Name: Aislamiento, cultivo e ingeniería genética de células epiteliales de pigmento primario de mamíferos para terapia génica no viral (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-26T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 46 s
Description: Aprende a aislar y cultivar células epiteliales de pigmento primario de mamíferos para terapia génica ocular no viral. Este protocolo flexible utiliza cinco especies y el sistema SB100X con alta viabilidad celular.

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Un agradecimiento merece a Gregg Sealy y Alain Conti por su excelente asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado por la Comisión Europea en el contexto del Séptimo Programa Marco, la Fundación Nacional Suiza de Ciencias y la Fundación Schmieder-Bohrisch. Z.I. recibió financiación del Consejo Europeo de Investigación, ERC Advanced [ERC-2011-ADG 294742] y B.M.W. de una beca de investigación Fulbright y una beca de excelencia del gobierno suizo.

Los protocolos en los que participaron los animales fueron llevados a cabo por personal certificado y previa autorización del Departamento cantonal de la seguridad, de l'emploi et de la santé (DSES), Domaine de l'expérimentation animale de Ginebra, Suiza, y de acuerdo con la Declaración arVO para el uso de animales en la investigación oftálmica y de la visión (aprobación no. GE/94/17). Las ratas adultas sanas de Brown Norway, los ratones C57BL / 6 y los conejos blancos de Nueva Zelanda fueron sacrificados por una sobredosis de Pentobarbital (150 mg / kg) diluido en NaCl inyectado intraperitoneal al 0.9% y los ojos se enuclearon inmediatamente después del sacrificio. Los ojos porcinos y bovinos se obtuvieron de un matadero local dentro de las 6 horas posteriores al sacrificio y se transportaron al laboratorio en hielo.
1. Antes de la preparación
<ol><li>Preparar medio completo (DMEM/Ham's F12 suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS), 80 U/mL de penicilina / 80 μg/mL de estreptomicina y 2,5 μg/mL de anfotericina B). Calentar el medio, 1x PBS, y 0.25% de tripsina (si es necesario) en un baño de agua a 37 °C.</li>
	<li>Coloque una cortina estéril en la capucha para preparar un lugar de trabajo aséptico. Introduzca todos los instrumentos y materiales estériles necesarios dentro de la campana. NOTA: Solo la enucleación de los ojos y la limpieza del tejido muscular y la piel restantes son los procedimientos que se llevan a cabo fuera de la capucha, el resto de los pasos deben realizarse dentro de la capucha.</li>
</ol>2. Aislamiento de células de PE de rata/ratón
<ol><li>Use tijeras curvas y pórceps Colibri para enuclear los ojos después de la eutanasia del animal. Limpie el tejido muscular restante y la piel de los ojos con tijeras y fórceps (no estériles). NOTA: El tamaño de las tijeras y fórceps utilizados para la enucleación y limpieza de los ojos depende de la especie (por ejemplo, para ratas y ratones los instrumentos van a ser más pequeños que los utilizados para cerdos y bovinos) (ver Figura S1).<ol>
<li>Recoja los ojos en un tubo de 50 ml lleno de PBS no estéril y transfiera el tubo a la campana de flujo laminar. Desinfecte los ojos sumergiéndolos durante 2 minutos en una solución a base de yodo, luego transfiéralos a una placa de Petri llena de PBS estéril.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Apertura de la bombilla<ol>
<li>Después de transferir los ojos a una placa de Petri estéril, sostenga uno firmemente cerca del nervio óptico con Colibri o forrórceps puntiagudos. Perfora un agujero cerca del límite del iris (entre pars plana y ora serrata) con una aguja de 18 G. Inserte tijeras pequeñas en el orificio y corte alrededor del iris. Retire el segmento anterior (córnea, cristalino e iris) y colórelo en una placa de Petri. Deje el bulbo con el vítreo hasta que se aíslan las células RPE.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aislamiento de células IPE<ol>
<li>Retire la lente y con fórceps finos saque delicadamente el iris que contiene las células IPE. Coloque el iris en una placa de Petri, lávelo con PBS estéril y déjelo en PBS hasta que se prepare más iris.</li>
		<li>Repita los pasos 2.2.1 a 2.3.1 para que todos los ojos estén preparados ese día.</li>
		<li>Añadir 50 μL de tripsina al 0,25% por iris e incubar durante 10 min a 37 °C. Retire la tripsina, agregue 150 μL de medio completo por iris y raspe el IPE delicadamente con una pipeta Pasteur plana pulida al fuego; use forrórceps finos para inmovilizar el tejido. Recoja la suspensión celular y colóquela en un tubo de 1,5 ml. Utilice 10 μL de la suspensión celular diluida 1:3 con azul de tripano para contar las células en la cámara de Neubauer34,35.</li>
		<li>Si no se transfecta inmediatamente, sembrar 200.000 células/pozo en una placa de 24 pozos (100.000 células/cm2) en 1 mL de medio completo (10% FBS) (para siembra ver Tabla 1). Coloque la placa en una incubadora y cultnémosla a 37 °C, 5% CO2. NOTA: Puede ser necesario agrupar varios ojos para tener suficientes células para la siembra.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aislamiento de células RPE<ol>
<li>Elimine el humor vítreo y la retina del segmento posterior con pórceps delgados. Evite dañar el epitelio pigmentario de la retina.</li>
		<li>Corta el segmento por la mitad con un bisturí #10 para tener el globo completamente abierto y lávate con PBS estéril.</li>
		<li>Añadir 50 μL de tripsina al 0,25% por ojo e incubar durante 10 min a 37 °C. Retire la tripsina y agregue 150 μL de medio completo por globo y raspe las células RPE delicadamente con un bisturí redondo; use forrórceps finos para inmovilizar el tejido. Recoja la suspensión celular y colóquela en un tubo de 1,5 ml. Tomar 10 μL de la suspensión celular; diluir 1:4 con azul de tripano para contar las células en la cámara de Neubauer.</li>
		<li>Consulte el paso 2.3.4. NOTA: Puede ser necesario agrupar varios ojos para tener suficientes células para la siembra.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Aislamiento de células de PE de conejo
<ol><li>Realice la limpieza y desinfección como se describe en los pasos 2.1 a 2.1.1.</li>
	<li>Ponga un ojo en una compresa de gasa estéril y manténgala firmemente cerca del nervio óptico. Abre el ojo con el bisturí #11 y tijeras unos 2 mm debajo del limbo. Retire el segmento anterior (córnea, cristalino e iris) y colórelo en una placa de Petri. Deje el bulbo con el vítreo hasta que se aíslan las células RPE.</li>
	<li>Aislamiento de células IPE<ol>
<li>Realice el paso 2.3.1. Retire el cuerpo ciliar del iris cortando con un bisturí # 10.</li>
		<li>Después de la preparación de 2 iris, incubar con 1 ml de tripsina al 0,25 % a 37 °C durante 10 min; durante este tiempo, las células RPE se pueden aislar (ver paso 3.4). Retire la tripsina y agregue 1 ml de medio completo al iris y aísle las células rascando cuidadosamente con una pipeta Pasteur plana pulida al fuego. Resuspenda las células cuidadosamente mediante pipeteo y transfiera la suspensión celular a un tubo de 1,5 ml. Tome 10 μL de la suspensión celular y diluya 1:3 con azul de tripano para contar las células en la cámara de Neubauer.</li>
		<li>Consulte el paso 2.3.4.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aislamiento de células RPE<ol>
<li>Realice el paso 2.4.1.</li>
		<li>Coloque una gasa estéril en una placa de 12 pozos y coloque la bombilla sobre la gasa.</li>
		<li>Lavar con PBS y realizar el paso 2.4.3. NOTA: Utilice una pipeta Pasteur curva pulida al fuego.</li>
		<li>Centrifugar las células 10 min a 120 x g.</li>
		<li>Consulte el paso 2.3.4.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Aislamiento de células de EP de cerdo
