Visualización bidimensional y cuantificación de labile, nutrientes vegetales inorgánicos y contaminantes en el suelo

El ciclo bioquímico de los elementos en el suelo juega un papel crucial en los sistemas ambientales. Con este protocolo, se puede obtener una imagen en 2D de la distribución de las fracciones de elementos disponibles para la planta mediante espectrometría de masas DGT. Este método es único en su capacidad para visualizar y cuantificar niveles ultra traza de múltiples especies de solutos inorgánicos en la interfaz de solutos, superando sustancialmente la resolución espacial de los métodos alternativos.

Además de la investigación de los flujos de mano de obra y solutos en suelos y sedimentos, este método se puede aplicar para investigar cómo las raíces de las plantas absorben los nutrientes y los elementos contaminantes. Para la fabricación de gel DGT, primero se recubre una película delgada de suspensión de gel aglutinante de aniones y cationes mixtos a base de poliuretano sobre una placa de vidrio, y coloque la placa en un horno para iniciar la formación de gel por evaporación del solvente. Después de repetir la aplicación y la evaporación tres veces, hidratar la placa de vidrio de triple recubrimiento resultante en un baño de agua para obtener un gel aglutinante mixto de aniones y cationes de 0,1 milímetros de grosor, resistente al desgarro.

Para ensamblar el rizotrón, use dos abrazaderas para sujetar una pequeña cuchilla acrílica en la parte inferior de la elevación del rizotrón con la presión de las abrazaderas dirigida sobre el marco del rizotrón, de modo que la placa no se doble hacia adentro. Incline el rizotrón ligeramente hacia la pequeña placa de plástico y llene el rizotrón con tierra prehumedecida hasta una altura aproximada de cuatro centímetros. Agite ligeramente el rizotrón para distribuir uniformemente el suelo y use una herramienta de compactación para comprimir suavemente el suelo unos milímetros.

Repita el llenado y la compresión hasta que el rizotrón se llene de tierra, dejando un espacio de tres centímetros en la parte superior. Use cinta adhesiva para fijar cuidadosamente una pieza de papel de aluminio de PTFE de 13 por 22 centímetros al marco del rizotón una esquina a la vez, aplicando tensión para asegurar una superficie de papel de aluminio plana. Cuando la lámina de PTFE sea plana y contigua a la superficie del suelo, coloque una segunda pieza de lámina en el extremo inferior del rizotrón, superponiendo la pieza superior de lámina de PTFE en un centímetro de la misma manera.

Cuando la segunda pieza haya sido asegurada, aplique una cubierta protectora de lámina de plástico. Coloque una placa frontal sobre el rizotrón relleno de tierra y cubierto con papel de aluminio, y coloque un riel alrededor de cada lado del rizotrón. A continuación, apriete los tornillos a mano para fijar los rieles de la placa frontal al rizotrón con la posición de los tornillos hacia el lado cerrado del rizotón.

Para regar el suelo, empuje las puntas de las pipetas en los abrevaderos y deje que el agua fluya hacia el suelo por gravedad. Para cultivar plantas, plante hasta dos plántulas en el rizotrón y agregue cinco mililitros de agua directamente a las plántulas para apoyar su crecimiento. Cubra la abertura superior del rizotrón durante los primeros dos días después de la siembra con una película transparente que retenga la humedad y envuelva el rizotrón en papel de aluminio para evitar el crecimiento microfítico.

Luego, coloque el rizotrón plantado en una sala de crecimiento con las condiciones ambientales establecidas para los requisitos específicos de la planta e incline el rizotrón de 25 a 35 grados para asegurar el desarrollo de las raíces a lo largo de la placa frontal a través del gravitropismo. Para aplicar el gel DGT fabricado, corte una membrana de policarbonato de 10 micras de espesor con un tamaño de poro de 0,2 micras a un ancho y largo de al menos más de un centímetro de cada lado del gel y coloque la membrana sobre el gel. Aplique agua para eliminar las burbujas de aire de la pila y use cinta eléctrica de vinilo para fijar la membrana a la placa a lo largo de los cuatro bordes del gel.

Después de quitar la placa frontal y las láminas protectoras, alinee el visor de una cámara réflex digital de lente única equipada con una lente macro al centro de la región de interés en el gel e incluyendo una barra de escala en la imagen para obtener una foto ortogonal de la región de interés. A continuación, alinee un borde de la placa equipada con la pila de membranas de gel con un borde del rizotrón abierto. Doble suavemente la placa hacia el suelo y use los rieles y tornillos para sujetar la placa al rizotrón.

Después del período de muestreo de soledad, transfiera la placa frontal del rizotrón a una campana de flujo laminar con el lado de la pila de membrana de gel hacia arriba y retire con cuidado la cinta y la membrana de policarbonato que cubre el gel. Aplique agua para ayudar a que el gel flote libremente sobre una película delgada de agua en la placa con el lado de contacto con el suelo hacia arriba y transfiera el gel a una membrana de polietersulfona con un tamaño de poro de 0,45 micras y soporte de papel secante. Después de cubrir la pila de gel con una lámina protectora, coloque la pila en un secador de gel al vacío.

Cuando el gel se haya secado por completo, use cinta adhesiva de doble cara para fijar el gel seco junto con otras muestras de gel en una placa de vidrio. Para realizar un análisis de escaneo de línea de espectrometría de masas con plasma acoplado inductivamente a la ablación láser de los geles secos de DGT, primero fije los blancos de muestra y los estándares en la etapa de muestra de ablación láser y bloquee la etapa láser en la celda de ablación del sistema de ablación láser. En el software de ablación láser, mueva la región de interés en la superficie del gel y trace una sola línea de aproximadamente un mililitro de largo a través de la superficie del patrón de gel.

