Los estudios de estructura-función en las células madre embrionarias de ratón Usando mediada por recombinasa Cambio de Cassette

El objetivo general de este método de estructura-función es diseccionar a nivel molecular el papel de diferentes dominios de proteínas, o mutaciones relevantes para la enfermedad, en células madre embrionarias de ratón naïve o diferenciadas. Este método puede ayudar a revelar cómo los diferentes residuos o dominios de una proteína pueden contribuir a su función en un contexto celular determinado. La principal ventaja de esta técnica es que permite dirigir de forma muy eficiente las construcciones de rescate al genoma de células madre embrionarias knock out, o células ES, y la investigación de su papel en diferentes tipos de células.

Para lograrlo, combinamos tres tecnologías altamente eficientes. Estos incluyen el aislamiento mejorado de células madre embrionarias de ratón, el ensamblaje de factores de orientación basados en recombinación y la orientación de células madre embrionarias a través del intercambio de casetes mediado por recombinación, o RMC. Jinke D'Hont, una técnica de mi laboratorio, demostrará algunos de los procedimientos.

El intercambio de casetes mediado por recombinación, o RMCE, permite el intercambio de fragmentos de ADN entre un vector y un locus genómico. RMCE aprovecha los sitios de recombinación heteroespecíficos que no reaccionan de forma cruzada y que están incrustados en un locus genómico. En presencia de un plásmido donante que contiene un fragmento de ADN flanqueado por los mismos sitios heteroespecíficos, la recombinasa insertará este fragmento de ADN en el locus genómico compatible con RMCE debido a la doble translocación simultánea.

Solo tras la recombinación correcta, el gen de resistencia a la neomicina atrapado en el sitio de acoplamiento de Rosa 26 se restaurará a través de un promotor PGK en el vector objetivo entrante, que genera resistencia a los medicamentos. Este sistema de trampa de resistencia a la neomicina da como resultado una eficiencia de focalización muy alta, a menudo cercana al 100%El día antes del aislamiento del blastocisto, agregue 0,1% de gelatina a 12 placas bien cultivadas. E incubarlos a 37 grados centígrados durante cinco minutos.

Aspira la solución de gelatina. A continuación, siembre un cuarto de un vial de fibroblastos embrionarios de ratón P2, o MEF, en medio MEF y divídalo en la placa de 12 pocillos. Incubar las placas de MEF de 12 pocillos en dos mililitros de medio MEF a 37 grados Celsius.

Y hacer crecer las células hasta convertirlas en una monocapa confluente. Luego agregue 10 microgramos por mililitro de semilla de mitomicina a los pocillos. E incubar los cultivos durante tres horas a 37 grados centígrados, para inactivar las células.

Después de seleccionar ratones knock out heterocigotos que contenían un casete RMCE en el locus Rosa 26 de acuerdo con el protocolo de texto, configure apareamientos para criar ratones knock out heterocigotos compatibles con RMCE, con ratones knock out heterocigóticos. A la mañana siguiente, compruebe si hay tapones de cópula levantando a la hembra por la base del cuento y examine la abertura vaginal en busca de una masa blanquecina. Si el tapón es difícil de ver, con una sonda en ángulo, separe ligeramente los labios de la vulva, luego separe las hembras taponadas de sus machos.

Para recolectar blastocistos a los 3,5 días después del coito, o DPC. Después de sacrificar a las hembras embarazadas, haga una incisión en la mitad ventral y use tijeras finas y pinzas para diseccionar el útero y el oviducto. A continuación, doble una aguja de calibre 26 en un ángulo de 45 grados unida a una jeringa de 1 mililitro llena de medio M2.

E inserte la aguja en el extremo del útero que está más cerca del oviducto. Use pinzas finas para mantener la aguja en su lugar mientras empuja el émbolo para enjuagar los blastocistos del útero y colocarlos en la tapa de un plato de 10 centímetros. El útero se hinchará si el lavado es exitoso.

Utilice una pipeta bucal para recoger todos los embriones en una gota de medio M2 y lave los embriones dos veces en una gota de medio M2. Inmediatamente después de lavar los embriones, use PBS, para lavar las células inactivadas con mitomicina-C dos veces. A continuación, con una pipeta bucal, coloque cada blastocisto en un pocillo separado de los MEF tratados con mitomicina-C, en medio celular del IEEE, suplementado con pluripotente o 2I.

Incubar los cultivos a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Actualice el medio celular SREF cada dos o tres días. Examine cada blastocisto bajo un microscopio estereoscópico con un aumento de 4X y verifique la eclosión y el desprendimiento de la capa MEF.

Después de 10 a 12 días de cultivo, bajo un microscopio estereoscópico, utilice una pipeta P10 con puntas desechables para seleccionar las excrecencias individuales del icium. Transfiera cada excrecencia en aproximadamente 10 microlitros de medio a una placa de 96 pocillos en forma de V, que contenga 30 microlitros por pocillo de PBS. Con una pipeta multicanal, añada 50 microlitros de tripsina al 0,25% a cada pocillo.

E incubar la placa a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante tres minutos. Agregue 100 microlitros de medio de células madre embrionarias que contenga FPS preincubado y disocie las excrecencias de icium en células individuales pipeteando de 10 a 15 veces. A continuación, transfiera las células disociadas a placas MEF de 96 pocillos tratadas con mitomicina-C.