<ol><li>Realice la limpieza como se describe en el paso 2.1. Lavar con PBS y desinfectar los ojos sumergiéndonos durante 2 min en solución a base de yodo, enjuague con PBS. Continúe con el paso 3.2.</li>
	<li>Aislamiento de células IPE<ol>
<li>Realice el paso 3.3.1. Después de la preparación de 2 iris, agregue 1 ml de medio completo y aísle las células rascando cuidadosamente con una pipeta Pasteur plana pulida al fuego. Transfiera la suspensión celular a un tubo de 1,5 ml. Tome 10 μL de la suspensión celular y diluya 1:4 con azul de tripano para contar las células en la cámara de Neubauer.</li>
		<li>Consulte el paso 2.3.4.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aislamiento de células RPE<ol>
<li>Realice el paso 2.4.1. Coloque la bombilla en una placa de Petri y lávese con PBS. Llene la bombilla con 1 ml de medio completo.</li>
		<li>Usando una pipeta Pasteur curva pulida al fuego, retire cuidadosamente las celdas de RPE. Asegúrese de raspar de abajo hacia arriba para evitar deslizarse hacia abajo del complejo de membrana coroideo-Bruch. Recoja la suspensión celular dentro del bulbo con una pipeta de 1.000 μL y transfiérala a un tubo de 1,5 ml para la resuspensión. Tome 10 μL de la suspensión celular y diluya 1:8 con azul de tripano para contar las células en la cámara de Neubauer.</li>
		<li>Consulte el paso 2.3.4.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Aislamiento de células de PE bovinas
<ol><li>Realice la limpieza como se describe en el paso 2.1. Lavar con PBS y desinfectar los ojos sumergiéndonos durante 2 min en solución a base de yodo, enjuague con PBS. Continúe con el paso 3.2.</li>
	<li>Aislamiento de células IPE<ol>
<li>Realice el paso 3.3.1. Después de la preparación de dos iris, incubar con 2 ml de tripsina al 0,25% a 37 °C durante 10 min. Durante este tiempo, las células RPE se pueden aislar (ver paso 5.3).</li>
		<li>Retire la tripsina y agregue 2 ml de medio completo al iris y aísle las células rascando cuidadosamente con una pipeta Pasteur plana pulida al fuego. Transfiera la suspensión celular a un tubo de 15 ml. Centrifugar las células 10 min a 120 x g. Tome 10 μL de la suspensión celular y diluya 1:4 con azul de tripano para contar las células en la cámara de Neubauer.</li>
		<li>Si no se transfecta inmediatamente, sembrar 320.000 células/pozo en una placa de 6 pozos en 3 mL de medio completo (10% FBS) (para la siembra ver Tabla 1). Coloque la placa en una incubadora y cultnémosla a 37 °C, 5% CO2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aislamiento de células RPE<ol>
<li>Siga el paso 2.4.1. Coloque la bombilla en una placa de Petri y lávese con PBS. Después de la preparación de 2 ojos, llene el bulbo aproximadamente 3/4 con tripsina e incube durante 25 min a 37 ° C con la tapa de la placa de Petri en la parte superior del bulbi.</li>
		<li>Retire la tripsina y agregue 1 ml de medio completo. Realice el paso 4.3.2. Centrifugar las células 10 min a 120 x g.</li>
		<li>Consulte el paso 5.2.3.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Cultivo - cambio medio
<ol><li>Cultite las células en DMEM/Ham's F12, suplementado con 10% de FBS, 80 U/mL de penicilina / 80 μg/mL de estreptomicina y 2,5 μg/mL de anfotericina B, a 37°C y 5% de CO2 en una incubadora humidificada. Después de 3-4 días, pipetee hacia arriba y hacia abajo para recolectar células no adherentes y coloque la mitad del volumen en otro pozo. Llene hasta 1 ml con medio completo. NOTA: Esto permite tener una superficie lo suficientemente grande como para que todas las celdas aisladas se adhieran y maximicen la salida.</li>
	<li>Después de otros 3-4 días, repita la recolección de células, pero esta vez agrupando las células no adherentes de dos pozos en un pozo (por ejemplo, A1 + B1 en C1). Agregue medio a todos los pozos. Observe las células y cambie el medio 2 veces por semana (para placas de 6 y 24 pozos use 3 y 1 ml / pozo, respectivamente). Cuando las células alcancen la confluencia, cambie a un medio completo con 1% de FBS o use las células para experimentos (por ejemplo, transfección). NOTA: Las células RPE e IPE son confluentes después de 3-4 y 4-5 semanas después del aislamiento, respectivamente. La pureza del cultivo celular fue corroborada comprobando la morfología celular (células pigmentadas) y marcadores específicos según lo descrito por Johnen y colegas36.</li>
</ol>7. Electroporación de células primarias de PE
<ol><li>Realizar electroporación como se describe antes1,37.</li>
	<li>Dependiendo del número de células transfectadas, utilice placas de 6, 24 o 48 pozos (ver Tabla 2)para sembrar las células en medio sin antibióticos ni antimicóticos. Durante las siguientes 2 semanas, agregue gotas con medio que contenga penicilina (80 U / ml), estreptomicina (80 μg / ml) y anfotericina B (2.5 μg / ml) dos veces por semana. Cambie el medio completamente 2 semanas después de la transfección.</li>
	<li>Para determinar el crecimiento celular, la eficiencia de la transfección y la secreción de proteínas, monitoree las células semanalmente por microscopía y analice el sobrenadante de cultivo celular por western blot. Antes de finalizar el cultivo, tome un sobrenadante de cultivo celular de 24 h para cuantificar la secreción de proteínas por ELISA, contar las células, medir la fluorescencia mediante citometría basada en imágenes (en el caso de células transfectadas por Venus)siguiendo las instrucciones de los fabricantes (ver Tabla de materiales)y recolectar el pellet celular para el análisis de expresión génica basado en RT-qPCR. NOTA: Estos métodos no están incluidos en el presente trabajo ya que no es el propósito explicar en detalle el análisis de las células sino más bien su aislamiento. La densidad de siembra celular es la misma para todas las especies (100.000 células/cm2),pero debido a que el número de células aisladas varía, se utilizaron diferentes placas. Además, para ratones, ratas y conejos podría ser necesario agrupar 2-3 ojos para tener suficientes células para la siembra.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Especie</td>
			<td>Tratamiento con tripsina</td>
			<td>N° células IPE</td>
			<td>N° células RPE</td>
			<td>Placa para siembra (100.000 células/cm2)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ratón/rata</td>
			<td>Sí</td>
			<td>~50,000</td>
			<td>~150,000</td>
			<td>Placas de 24 pozos</td>
		</tr>
<tr>
<td>Conejo</td>
			<td>Sí</td>
			<td>~350,000</td>
			<td>~2,500,000</td>
			<td>Placas de 24 pozos</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cerdo</td>
			<td>No</td>
			<td>~1,000,000</td>
			<td>~3,000,000</td>
			<td>Placas de 24 pozos</td>
		</tr>
<tr>
<td>Bovino</td>
			<td>Sí</td>
			<td>~1,700,000</td>
			<td>~5,000,000</td>
			<td>Placas de 6 pozos</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: Número de células primarias de PE aisladas de ojos de diferentes especies.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Nombre</td>
			<td>Área</td>
			<td>Volumen medio</td>
			<td>Tripsina</td>
			<td>Medio de volumen para detener la acción de la tripsina</td>
			<td>Densidad de siembra</td>
		</tr>
<tr>
<td>Placa de 6 pozos</td>
			<td>9,6 cm²</td>
			<td>3,0 ml</td>
			<td>0,5 ml</td>
			<td>1,0 ml</td>
			<td>3x105
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Placa de 24 pozos</td>
			<td>2,0 cm²</td>
			<td>1,0 ml</td>
			<td>0,2 ml</td>
			<td>0,8 ml</td>
			<td>5x104
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Placa de 48 pozos</td>
			<td>1,1 cm²</td>
			<td>0,5 ml</td>
			<td>0,1 ml</td>
			<td>0,4 ml</td>
			<td>0,5-1x104
</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 2: Volúmenes de cultivo celular y densidades de siembra.