Lame con el botón derecho la línea en la ventana de patrones de escaneo para verificar que los parámetros de ablación láser se hayan establecido y adoptado, y use la herramienta de escaneos duplicados para duplicar esta línea cuatro veces con una distancia entre líneas mayor que el diámetro del punto. Después de repetir esta línea para cada blanco de calibración estándar de gel y blanco de método, dibuje una sola línea a lo largo del borde superior del área rectangular de la muestra de gel que se va a analizar y duplique la línea para crear líneas paralelas para toda el área de la muestra como se demuestra, utilizando una distancia entre líneas de 300 a 400 micrómetros. Verifique que cada punto inicial y final de cada línea esté correctamente enfocado en la superficie del gel y haga clic en analizar lote para iniciar la secuencia de muestras en el espectrómetro de masas de plasma acoplado inductivamente.

Haga clic en la emisión en la ventana de energía láser para recargar el cabezal láser. Haga clic en ejecutar para abrir la ventana de ejecución del experimento y seleccionar solo los patrones seleccionados. Establezca el retraso de lavado en 20 a 30 segundos.

Seleccione el cuadro láser habilitado durante los escaneos y configure el tiempo de calentamiento del láser en 10 segundos. A continuación, haga clic en ejecutar y aceptar para iniciar el análisis de escaneo lineal y supervisar la intensidad de la señal bruta en recuentos por segundo para cada isótopo en el espectrómetro de masas de plasma acoplado inductivamente en tiempo real. Cada línea debe comenzar y terminar con un blanco de gas.

Después del análisis, importe el archivo de datos sin procesar para cada línea ablacionada en una hoja de cálculo. La tabla de datos brutos muestra las lecturas de espectrometría de masas de plasma acoplado inductivamente para cada isótopo en recuentos por segundo y los puntos de tiempo correspondientes en segundos. Enumere todas las líneas una al lado de la otra en diferentes columnas.

Calcule un blanco de gas promedio para cada isótopo a partir de todos los valores de blanco de gas registrados antes de las ablaciones en línea y reste el blanco de gas promedio de las intensidades brutas correspondientes para cada isótopo para corregir la señal de fondo. Para aplicar la normalización interna, divida la intensidad de la señal corregida por el blanco de gas de cada isótopo por la intensidad de la señal corregida por el tono de gas del carbono estándar interno 13 para cada punto de datos para corregir las variaciones en la cantidad de material ablacionado y la deriva instrumental. Recorte los datos antes del inicio y después del final de cada línea ablacionada para eliminar la señal de fondo de gas en blanco y transponga la tabla de datos para obtener una matriz de cuadrícula en la que cada fila corresponde a una línea ablacionada y cada columna corresponde a un valor de intensidad de isótopo normalizado.

A continuación, aplique la función de calibración obtenida del análisis de los patrones de gel y guarde la matriz de datos calibrada como un archivo de texto. Para generar una imagen, importe la matriz de datos de muestra calibrada en el software de análisis de imágenes como una imagen de texto y aplique el factor de corrección de relación de aspecto y una tabla de búsqueda para visualizar los gradientes químicos en la imagen de soluto. Ajuste el balance de color de la imagen para controlar los límites inferior y superior del rango de visualización, agregue una barra de calibración y guarde la imagen de soluto como un archivo TIF.

Utilice el comando copiar al sistema para copiar la imagen sólida y pegarla en el software de autoedición. A continuación, la escala, la igualación, la alineación y la composición de la imagen sólida con una foto de la región de interés y las demás imágenes de soluto. La alineación de las imágenes de soluto con una imagen fotográfica de la región de interés revela que la distribución submilimétrica del flujo sólido 2D de diferentes elementos es muy variable según la estructura del suelo y la morfología de la raíz.

Por ejemplo, en este análisis de una raíz joven de trigo sarraceno cultivada en un suelo libre de carbonatos, fertilizada con nitrato de amonio, la distribución de solutos submilimétricos mostró zonas de disminución de flujos de aluminio, fósforo y hierro junto con secciones de raíces más viejas debido a la absorción de raíces, y fundentes de magnesio, aluminio, fósforo, manganeso y hierro altamente aumentados en el ápice de la raíz debido a los procesos de movilización de nutrientes localizados. En este análisis, se puede observar un claro agotamiento de zinc, cadmio y plomo en la posición inmediata de la raíz, lo que ilustra que las raíces de la especie de sauce tolerante a los metales Salix smithiana actúan como un sumidero localizado para los metales traza lábiles en el suelo contaminado. En este análisis, la distribución de metales traza lábiles a lo largo de las raíces de Salix smithiana se colocalizó con la distribución del pH, utilizando un gel aglutinante catiónico optodo plano de una sola capa combinado.

Esta combinación de métodos reveló que el aumento de los flujos de solutos de manganeso, hierro, cobalto, níquel, cobre y plomo se asoció con una disminución del pH en aproximadamente una unidad, lo que sugiere una solubilización del metal inducida por el pH. Es fundamental asegurar un contacto estrecho y estable entre la herramienta DGT y la superficie sólida para evitar artefactos analíticos. En caso de duda, repita el procedimiento de aplicación del gel.

Este método puede combinarse con otras técnicas de imagen sólida basadas en la difusión, como los optodos planos, para evaluar simultáneamente una serie de parámetros implicados en la absorción de elementos de la planta.