Aislamiento, cultivo e ingeniería genética de células epiteliales de pigmento primario de mamíferos para terapia génica no viral

El protocolo es significativo ya que muestra el aislamiento y la transfección de células epiteliales pigmentarias de cinco mamíferos como un sistema óptimo para estudiar la terapia génica ocular en diversas configuraciones. La principal ventaja de este método es su flexibilidad, transferibilidad, alto rendimiento celular, viabilidad y tasa de transfección debido a las cinco especies y al sistema de transposones SB100X no viral utilizado. Estas técnicas se han desarrollado para estudiar enfoques de terapia génica dirigidos a las células epiteliales pigmentarias de la retina y el iris, que están aisladas y transfectadas en el presente protocolo, pero que son utilizables para cualquier investigación ocular.

Demostrando el procedimiento estará Gregg Sealy, un técnico del laboratorio. Después de la eutanasia del animal, use tijeras curvas y pórceps Colibri para enuclear los ojos, luego limpie el tejido muscular restante y la piel de los ojos. Recoja los ojos en un tubo de 50 mililitros lleno de PBS no estéril y transfiera el tubo a la campana de flujo laminar.

Desinfecte sumergiéndolos en una solución a base de yodo durante dos minutos, luego transfiera los ojos a un tubo de 50 mililitros lleno de PBS estéril. Ponga un ojo en una compresa de gasa estéril y sostenga firmemente el ojo cerca del nervio óptico. Luego corte cerca del límite del iris con un bisturí número 11.

Usando tijeras, corte alrededor del iris y retire el segmento anterior y colórelo en una placa de Petri, dejando el bulbo con el vítreo hasta que se aísle el epitelio pigmentario de la retina, o células RPE. Para aislar el epitelial pigmentario del iris, o células IPE, retire la lente con fórceps finos y extraiga delicadamente el iris que contiene las células IPE. Coloque el iris en una placa de Petri y lávelo con PBS estéril.

Agregue 500 microlitros de tripsina al 0.25% e incube durante 10 minutos a 37 grados centígrados. Retire la tripsina, agregue 500 microlitros de medio completo y raspe el IPE delicadamente con una pipeta Pasteur plana y pulida al fuego. Recoja la suspensión celular y colóquela en un tubo de 1,5 mililitros.

Cuente las células usando la cámara de Neubauer y sise 0.2 millones de células por pozo en una placa de 24 pozos con un mililitro de medio completo. Coloque la placa en una incubadora y cultíquela a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Para aislar las células RPE, retire el humor vítreo y la retina del segmento posterior con forrórceps delgados.

Coloque los bulbos en la placa de 24 pozos y agregue 500 microlitros de tripsina al 0.25% por ojo e incube durante 10 minutos a 37 grados centígrados. Retire la tripsina, agregue 500 microlitros de medio completo por globo y raspe las células de RPE delicadamente con una pipeta Pasteur curva y pulida al fuego. Recoja la suspensión celular y colóquela en un tubo de 1,5 mililitros.

Cuente las células usando la cámara de Neubauer y semble las células como se describió anteriormente. Coloque la placa en la incubadora. Limpie el tejido muscular restante y la piel de los ojos y desinfecte los ojos en una solución a base de yodo y enjuáguelos con PBS.

Para aislar las células IPE, retire la lente y extraiga el iris como se describió anteriormente. Después de preparar dos iris, agregue un mililitro de medio completo y aísle las células rascando con una pipeta Pasteur plana y pulida al fuego, luego cuente y seme las células. Coloque la placa en la incubadora.

Para aislar las células RPE, retire el vítreo y la retina del segmento posterior y coloque el bulbo en una placa de Petri. Llene la bombilla con un medio completo de mililitros. Con una pipeta Pasteur curva y pulida al fuego, retire las celdas de RPE.

Recoja la suspensión celular dentro de la bombilla con una pipeta de 1.000 microlitros y transfiérala a un tubo de 1,5 mililitros para su resuspensión. Luego cuente y sese las células e incube la placa como se demostró anteriormente. Después de la limpieza, abra el ojo y corte alrededor del iris para eliminar el segmento anterior, luego coloque una placa de Petri.