Los autores no tienen nada que revelar.

Contar con métodos estandarizados para aislar y cultivar células de EP es fundamental en el desarrollo de nuevos enfoques terapéuticos para las enfermedades degenerativas de la retina. Con los protocolos presentados aquí, las células de PE pueden aislarse con éxito de diferentes especies y cultivarse durante largos períodos (hasta ahora, el cultivo más largo se mantuvo durante 2 años1,38); se observó morfología, pigmentación y función típicas de las células de PE...

Nuestro grupo se centra en el desarrollo de enfoques regenerativos para tratar la degeneración neurorretinina, es decir, la DMAE, mediante la terapia génica no viral basada en RPE e IPE. El establecimiento preclínico de tales terapias requiere modelos in vitro transferibles a los seres humanos. Por lo tanto, el objetivo del estudio presentado aquí es entregar protocolos para el aislamiento, cultivo e ingeniería genética de células primarias de RPE e IPE. La razón para establecer el aislamiento de células de PE de múltiples especies es confirmar sólidamente la seguridad y la eficiencia del enfoque y aumentar su reproducibilidad y transferibilidad. La línea celular de EPR humano disponible ARPE-19 difiere de las células primarias (por ejemplo, están menos pigmentadas) y, por lo tanto, es de valor limitado para los análisis preclínicos1. Además, las células de mamíferos no humanos se pueden comprar a un costo menor y en mayores cantidades; el tejido de donante humano se puede obtener de varios bancos de ojos, pero la disponibilidad es limitada y costosa. Por último, los nuevos medicamentos de terapia avanzada (ATMP, es decir, células, tejidos o medicamentos de terapia génica) deben aplicarse en al menos dos especies diferentes antes de ser probados en pacientes y estos estudios in vivo solicitan la preparación de trasplantes de células alogénicas.
Las enfermedades neurodegenerativas de la retina son la principal causa de ceguera en los países industrializados, que comprenden enfermedades comunes como la DMAE, así como enfermedades raras como la retinosis pigmentaria, en la que la muerte de las células de la retina finalmente conduce a la ceguera. El daño de las células RPE, los fotorreceptores y las células ganglionares de la retina (RGC) puede en algunos casos disminuirse, pero actualmente no hay terapias curativas disponibles. Los ATMP ofrecen el potencial de corregir defectos genéticos, integrar genes terapéuticos o reemplazar células degeneradas, lo que permite el desarrollo de terapias regenerativas y curativas para enfermedades como la DMAE; 13 terapias génicas ya obtuvieron la aprobación de comercialización, incluida una terapia para tratar la degeneración retiniana asociada a la mutación RPE652,3. Entre los adultos mayores (>60 años), ~ 30 millones de personas en todo el mundo se ven afectadas por la DMAE neovascular (nvAMD) o avascular (aAMD)4. Ambas formas son inducidas por desencadenantes asociados a la edad, incluido el daño oxidativo, el deterioro de la función y la pérdida de células RPE, seguidos de la degradación de los fotorreceptores, entre otros (por ejemplo, alelos de riesgo genético, tabaquismo, hipertensión)5,6. En nvAMD, la patogénesis se ve agravada por un desequilibrio de factores angiogénicos y antiangiogénicos a favor del factor de crecimiento endotelial vascular angiogénico (VEGF) que induce la neovascularización coroidea (CNV). Hasta la fecha, solo la nvAMD es tratable mediante inyecciones intravítreas mensuales de inhibidores de la proteína VEGF para suprimir la CNV; todavía no se dispone de un tratamiento eficaz para laAAMD 6,7.
Varios estudios evaluaron las terapias basadas en células para reemplazar la terapia anti-VEGF: los estudios realizados por Binder et al., en los que se trasplantaron células autólogas de EPR recién cosechadas en pacientes con nAMD8,9,10,mostraron una mejoría visual moderada, pero solo un pequeño grupo de pacientes alcanzó una agudeza visual final lo suficientemente alta como para permitir la lectura. Recientemente, un estudio clínico de fase I utilizó un parche de ERP derivado de células madre embrionarias para tratar la DMAE con resultados prometedores; es decir, eficacia, estabilidad y seguridad del parche RPE hasta 12 meses en 2 de los 10 pacientes tratados11. Además, varios grupos han publicado estudios en los que se recolectaron parches autólogos de RPE-Bruch-coroides de la retina periférica y se trasplantaron a la mácula12,13,14; y se generaron parches de EPR derivados de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) para trasplante15. Para la AAMD, los anticuerpos dirigidos a la vía del complemento se han probado en ensayos clínicos6,16 y se completó un estudio de fase I utilizando una única inyección intravítrea de un vector viral adenoaso asociado (AAV) que codifica el gen para el factor CD59 (AAVCAGsCD59) en pacientes con atrofia geográfica (GA)17; el estudio de fase II comenzó recientemente y tiene como objetivo reclutar a 132 pacientes con AAMD avanzada y evaluar el resultado a los 2 años posteriores a la intervención18. Finalmente, el grupo de estudio FocuS ha iniciado un ensayo clínico multicéntrico de fase I/II evaluando la seguridad, dosis-respuesta y eficacia de un vector AAV no replicante recombinante que codifica un factor19del complemento humano.
