células TRAP positivas con más de tres núcleos. Después de la fijación, lave suavemente las tibias tres veces con PBS y sumerja secuencialmente las muestras en etanol al 95%, etanol al 100% y xileno durante cinco minutos cada una.Sumerge los especímenes en acetona durante 12 horas y mitad acetona y mitad resina durante dos horas, y en resina pura en un horno de secado durante la noche. Agregue resina pura en un tanque de inclusión de gel de sílice adecuado y coloque las muestras en el tanque evitando burbujas. Polimerizar la resina en un horno de secado a 60 grados centígrados durante 48 horas.Corte las muestras en secciones de cinco micrómetros de espesor de forma continua con un micrótomo rotatorio y almacene el resto de las muestras con desecante a temperatura ambiente. Adherir las secciones con pinzas en una gota de etanol al 75% y montarlas con cubreobjetos utilizando bálsamo neutro. Capture el marcaje de fluorescencia roja y verde con un microscopio de fluorescencia.Se generaron ratones con deleción de Stat3 específicos de osteoclastos para estudiar la influencia de la deleción de Stat3 en la diferenciación de osteoclastos. La reconstrucción femoral y el análisis cuantitativo mediante micro TC indicaron que la masa ósea de los ratones Stat3 Ctsk aumentó en comparación con los ratones de tipo salvaje. La morfología histológica del fémur de ratones de tipo salvaje y Stat3 Ctsk se examinó mediante tinción H y E.La actividad osteoclastogénica se detectó mediante tinción TRAP. Los osteoclastos son células grandes TRAP positivas con múltiples núcleos. El número de osteoclastos positivos para TRAP fue menor en los ratones Stat3 Ctsk, en comparación con los ratones de tipo salvaje, lo que indica que la deficiencia de Stat3 alteró la formación de osteoclastos.La osteogénesis se midió con doble marcaje de calceína y rojo de alizarina. El área entre la calceína y la fluorescencia roja de alizarina representa el hueso recién formado. La deleción de Stat3 en los osteoclastos no influyó en el anabolismo óseo.Secciones de parafina sagital en las que el cartílago más tarde era simétrico y que mostraban que aquí se utilizaba una línea clara en forma de M. Para los estudios, incluiremos más características del sistema esquelético, como las propiedades mecánicas.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

A continuación, presentamos un enfoque sistemático para desarrollar fisiológicamente relevante, sensible y...

En Vivo Modelado del Genoma Humano Morbid usando Danio rerio

Los niveles de actividad en campo abierto se utilizan para evaluar los niveles de actividad locomotora y de comportamiento. Este protocolo proporciona un bien diseñado, protocolo estandarizado para su uso en ensayos preclínicos de trastornos neuromusculares.

Las mediciones del comportamiento y del aparato locomotor utilizando un sistema de supervisión de la actividad de campo abierto para las Enfermedades del músculo esquelético

La validación experimental de la actividad potenciadora se aborda mejor mediante el análisis de pérdida de función. Aquí se presenta un protocolo eficiente que utiliza la deleción mediada por CRISPR/Cas9 para estudiar la regulación específica de alelos de la transcripción génica en células ES F1 que contienen un genoma híbrido (Mus musculus129 x Mus castaneus).

La generación de CRISPR / Cas9 mediada monoallelic deleciones para estudiar la función del reforzador en las células madre embrionarias de ratón

Las proteínas a menudo contienen varios dominios que pueden ejercer diferentes funciones celulares. Genes knock-out (KO) no tienen en cuenta esta diversidad funcional. Aquí, se presenta un enfoque basado en la estructura-función de intercambio de casete de recombinación mediada (RMCE) en células madre embrionarias de KO que permite la disección molecular de varios dominios funcionales o variantes de una proteína.

Los estudios de estructura-función en las células madre embrionarias de ratón Usando mediada por recombinasa Cambio de Cassette

El objetivo de este protocolo es modificar la penetrancia de fenotipos mutantes esqueléticos letal en el pez cebra por cría selectiva. Mutantes letales no pueden cultivarse a la edad adulta y crían ellos mismos, por lo tanto este protocolo describe un método de seguimiento y selección de penetración a través de múltiples generaciones por prueba de progenie.

Cambio de penetrancia mutante esquelética letal de pez cebra por prueba de progenie

Aquí, presentamos un protocolo detallado para detectar y cuantificar los niveles de proteínas durante la morfogénesis/patogénesis craneofacial mediante inmunoutilización utilizando tejidos craneofaciales de ratón como ejemplos. Además, describimos un método para la preparación y criosección de tejidos duros no descalcificados de ratones jóvenes para inmunostaining.

Preparación de tejidos e inmunomanchación de tejidos craneofaciales de ratón y hueso no descalcificado

El análisis de huellas es una alternativa de bajo costo a los programas de análisis de marcha digitalizados para investigadores que cuantifican las anomalías del movimiento en ratones. Debido a su velocidad, simplicidad y potencial longitudinal, es ideal para la fenotipado conductual de modelos de ratón.

Análisis de la gait de bajo costo para el fenotipado conductual de modelos de ratón de enfermedad neuromuscular

Aquí, proponemos un método para obtener eficientemente fibras musculares individuales en etapas de desarrollo postnatal tempranas a partir del modelo de ratón lamin 8-11 mutante homocigoto, un modelo muy severo para la distrofia muscular de Emery-Dreifuss (EDMD).

Aislamiento de miofiber único y cultura de un modelo murino de distrofia muscular de Emery-Dreifuss en el desarrollo post-Natal temprano

Aquí, describimos herramientas y métodos computacionales que permiten la visualización y el análisis de datos de imágenes tridimensionales y cuatridimensionales de embriones de ratón en el contexto de la elongación y segmentación axial, obtenidos por tomografía de proyección óptica in toto, y por imágenes en vivo y tinción de inmunofluorescencia de montaje completo mediante microscopía multifotónica.

Enfoques de visualización y análisis tridimensionales y de cuatro dimensiones para estudiar la elongación y segmentación axial de vertebrados

Este estudio proporciona un protocolo para el uso de ratones knockout Stat3 específicos del linaje osteoblástico inducible para estudiar la remodelación ósea bajo fuerza ortodóncica y describe métodos para analizar la remodelación ósea alveolar durante el movimiento dental de ortodoncia, arrojando así luz sobre la biología mecánica esquelética.

Uso de ratones knockout Stat3 específicos del linaje osteoblástico inducible para estudiar la remodelación del hueso alveolar durante el movimiento de los dientes de ortodoncia

Aquí, describimos en profundidad un método, que se basa en la tomografía microcomputarizada, para segmentar y medir modelos 3D de huesos craneomaxilofaciales en ratones, para una mejor evaluación del desarrollo óseo craneomaxilofacial en ratones que lo que es posible con los métodos actuales.

Análisis de Malformaciones Craneomaxilofaciales en Ratones mediante Tomografía Microcomputarizada Tridimensional

Aprenda a analizar fenotipos esqueléticos en modelos de ratón transgénicos Stat3 Ctsk mediante tinción TRAP, micro CT y marcaje doble. Este método permite estudiar la diferenciación de osteoclastos y la regulación de la masa ósea in vivo.

Análisis de fenotipo esquelético de un modelo de ratón de eliminación condicional de Stat3

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