Cuantificación de proteínas solubles de la planta y Digestible contenido de hidratos de carbono, utilizando el maíz (Zea mays) como un ejemplar
6 de agosto de 2018
Los protocolos descritos proporcionan una metodología clara y accesible para la medición de proteína soluble y digestible carbohidratos (no estructurales) contenido en los tejidos vegetales. La capacidad de cuantificar estos macronutrientes de dos plantas tiene implicaciones importantes para el avance de los campos de la fisiología vegetal, ecología nutricional, interacciones planta-herbívoro y ecología trófica.
Este método permite a los investigadores en el campo de las ciencias de las plantas y la ecología nutricional medir con precisión las concentraciones de proteínas solubles y carbohidratos digeribles en el tejido vegetal. La principal ventaja de estas técnicas es que ofrecen un método rápido y sencillo para cuantificar estos dos macronutrientes increíblemente importantes con gran precisión. Estas técnicas tienen fuertes implicaciones para el campo de la ecología porque las proteínas vegetales y los carbohidratos constituyen la base de las redes tróficas terrestres.
En general, las personas nuevas en esta técnica pueden tener dificultades porque hay varios pasos y algunas técnicas que no se realizan comúnmente en un laboratorio de uso general. Para empezar, pesa muestras replicadas de cada tejido en tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros marcados. A continuación, registre la masa exacta de cada muestra.
Con un micropipeteador, agregue 500 microlitros de hidróxido de sodio 0,1 molar a cada tubo. Cierre bien las tapas y caliente sónicamente los tubos durante 30 minutos. A continuación, coloque los tubos en un baño de agua caliente precalentado durante 15 minutos.
Después de esto, centrifugar los tubos a 15, 000 G durante 10 minutos. Pipetear el sobrenadante en nuevos tubos de microcentrífuga marcados, utilizando una nueva punta de pipeta para cada muestra. Agregue 300 microlitros de hidróxido de sodio 0,1 molar al pellet y repita la centrifugación durante 10 minutos.
Después de esto, retire el sobrenadante y transfiéralo a los tubos que contienen el sobrenadante de la primera centrifugación. Para neutralizar el pH del sobrenadante, añadir 11 microlitros de ácido clorhídrico 5,8 molar. Use papel tornasol para confirmar que el pH es de aproximadamente siete.
A continuación, agregue 90 microlitros de ácido tricloroacético al 100% a cada tubo. A continuación, incubar los tubos en hielo durante 30 minutos. Centrifugar las muestras a 13.000 g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados.
Utilice con cuidado una línea de vacío y una punta de micropipeta de vidrio para eliminar el ácido tricloroacético. Tenga mucho cuidado de no tocar el pellet con la punta de succión. A continuación, lave el pellet con 100 microlitros de acetona enfriados a 20 grados centígrados, luego deje que la acetona se evapore en una campana extractora.
Disuelve el pellet de proteína con un mililitro de hidróxido de sodio. Es posible que se requieran rondas adicionales de calentamiento, vórtice y calentamiento sónico. Agregue 160 microlitros de cada solución estándar IGG a una placa de 96 pocillos por triplicado, comenzando con la posición A1 A continuación, en un nuevo tubo de 1,5 mililitros, agregue 50 microlitros de cada solución de muestra a 950 microlitros de agua destilada.
A continuación, añada 60 microlitros de cada muestra diluida a la placa del pocillo por triplicado, empezando por la posición H1. Agregue 100 microlitros de agua destilada a todos los pozos de muestra en blanco y desconocidos. Con una pipeta multicanal, agregue 40 microlitros de colorante proteico Coomassie Brilliant Blue G-250 a cada pocillo de la placa.
Con una aguja, revienta las burbujas presentes en los pocillos. Después de esto, deje que la placa se incube a temperatura ambiente durante cinco minutos. A continuación, utilice un espectrofotómetro de microplacas para registrar los valores de absorbencia de cada pocillo a 595 nanómetros.