Principalmente, el objetivo de una terapia de DMAE regenerativa es el trasplante de células RPE funcionales, que se dañaron o perdieron. Sin embargo, las células IPE y RPE comparten muchas similitudes funcionales y genéticas (por ejemplo, fagocitosis y metabolismo del retinol), y debido a que las células IPE se cosechan de manera más factible, se han propuesto como un sustituto de RPE20. A pesar de que se ha demostrado previamente que el trasplante de células IPE retrasa la degeneración del fotorreceptor en modelos animales21,22 y estabiliza la función visual en pacientes con nvAMD en etapa final, no se observó una mejoría significativa en estos pacientes23. La falta de eficacia puede deberse al bajo número de células trasplantadas y/o al desequilibrio de los factores neuroprotectores de la retina. Un enfoque alternativo sería trasplantar células epiteliales pigmentarias transfectadas que sobreexpresan factores neuroprotectores para restaurar la homeostasis retiniana, mantener las células RPE restantes y proteger los fotorreceptores y RGC de la degeneración. En consecuencia, proponemos una nueva terapia que comprende el trasplante de células funcionales de EPR o IPE que han sido sometidas a ingeniería genética para secretar proteínas neuroprotectoras y antiangiogénicas, como PEDF, GM-CSF o factores de crecimiento similares a la insulina (IGF). La ventaja de desarrollar y analizar este enfoque en varias especies en lugar de utilizar una línea celular, una sola especie, o tejido humano es: 1) mayor reproducibilidad y transferibilidad de los resultados como lo demuestran numerosos estudios realizados en laboratorios independientes y diferentes especies1,24,25; 2) las células de cerdo o bovino son factiblemente desechables sin el sacrificio de animales adicionales; 3) la disponibilidad de células especialmente porcinas y bovinas permite que grandes series de ensayos produzcan resultados sólidos; 4) el conocimiento para aislar, cultivar y modificar genéticamente células a partir de los modelos más utilizados permite realizar análisis in vivo en múltiples especies24,25,26 y,por lo tanto, ofrece una mejor relación riesgo-beneficio para los primeros pacientes tratados; 5) la flexibilidad del protocolo presentado permite su uso en diversos modelos y conjuntos experimentales y para todas las terapias basadas en células oculares con y sin ingeniería genética. Por el contrario, las técnicas alternativas como las líneas celulares o el tejido humano son solo de transferibilidad limitada y / o desechabilidad limitada. Las líneas celulares como el ARPE-19 son ideales para experimentos preliminares; sin embargo, la baja pigmentación y la alta proliferación difieren significativamente de las células primarias1. Las células RPE e IPE, que se aíslan del tejido de donantes humanos, ofrecen una fuente valiosa para experimentos in vitro transferibles; sin embargo, obtenemos tejido humano de un banco de ojos estadounidense, lo que significa que el tejido tiene al menos dos días de edad (después de la enucleación) y requiere un transporte largo y costoso, pero el tejido del donante local no está disponible en cantidades suficientes para una investigación productiva. La ventaja del uso de células primarias es confirmada por múltiples estudios de otros grupos27,28.
Para el desarrollo de una terapia génica no viral basada en células utilizando el sistema de transposones SB100X para transfectar células primarias de RPE e IPE con los genes que codifican para PEDF y / o GM-CSF para tratar nvAMD y aAMD, respectivamente29,30,31,32, primero establecimos la transfección de células ARPE-191 . A continuación, se establecieron los protocolos de aislamiento y transfección en células primarias bovinas y porcinas de fácil acceso. Ahora, se ha establecido el aislamiento y la transfección de células primarias de RPE e IPE de cinco especies diferentes, desde pequeños (como ratones) hasta grandes mamíferos (como ganado). Se confirmó en células primarias de RPE e IPE derivadas de ojos de donantes humanos30. La producción del ATMP conforme a las Buenas Prácticas de Fabricación (GMP) se validó utilizando también tejido de donante humano33. Finalmente, tanto la seguridad como la eficiencia del enfoque se evaluaron in vivo en tres especies diferentes para las que se ha adaptado el protocolo: ratón, rata y conejo. En la configuración clínica, se extraerá una biopsia de iris del paciente y las células IPE se aislarán y transfectarán en la sala limpia, antes de que las células se trasplanten subretinalmente al mismo paciente. Todo el proceso se llevará a cabo durante una sola sesión quirúrgica que dura aproximadamente 60 minutos. El desarrollo del enfoque de tratamiento y la evaluación de su eficiencia solicitaron excelentes modelos in vitro y ex vivo para implementar métodos de administración de genes robustos y eficientes, para analizar la eficiencia de la entrega de genes, la producción terapéutica de proteínas y los efectos neuroprotectores, y para producir trasplantes celulares para probar el enfoque in vivo1,24,25,29,30 . Cabe mencionar que la terapia cuenta con la aprobación ética para un ensayo de fase clínica Ib/IIa de la comisión ética para la investigación del Cantón de Ginebra (nº 2019-00250) y actualmente los últimos datos preclínicos solicitados para su autorización por las autoridades reguladoras suizas se recopilan utilizando el protocolo presentado. En este sentido, los datos preclínicos in vivo demostraron una reducción significativa de la NVC y una excelente seguridad24,25,31.
Aquí, se describe el aislamiento y cultivo de células RPE / IPE de bovinos, cerdos, conejos, ratas y ratones, y el uso del sistema integrador de transposones SB100X combinado con electroporación como un método eficiente de administración de genes. En particular, las células primarias de PE se transfectaron para sobreexpresar PEDF y GM-CSF. La recogida de estos protocolos permite realizar los estudios in vitro e in vivo en todas las fases preclínicas del desarrollo de ATMP. Además, la configuración tiene el potencial de adaptarse a otros genes de interés y enfermedades.