Deje el bulbo con el vítreo hasta que se aíslan las células RPE. Para aislar las células IPE, si la lente viene con el segmento anterior, retire la lente y use fórceps finos para extraer delicadamente el iris que contiene las células IPE. Coloque el iris en una placa de Petri y lávelo con PBS estéril.

Cortar el cuerpo ciliar con un bisturí número 10. Después de preparar los iris, incube con dos mililitros de tripsina al 0,25% a 37 grados centígrados durante 10 minutos. Retire la tripsina y agregue dos mililitros de medio completo, luego aísle las células rascando con una pipeta Pasteur plana y pulida al fuego.

Transfiera la suspensión celular a un tubo de dos mililitros y centrifute las células durante 10 minutos a 120 veces G.Deseche el sobrenadante y vuelva a colocar las células en dos mililitros de medio completo. Seed 0,32 millones de células por pozo en una placa de seis pozos en tres mililitros de medio completo. Coloque la placa en una incubadora y cultíquela a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono.

Para aislar las células RPE, retire el humor vítreo y la retina del segmento posterior con pórceps. Evite dañar el epitelio pigmentario de la retina. Lave la bombilla con PBS.

Después de preparar ambos ojos, llene el bulbo aproximadamente tres cuartos llenos de tripsina e incube durante 25 minutos a 37 grados centígrados con la tapa de la placa de Petri en la parte superior del ojo del bulbo. Retire la tripsina y agregue un mililitro de medio completo. Con una pipeta Pasteur curva y pulida al fuego, retire las celdas de RPE.

Recoja la suspensión celular dentro de la bombilla y transfiérala a un tubo de 1,5 mililitros para su resuspensión. Centrifugar las células durante 10 minutos a 120 veces G.Seed 0.32 millones de células por pozo en una placa de seis pozos en tres mililitros de medio completo. Coloque la placa en una incubadora y cultíquela a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono.

Culta las células a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono en una incubadora humidificada. Después de tres o cuatro días, pipetee hacia arriba y hacia abajo para recolectar células no adherentes y coloque la mitad del volumen en otro pozo. Llene el pozo a un mililitro con medio completo.

Después de otros tres o cuatro días, repita la recolección de células, esta vez agrupando las células no adherentes de dos pozos en uno. Agregue medio a todos los pozos. Observe las células y cambie el medio dos veces por semana.

Cuando las células alcancen la confluencia, cambie a un medio completo con 1% FBS. Utilizando los protocolos antes mencionados, las células IPE y RPE se aislaron y cultivaron con éxito de cinco especies diferentes. El patrón de expresión de RPE se confirmó en células IPE bovinas primarias por inmunofluorescencia para RPE65.

Se estudió la viabilidad celular para excluir una toxicidad potencial del tampón de electroporación utilizando un kit de ensayo de citotoxicidad disponible comercialmente y un control electroporado de nudo. No se observó impacto en la viabilidad celular. Las células epiteliales pigmentarias precultivadas de diferentes especies fueron transfectadas con la proteína amarilla fluorescente venusna.

Se utilizaron células RPE19 transfectadas como control positivo. La cuantificación de la eficiencia de transfección en RPE de cerdo precultivo se muestra aquí. Las células epiteliales pigmentarias de conejo recién aisladas fueron transfectadas con la proteína fluorescente amarilla Venus y fueron monitoreadas por microscopía.

Las células epiteliales pigmentarias fueron transfectadas con factor derivado del epitelio pigmentario y la secreción de proteínas fue monitoreada por Western blot. La señal para las células transfectadas fue mayor en comparación con las células no transfectadas para todas las especies y días estudiados, y no se observó una disminución en la secreción de proteínas dentro de este tiempo. Es crucial evitar raspar las células con herramientas afiladas.

Aquí, se utilizan pipetas Pasteur pulidas al fuego, excepto en pequeños ojos de ratón, donde se debe usar un bisturí redondo. Las células epiteliales pigmentarias se pueden utilizar para desarrollar enfoques de terapia génica y para simular condiciones patológicas, por ejemplo, el daño por estrés oxidativo. Estos modelos también se pueden utilizar para probar fármacos terapéuticos.