Al día siguiente, cambie el medio basado en SR. Expanda las células madre embrionarias de manera similar de placas de 24 a 6 pocillos. Después de identificar los vectores de CDNA rescatados de acuerdo con el protocolo de texto, prepare una reacción LR de 10 microlitros utilizando 100 nanogramos de vector de CDNA de rescate, 150 nanogramos de vector de RMCEDV1 preextirpado y dos microlitros de mezcla de recombinasa, que contiene una integrasa codificada por fagos, una excisionasa y un factor huésped de integración bacteriana.

Incubar la reacción a 25 grados centígrados durante dos horas. Para transformar los vectores recombinados, agregue 5 microlitros de cada mezcla, a 40 microlitros de bacterias E. Coli competentes para el choque térmico, en un tubo de rosca con faldón de rosca de 2 mililitros. E incubar la muestra en hielo durante 20 minutos.

A continuación, incubar las células a 37 grados centígrados durante cinco minutos. Agregue un mililitro de medio LB al tubo e incube las células a 37 grados centígrados durante una hora. Plato de 50 microlitros en placas de agar con ampicilina.

Y crecen a 37 grados centígrados durante la noche. Identifique las colonias con el vector de selección correcto utilizando una punta P200 para elegir cinco colonias al azar. Transfiera la punta a un tubo de ensayo de vidrio que contenga de dos a cinco mililitros de medio LB y crezca durante la noche a 37 grados centígrados.

Después de extraer el ADN de cada colonia, valide las muestras digiriendo de 0,5 a dos microgramos de ADN y separe las muestras en un gel de agarosa al 1%. Iniciar un cultivo de células madre embrionarias knock-out compatibles con RMCE y pasarlas al menos dos veces en MEF, en un medio de células madre embrionarias basado en FBS. A continuación, divida las células madre embrionarias en una placa gelatinizada de seis pocillos.

Al día siguiente, use 1,5 mililitros de medio de células madre embrionarias basado en FBS para refrescar las células madre embrionarias que son aproximadamente 50% confluentes. Combine un microgramo de vector de orientación de RMCEDV1 previamente extirpado, que contiene CDNA de rescate, y un microgramo de plásmido de expresión de FLIPe, en 250 microlitros de medio DMEM puro. Añadir siete microlitros de reactivo de transvección a base de lipofectina a 250 microlitros de medio DMEM puro.

E incubar la solución durante cinco minutos a temperatura ambiente. Combine las soluciones de ADN y lipofectina. E incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 20 minutos.

A continuación, pipetee la mezcla de transvección sobre las células madre embrionarias renovadas y gírelas suavemente. Un día después de la transvección, se dividieron todas las células madre embrionarias del tubo en una placa de cultivo de 10 centímetros, con una capa confluente de DR4 MEFS y 10 mililitros de medio de células madre embrionarias basado en FPS. Dos días después de la transvección, seleccione clones de células ES con el intercambio de casetes mediado por FLIP-e correcto, agregando G418 al medio.

Como se muestra aquí, la matanza masiva de colonias no objetivo debería ser visible después de tres a cinco días. Las colonias deben aparecer después de siete a 10 días. Elija estas colonias, luego expándalas y verifique los clones como se demostró anteriormente en este video.

Para diferenciar las células madre embrionarias en cuerpos embrioides, o EB, después de cultivar células madre embrionarias knock out con construcciones de rescate impulsadas por Rosa 26 de acuerdo con el protocolo de texto, permita que se formen EB en las placas no adherentes durante 30 días. Refresque el medio cada dos o tres días transfiriendo la suspensión EB a un tubo de 50 mililitros. Y que los EB se asienten por gravedad.

Retire el sobrenadante, agregue medio fresco y transfiera la suspensión EB a un plato de grado bacteriano. Analizar las células ES y EBs por inmunofluorescencia y TEM, según el protocolo de texto. Utilizando el método de función de estructura, se generaron cinco vectores de RMCEDV1 pre-extirpados con una eficiencia del 100% y estos constructos de rescate se dirigieron a través de RMCE, a células ES knock out de catenina P120, con una eficiencia del 97%La morfología quística de EB se puede utilizar como lectura fenotípica para detectar diferentes constructos de rescate.

Como prueba de concepto, la isoforma 1A de catenina P120 impulsada por R26 rescató el fenotipo knock out de catenina p120. Para probar si el anclaje de la membrana independiente de la catenina P120 de E-cadherina permitía la formación de EB csítico, el motivo de orientación de la membrana k-ras, CAAX, se fusionó con el extremo carboxilado de la catenina P120 y se introdujo a través de RMCE, en las células ES knock-out de catenina P120, antes de que se produjeran EB a partir de ellas. Sin embargo, este constructo sirve a un negativo dominante que no permite la unión y estabilización de la E-cadherina.

Y como consecuencia, no rescata el fenotipo knock out de catenina p120. La transición epitelio-mesenquimatosa, o EMT, es un proceso de desarrollo esencial que también ocurre durante la diferenciación de las células madre embrionarias. Cuando se expresan en las células madre embrionarias eliminadas de la catenina p120, los inductores de EMT, ZEB1, ZEB2 o caracol que pueden reprimir directamente varios genes marcadores epiteliales como la E-cadherina, no lograron restaurar la formación de EB quística.

Una vez dominadas, las células madre embrionarias compatibles con RMCE se pueden aislar en un mes. Los vectores de diana compatibles con RMCE pueden generarse en el plazo de una semana, y el rescate dirigido de las células madre embrionarias puede lograrse en el plazo de un mes utilizando esta técnica, si se realiza correctamente. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo usar RMCE para realizar estudios de función estructural en células madre embrionarias naïve o diferenciadas.