<table><tbody><tr><td>Placas de 12 pocillos</td><td>Corning</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 24 pocillos</td><td>Corning</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>placas de 48 pocillos</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>150687</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 6 pocillos</td><td>Greiner</td><td>7657160</td><td></td></tr><tr><td>Betadine</td><td>Mundipharma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bonn micro pinzas planas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinzas Colibri (estériles)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CytoTox-Glo Ensayo de citotoxicidad</td><td>Promega</td><td>G9291</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/Ham's F12</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8062</td><td></td></tr><tr><td>Paño (estéril)</td><td>M&ouml; lnlycke Health Care</td><td>800530</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de electroporación 3P.14</td><td>3P Pharmaceutical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Brunschwig</td><td>P40-37500</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas (diferentes tamaños) (estériles)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Compresa de gasa</td><td>PROMEDICAL AG</td><td>25403</td><td></td></tr><tr><td>NaCl (0.9%)</td><td>Laboratorium Dr. Bichsel AG</td><td>1000090</td><td></td></tr><tr><td>Aguja (18G)&nbsp;</td><td>Terumo</td><td>TER-NN1838R</td><td></td></tr><tr><td>Kit de transfección de neón 10 y micro; L</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MPK1096</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de transfección de neón</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MPK5000S</td><td></td></tr><tr><td>Cámara de Neubauer</td><td>Marienfeld-superior</td><td>640010</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta Pasteur (pulido al fuego)</td><td>Witeg</td><td>4100150</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0781-100</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital (Thiopental Inresa)</td><td>Ospedalia AG</td><td>31408025</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>150288</td><td></td></tr><tr><td>pFAR4-PEDF</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pFAR4-SB100X</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pFAR4-Venus</td><td></td><td></td><td>Pastor et al., 2018. Amablemente proporcionado por el Prof. Scherman y la Prof. Marie</td></tr><tr><td>pSB100X (250 ng/&micro; L)</td><td></td><td></td><td>M&aacute; t&eacute; S et al., 2009. Proporcionado por el Prof. Izsvak</td></tr><tr><td>pT2-CAGGS-Venus</td><td></td><td></td><td>Johnen et al., 2012</td></tr><tr><td>pT2-CMV-GMCSF-His ADN plásmido (250 ng/&micro; L)</td><td></td><td></td> <td>Clonado en nuestro laboratorio</td></tr><tr><td>pT2-CMV-PEDF-Su ADN plasmídico (250 ng/&micro; L)</td><td></td><td></td><td>Pastor et al., 2018</td></tr><tr><td>escarpel n.º 10</td><td>Swann-Morton</td><td>501</td><td></td></tr><tr><td>escarpel n.º 11</td><td>Swann-Morton</td><td>503</td><td></td></tr><tr><td>Punta afilada-afilada curvada Tijeras Bonn extrafinas (estériles)&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Punta afilada-afilada recta Tijeras Bonn extrafinas (estériles)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tali Citómetro basado en imágenes</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>T10796</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina 0,25%&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25050014</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina 5%/EDTA 2%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4174</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de resorte Vannas curvadas (estériles)</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

