Cuantificación de proteínas solubles de la planta y Digestible contenido de hidratos de carbono, utilizando el maíz (Zea mays) como un ejemplar

Este método permite a los investigadores en el campo de las ciencias de las plantas y la ecología nutricional medir con precisión las concentraciones de proteínas solubles y carbohidratos digeribles en el tejido vegetal. La principal ventaja de estas técnicas es que ofrecen un método rápido y sencillo para cuantificar estos dos macronutrientes increíblemente importantes con gran precisión. Estas técnicas tienen fuertes implicaciones para el campo de la ecología porque las proteínas vegetales y los carbohidratos constituyen la base de las redes tróficas terrestres.

En general, las personas nuevas en esta técnica pueden tener dificultades porque hay varios pasos y algunas técnicas que no se realizan comúnmente en un laboratorio de uso general. Para empezar, pesa muestras replicadas de cada tejido en tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros marcados. A continuación, registre la masa exacta de cada muestra.

Con un micropipeteador, agregue 500 microlitros de hidróxido de sodio 0,1 molar a cada tubo. Cierre bien las tapas y caliente sónicamente los tubos durante 30 minutos. A continuación, coloque los tubos en un baño de agua caliente precalentado durante 15 minutos.

Después de esto, centrifugar los tubos a 15, 000 G durante 10 minutos. Pipetear el sobrenadante en nuevos tubos de microcentrífuga marcados, utilizando una nueva punta de pipeta para cada muestra. Agregue 300 microlitros de hidróxido de sodio 0,1 molar al pellet y repita la centrifugación durante 10 minutos.

Después de esto, retire el sobrenadante y transfiéralo a los tubos que contienen el sobrenadante de la primera centrifugación. Para neutralizar el pH del sobrenadante, añadir 11 microlitros de ácido clorhídrico 5,8 molar. Use papel tornasol para confirmar que el pH es de aproximadamente siete.

A continuación, agregue 90 microlitros de ácido tricloroacético al 100% a cada tubo. A continuación, incubar los tubos en hielo durante 30 minutos. Centrifugar las muestras a 13.000 g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados.

Utilice con cuidado una línea de vacío y una punta de micropipeta de vidrio para eliminar el ácido tricloroacético. Tenga mucho cuidado de no tocar el pellet con la punta de succión. A continuación, lave el pellet con 100 microlitros de acetona enfriados a 20 grados centígrados, luego deje que la acetona se evapore en una campana extractora.

Disuelve el pellet de proteína con un mililitro de hidróxido de sodio. Es posible que se requieran rondas adicionales de calentamiento, vórtice y calentamiento sónico. Agregue 160 microlitros de cada solución estándar IGG a una placa de 96 pocillos por triplicado, comenzando con la posición A1 A continuación, en un nuevo tubo de 1,5 mililitros, agregue 50 microlitros de cada solución de muestra a 950 microlitros de agua destilada.

A continuación, añada 60 microlitros de cada muestra diluida a la placa del pocillo por triplicado, empezando por la posición H1. Agregue 100 microlitros de agua destilada a todos los pozos de muestra en blanco y desconocidos. Con una pipeta multicanal, agregue 40 microlitros de colorante proteico Coomassie Brilliant Blue G-250 a cada pocillo de la placa.

Con una aguja, revienta las burbujas presentes en los pocillos. Después de esto, deje que la placa se incube a temperatura ambiente durante cinco minutos. A continuación, utilice un espectrofotómetro de microplacas para registrar los valores de absorbencia de cada pocillo a 595 nanómetros.

Primero, pese las réplicas de cada muestra de tejido en tubos de vidrio de 15 mililitros. Etiquete los tubos y registre la masa exacta de cada muestra. A continuación, añade un mililitro de ácido sulfúrico 0,1 molar a cada tubo y cierra bien los tapones.

A continuación, coloque los tubos en un baño de agua hirviendo durante una hora. Transfiera los tubos a un baño de agua tibia para que se enfríen. A continuación, vierta el contenido de los tubos en tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros etiquetados.

Después de esto, centrifugar los tubos a 15, 000 G durante 10 minutos. Utilice una micropipeta para transferir el sobrenadante a tubos nuevos de 1,5 mililitros etiquetados. Con una pipeta, transfiera 15 microlitros de cada muestra desconocida a su propio tubo de ensayo.

Luego agregue 385 microlitros de agua destilada a cada tubo. En una campana extractora, agregue 400 microlitros de fenol al 5% a cada tubo de ensayo de muestra estándar y desconocido. Inmediatamente después, agregue dos mililitros de ácido sulfúrico a cada tubo.

Asegúrate de agregar el ácido sulfúrico a la superficie de la solución. Después de incubar las trompas durante 10 minutos, haga un vórtice de las trompas. A continuación, incube el tubo durante 30 minutos más.

Transfiera 800 microlitros de cada tubo de muestra a tres semimicrocubetas de poliestireno de 1,5 mililitros. A continuación, configure el espectrofotómetro para que lea a 490 nanómetros y calibrado con una cubeta en blanco. Finalmente, pase cada cubeta a través del espectrofotómetro y registre la absorbencia.

Utilizando este protocolo, se analizó el contenido de proteína soluble y carbohidratos digeribles de cuatro tejidos diferentes de maíz de campo y maíz dulce de tres regiones geográficas. Se observaron diferencias significativas en el contenido de proteínas solubles entre las regiones, por lo que se necesitaron análisis separados para cada región. En todas las regiones hubo varias diferencias en el contenido de proteínas solubles y carbohidratos digeribles entre los tejidos.

En Minnesota, los tejidos solo variaron en el contenido de proteínas solubles, mientras que los tejidos de Carolina del Norte variaron tanto en proteínas solubles como en carbohidratos digeribles. La variabilidad en el contenido de macronutrientes de los tejidos en Texas dependió de la variedad. Esta técnica permitirá a los investigadores en el campo de las ciencias de las plantas y la ecología nutricional medir con precisión la proteína vegetal soluble y los carbohidratos digeribles, en lugar de extrapolar a partir de medidas elementales.

No olvide que trabajar con nitrógeno líquido, ácidos y bases concentrados, puede ser extremadamente peligroso. Por lo tanto, siempre use precauciones como guantes, gafas de seguridad, delantales y zapatos cerrados cuando trabaje con estos productos químicos.