Primero, pese las réplicas de cada muestra de tejido en tubos de vidrio de 15 mililitros. Etiquete los tubos y registre la masa exacta de cada muestra. A continuación, añade un mililitro de ácido sulfúrico 0,1 molar a cada tubo y cierra bien los tapones.
A continuación, coloque los tubos en un baño de agua hirviendo durante una hora. Transfiera los tubos a un baño de agua tibia para que se enfríen. A continuación, vierta el contenido de los tubos en tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros etiquetados.
Después de esto, centrifugar los tubos a 15, 000 G durante 10 minutos. Utilice una micropipeta para transferir el sobrenadante a tubos nuevos de 1,5 mililitros etiquetados. Con una pipeta, transfiera 15 microlitros de cada muestra desconocida a su propio tubo de ensayo.
Luego agregue 385 microlitros de agua destilada a cada tubo. En una campana extractora, agregue 400 microlitros de fenol al 5% a cada tubo de ensayo de muestra estándar y desconocido. Inmediatamente después, agregue dos mililitros de ácido sulfúrico a cada tubo.
Asegúrate de agregar el ácido sulfúrico a la superficie de la solución. Después de incubar las trompas durante 10 minutos, haga un vórtice de las trompas. A continuación, incube el tubo durante 30 minutos más.
Transfiera 800 microlitros de cada tubo de muestra a tres semimicrocubetas de poliestireno de 1,5 mililitros. A continuación, configure el espectrofotómetro para que lea a 490 nanómetros y calibrado con una cubeta en blanco. Finalmente, pase cada cubeta a través del espectrofotómetro y registre la absorbencia.
Utilizando este protocolo, se analizó el contenido de proteína soluble y carbohidratos digeribles de cuatro tejidos diferentes de maíz de campo y maíz dulce de tres regiones geográficas. Se observaron diferencias significativas en el contenido de proteínas solubles entre las regiones, por lo que se necesitaron análisis separados para cada región. En todas las regiones hubo varias diferencias en el contenido de proteínas solubles y carbohidratos digeribles entre los tejidos.
En Minnesota, los tejidos solo variaron en el contenido de proteínas solubles, mientras que los tejidos de Carolina del Norte variaron tanto en proteínas solubles como en carbohidratos digeribles. La variabilidad en el contenido de macronutrientes de los tejidos en Texas dependió de la variedad. Esta técnica permitirá a los investigadores en el campo de las ciencias de las plantas y la ecología nutricional medir con precisión la proteína vegetal soluble y los carbohidratos digeribles, en lugar de extrapolar a partir de medidas elementales.
No olvide que trabajar con nitrógeno líquido, ácidos y bases concentrados, puede ser extremadamente peligroso. Por lo tanto, siempre use precauciones como guantes, gafas de seguridad, delantales y zapatos cerrados cuando trabaje con estos productos químicos.
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Descripción general
Este artículo presenta metodologías para medir proteínas solubles e hidratos de carbono digeribles en tejidos vegetales. Estas técnicas son fundamentales para comprender la fisiología vegetal y las interacciones ecológicas.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Ciencias de las Plantas
- Ecología Nutricional
- Ecología
Antecedentes
- La cuantificación de macronutrientes es esencial para estudiar las redes tróficas.
- Las proteínas y los carbohidratos solubles son fundamentales para los ecosistemas terrestres.
- Los investigadores novatos pueden encontrar estas técnicas desafiantes debido a su complejidad.
- La medición precisa es vital para la investigación ecológica.
Objetivo del estudio
- Proporcionar una metodología clara para medir los macronutrientes vegetales.
- Mejorar la comprensión de las interacciones entre plantas y herbívoros.
- Apoyar la investigación en fisiología y ecología vegetal.
Métodos Utilizados
- Pese muestras replicadas de tejido vegetal.
- Utilice tubos microcentrífugos etiquetados para el almacenamiento de las muestras.
- Registre la masa precisa de cada muestra.
- Siga protocolos específicos para una medición precisa.
Resultados principales
- Las técnicas proporcionan alta precisión en la medición de macronutrientes.
- Los métodos son rápidos y sencillos una vez dominados.
- Los resultados tienen implicaciones significativas para los estudios ecológicos.