aislamiento, cultivo e ingeniería genética de células epiteliales de pigmento primario de mamíferos para terapia génica no viral

Isolation, Culture, and Genetic Engineering of Mammalian Primary Pigment Epithelial Cells for Non-Viral Gene Therapy

La degeneración macular relacionada con la edad (DMAE) es la causa más frecuente de ceguera en pacientes >60 años, afectando a ~ 30 millones de personas en todo el mundo. La DMAE es una enfermedad multifactorial influenciada por factores ambientales y genéticos, que conducen a un deterioro funcional de la retina debido a la degeneración de las células epiteliales pigmentarias de la retina (EPR) seguida de la degradación de los fotorreceptores. Un tratamiento ideal incluiría el trasplante de células RPE sanas que secretan factores neuroprotectores para prevenir la muerte celular RPE y la degeneración de los fotorreceptores. Debido a las similitudes funcionales y genéticas y la posibilidad de una biopsia menos invasiva, se propuso el trasplante de células epiteliales pigmentarias del iris (IPE) como sustituto del EPR degenerado. La secreción de factores neuroprotectores por un bajo número de células trasplantadas subretinalmente se puede lograr mediante la transfección mediada por transposón de la Bella Durmiente (SB100X)con genes que codifican para el factor derivado del epitelio pigmentario (PEDF) y / o el factor estimulante de colonias de macrófagos granulocitos (GM-CSF). Establecimos el aislamiento, el cultivo y la transfección mediada por SB100Xde células RPE e IPE de varias especies, incluidos roedores, cerdos y ganado. Se explantan globos y se extrae la córnea y el cristalino para acceder al iris y la retina. Usando una espátula hecha a medida, las células IPE se eliminan del iris aislado. Para cosechar células RPE, se puede requerir una incubación de tripsina, dependiendo de la especie. Luego, usando espátula personalizada por RPE, las células se suspenden en medio. Después de la siembra, las células son monitoreadas dos veces por semana y, después de llegar a la confluencia, transfectadas por electroporación. La integración génica, la expresión, la secreción de proteínas y la función se confirmaron mediante ensayos qPCR, WB, ELISA, inmunofluorescencia y funcionales. Dependiendo de la especie, se pueden aislar 30.000-5 millones (RPE) y 10.000-1,5 millones de células (IPE) por ojo. Las células modificadas genéticamente muestran una sobreexpresión significativa de PEDF/GM-CSF con la capacidad de reducir el estrés oxidativo y ofrece un sistema flexible para análisis ex vivo y estudios in vivo transferibles a humanos para desarrollar enfoques de terapia génica ocular.

Aislamiento de EP de diferentes especies de mamíferos Utilizando los protocolos antes mencionados, las células IPE y RPE se aislaron y cultivaron con éxito de cinco especies diferentes. El número de células obtenidas de cada procedimiento depende de la especie y el tamaño del ojo (Tabla 1). Como se muestra en la Figura 1,las células muestran la morfología y pigmentación típica de las células de PE (a excepción de las células de conejo mostradas, derivadas...

Aquí, se presenta un protocolo para aislar y transfectar el iris primario y las células epiteliales pigmentarias de la retina de varios mamíferos (ratones, ratas, conejos, cerdos y bovinos). El método es ideal para estudiar los enfoques de terapia génica ocular en varias instalaciones para análisis ex vivo y estudios in vivo transferibles a humanos.

Aislamiento, cultivo e ingeniería genética de células epiteliales de pigmento primario de mamíferos para terapia génica no viral

Age-related macular degeneration (AMD) is the most frequent cause of blindness in patients &#62;60 years, affecting ~30 million people worldwide. AMD is a ...

El protocolo es significativo ya que muestra el aislamiento y la transfección de células epiteliales pigmentarias de cinco mamíferos como un sistema óptimo para estudiar la terapia génica ocular en diversas configuraciones. La principal ventaja de este método es su flexibilidad, transferibilidad, alto rendimiento celular, viabilidad y tasa de transfección debido a las cinco especies y al sistema de transposones SB100X no viral utilizado. Estas técnicas se han desarrollado para estudiar enfoques de terapia génica dirigidos a las células epiteliales pigmentarias de la retina y el iris, que están aisladas y transfectadas en el presente protocolo, pero que son utilizables para cualquier investigación ocular.Demostrando el procedimiento estará Gregg Sealy, un técnico del laboratorio. Después de la eutanasia del animal, use tijeras curvas y pórceps Colibri para enuclear los ojos, luego limpie el tejido muscular restante y la piel de los ojos. Recoja los ojos en un tubo de 50 mililitros lleno de PBS no estéril y transfiera el tubo a la campana de flujo laminar.Desinfecte sumergiéndolos en una solución a base de yodo durante dos minutos, luego transfiera los ojos a un tubo de 50 mililitros lleno de PBS estéril. Ponga un ojo en una compresa de gasa estéril y sostenga firmemente el ojo cerca del nervio óptico. Luego corte cerca del límite del iris con un bisturí número 11.Usando tijeras, corte alrededor del iris y retire el segmento anterior y colórelo en una placa de Petri, dejando el bulbo con el vítreo hasta que se aísle el epitelio pigmentario de la retina, o células RPE. Para aislar el epitelial pigmentario del iris, o células IPE, retire la lente con fórceps finos y extraiga delicadamente el iris que contiene las células IPE. Coloque el iris en una placa de Petri y lávelo con PBS estéril.Agregue 500 microlitros de tripsina al 0.25% e incube durante 10 minutos a 37 grados centígrados. Retire la tripsina, agregue 500 microlitros de medio completo y raspe el IPE delicadamente con una pipeta Pasteur plana y pulida al fuego. Recoja la suspensión celular y colóquela en un tubo de 1,5 mililitros.Cuente las células usando la cámara de Neubauer y sise 0.2 millones de células por pozo en una placa de 24 pozos con un mililitro de medio completo. Coloque la placa en una incubadora y cultíquela a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Para aislar las células RPE, retire el humor vítreo y la retina del segmento posterior con forrórceps delgados.Coloque los bulbos en la placa de 24 pozos y agregue 500 microlitros de tripsina al 0.25% por ojo e incube durante 10 minutos a 37 grados centígrados. Retire la tripsina, agregue 500 microlitros de medio completo por globo y raspe las células de RPE delicadamente con una pipeta Pasteur curva y pulida al fuego. Recoja la suspensión celular y colóquela en un tubo de 1,5 mililitros.Cuente las células usando la cámara de Neubauer y semble las células como se describió anteriormente. Coloque la placa en la incubadora. Limpie el tejido muscular restante y la piel de los ojos y desinfecte los ojos en una solución a base de yodo y enjuáguelos con PBS.Para aislar las células IPE, retire la lente y extraiga el iris como se describió anteriormente. Después de preparar dos iris, agregue un mililitro de medio completo y aísle las células rascando con una pipeta Pasteur plana y pulida al fuego, luego cuente y seme las células. Coloque la placa en la incubadora.Para aislar las células RPE, retire el vítreo y la retina del segmento posterior y coloque el bulbo en una placa de Petri. Llene la bombilla con un medio completo de mililitros. Con una pipeta Pasteur curva y pulida al fuego, retire las celdas de RPE.Recoja la suspensión celular dentro de la bombilla con una pipeta de 1.000 microlitros y transfiérala a un tubo de 1,5 mililitros para su resuspensión. Luego cuente y sese las células e incube la placa como se demostró anteriormente. Después de la limpieza, abra el ojo y corte alrededor del iris para eliminar el segmento anterior, luego coloque una placa de Petri.Deje el bulbo con el vítreo hasta que se aíslan las células RPE. Para aislar las células IPE, si la lente viene con el segmento anterior, retire la lente y use fórceps finos para extraer delicadamente el iris que contiene las células IPE. Coloque el iris en una placa de Petri y lávelo con PBS estéril.Cortar el cuerpo ciliar con un bisturí número 10. Después de preparar los iris, incube con dos mililitros de tripsina al 0,25% a 37 grados centígrados durante 10 minutos. Retire la tripsina y agregue dos mililitros de medio completo, luego aísle las células rascando con una pipeta Pasteur plana y pulida al fuego.Transfiera la suspensión celular a un tubo de dos mililitros y centrifute las células durante 10 minutos a 120 veces G.Deseche el sobrenadante y vuelva a colocar las células en dos mililitros de medio completo. Seed 0,32 millones de células por pozo en una placa de seis pozos en tres mililitros de medio completo. Coloque la placa en una incubadora y cultíquela a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono.Para aislar las células RPE, retire el humor vítreo y la retina del segmento posterior con pórceps. Evite dañar el epitelio pigmentario de la retina. Lave la bombilla con PBS.Después de preparar ambos ojos, llene el bulbo aproximadamente tres cuartos llenos de tripsina e incube durante 25 minutos a 37 grados centígrados con la tapa de la placa de Petri en la parte superior del ojo del bulbo. Retire la tripsina y agregue un mililitro de medio completo. Con una pipeta Pasteur curva y pulida al fuego, retire las celdas de RPE.Recoja la suspensión celular dentro de la bombilla y transfiérala a un tubo de 1,5 mililitros para su resuspensión. Centrifugar las células durante 10 minutos a 120 veces G.Seed 0.32 millones de células por pozo en una placa de seis pozos en tres mililitros de medio completo. Coloque la placa en una incubadora y cultíquela a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono.Culta las células a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono en una incubadora humidificada. Después de tres o cuatro días, pipetee hacia arriba y hacia abajo para recolectar células no adherentes y coloque la mitad del volumen en otro pozo. Llene el pozo a un mililitro con medio completo.Después de otros tres o cuatro días, repita la recolección de células, esta vez agrupando las células no adherentes de dos pozos en uno. Agregue medio a todos los pozos. Observe las células y cambie el medio dos veces por semana.Cuando las células alcancen la confluencia, cambie a un medio completo con 1% FBS. Utilizando los protocolos antes mencionados, las células IPE y RPE se aislaron y cultivaron con éxito de cinco especies diferentes. El patrón de expresión de RPE se confirmó en células IPE bovinas primarias por inmunofluorescencia para RPE65.Se estudió la viabilidad celular para excluir una toxicidad potencial del tampón de electroporación utilizando un kit de ensayo de citotoxicidad disponible comercialmente y un control electroporado de nudo. No se observó impacto en la viabilidad celular. Las células epiteliales pigmentarias precultivadas de diferentes especies fueron transfectadas con la proteína amarilla fluorescente venusna.Se utilizaron células RPE19 transfectadas como control positivo. La cuantificación de la eficiencia de transfección en RPE de cerdo precultivo se muestra aquí. Las células epiteliales pigmentarias de conejo recién aisladas fueron transfectadas con la proteína fluorescente amarilla Venus y fueron monitoreadas por microscopía.Las células epiteliales pigmentarias fueron transfectadas con factor derivado del epitelio pigmentario y la secreción de proteínas fue monitoreada por Western blot. La señal para las células transfectadas fue mayor en comparación con las células no transfectadas para todas las especies y días estudiados, y no se observó una disminución en la secreción de proteínas dentro de este tiempo. Es crucial evitar raspar las células con herramientas afiladas.Aquí, se utilizan pipetas Pasteur pulidas al fuego, excepto en pequeños ojos de ratón, donde se debe usar un bisturí redondo. Las células epiteliales pigmentarias se pueden utilizar para desarrollar enfoques de terapia génica y para simular condiciones patológicas, por ejemplo, el daño por estrés oxidativo. Estos modelos también se pueden utilizar para probar fármacos terapéuticos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