- Facilita una mejor comprensión del contenido nutricional de las plantas.
Conclusiones
- Es posible lograr una medición precisa de proteínas y carbohidratos solubles.
- Estos métodos pueden avanzar la investigación en diversos campos ecológicos.
- Comprender los macronutrientes vegetales es crucial para la dinámica de las redes tróficas.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La cuantificación precisa de macronutrientes vegetales respalda la validación de objetivos en ecología nutricional y la reducción mecanicista de riesgos en los modelos de interacción planta-herbívoro. La medición directa de proteínas solubles y carbohidratos digeribles mejora la confianza predictiva en estudios de dinámica de redes tróficas al reducir la dependencia de correlaciones elementales extrapoladas. Esto posibilita un descubrimiento más confiable de biomarcadores traducibles y el desarrollo de modelos preclínicos en líneas de investigación basadas en plantas.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la verificación de hipótesis nutricionales al proporcionar datos precisos sobre proteínas solubles e hidratos de carbono para la validación de objetivos.
- Valor operativo: Apoya la reducción del riesgo biológico mediante la cuantificación reproducible de macronutrientes vegetales clave en diferentes tipos de tejidos y regiones de cultivo.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Proporciona resultados cuantitativos estandarizados para ensayos de proteínas solubles y carbohidratos digestibles, facilitando la preparación y escalabilidad de los ensayos.
- Valor operativo: Asegura la reproducibilidad mediante pasos de digestión optimizados y detección colorimétrica, permitiendo una evaluación confiable de compuestos en flujos de trabajo de cribado.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Relaciona la nutrición mineral de las plantas con procesos fisiológicos, apoyando la continuidad traslacional desde el descubrimiento hasta la validación preclínica.
- Valor operativo: Proporciona datos del sistema relevantes para enfermedades en estudios de ecología nutricional, mejorando las decisiones de avance ajustadas al riesgo en la investigación basada en plantas.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se integra en los flujos de trabajo de biología de descubrimiento al proporcionar datos cuantitativos sobre macronutrientes que informan la prueba de hipótesis y la aclaración de vías en modelos de interacción planta-herbívoro.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis y la reducción de riesgos biológicos mediante la medición precisa de proteínas solubles e hidratos de carbono digeribles.
- Selección: Permite la normalización y reproducibilidad de ensayos mediante lecturas colorimétricas cuantitativas del contenido de proteínas y carbohidratos solubles.
- Análisis: Genera mediciones espectrofotométricas precisas a 595 nm (proteína) y 490 nm (carbohidrato) para comparar condiciones entre tejidos y regiones.
- Investigación Traducional: Relaciona el contenido nutricional de las plantas con resultados ecológicos, apoyando la alineación de biomarcadores en estudios de dinámica de redes tróficas.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para la cuantificación de macronutrientes aplicable a través de especies vegetales y contextos de investigación.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva en los ensayos nutricionales de plantas, reducción de la ambigüedad mecanicista en la modelización ecológica.
- Valor operativo: Normalización, reproducibilidad y escalabilidad de la cuantificación de proteínas y carbohidratos solubles.
- Valor estratégico: Mejora en las decisiones de avance o interrupción en la validación de objetivos, eficiencia del capital en el desarrollo de ensayos, reducción del riesgo biológico en fases tardías en modelos preclínicos.
- Impacto en la cartera: Priorización ajustada al riesgo de objetivos basados en plantas según perfiles validados de macronutrientes.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el manejo de tejidos vegetales, ensayos colorimétricos y análisis espectrofotométrico.
- Necesita instrumentación que incluya microcentrífugas, baños de agua, vórtex y espectrofotómetros para microplacas.
- Exige la estandarización entre equipos de los pasos de digestión, neutralización y precipitación para obtener resultados reproducibles.
- Incluye consideraciones de adaptación para diferentes tejidos vegetales, especies y orígenes geográficos.
- Presenta limitaciones prácticas, como el manejo de reactivos peligrosos (NaOH, HCl, TCA, fenol, ácido sulfúrico), lo que requiere estrictos protocolos de seguridad.