En este video, mostramos un procedimiento para obtener células epiteliales pigmentarias oculares a partir de un modelo de conejo. Las células son útiles en el desarrollo de estrategias terapéuticas para las enfermedades degenerativas de la retina.

Aislamiento de células IPE y RPE: una técnica para obtener células epiteliales pigmentarias oculares a partir de ojo de conejo

En este video describimos una técnica para aislar el iris y las células epiteliales del pigmento de la retina de ojos porcinos para obtener sus cultivos primarios para estudios in vivo y ex vivo. Estas células pigmentarias podrían modificarse genéticamente para estudiar enfoques regenerativos para tratar los trastornos oculares.

Aislamiento de células IPE y EPR: una técnica para obtener células epiteliales pigmentadas a partir de ojo porcino aislado

Este video muestra el procedimiento para aislar las células epiteliales pigmentarias de la retina, o EPR, y las células epiteliales pigmentarias del iris, o IPE, de ojos bovinos cosechados. Las células aisladas se pueden cultivar para estudiar su papel en el tratamiento de enfermedades oculares.

Aislamiento de células EPR e IPE del ojo bovino: un procedimiento para cosechar y cultivar células epiteliales de pigmento primario bovino

Cultivos de células de la retina de embriones de pollo constituyen herramientas valiosas para el estudio de la biología de los fotorreceptores. Hemos desarrollado una técnica de transferencia de genes eficiente, basado en ex ovo plásmido electroporación de las retinas antes del cultivo. Esta técnica aumenta considerablemente la eficiencia de transfección a través de protocolos disponibles en la actualidad, lo que hace posible la manipulación genética para este sistema.

Transferencia génica eficaz en polluelo retinas para estudios de cultivo celular primario: Un Ex-ovo Enfoque electroporación

Hemos desarrollado un protocolo para transfectar células epiteliales pigmentarias humanas primarias por electroporación con el gen que codifica el factor derivado del epitelio pigmentario (PEDF) utilizando el sistema de transposones de la Bella Durmiente (SB). La transfección exitosa se demostró mediante reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa (qPCR), inmunotransferencia y ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA).

Modificación genética basada en electroporación de células epiteliales pigmentarias humanas primarias utilizando el sistema de transposones de la Bella Durmiente

Este manuscrito describe un protocolo simplificado para el aislamiento de las células del epitelio pigmentado de la retina (EPR) de los ojos de ratón de una manera gradual. El protocolo incluye la enucleación y disección de los ojos del ratón, seguida del aislamiento, la siembra y el cultivo de células del EPR.

Aislamiento de células primarias del epitelio pigmentado de la retina del ratón

Aquí, se presenta un método fácil de seguir para cultivar células epiteliales pigmentarias primarias de la retina porcina in vitro .

Cultivo primario de células epiteliales pigmentarias de la retina porcina

Describimos un método simple y eficiente para aislar células del epitelio pigmentario de la retina (EPR) de los ojos de conejillos de indias pigmentados jóvenes. Este procedimiento permite realizar estudios de biología molecular de seguimiento en el EPR aislado, incluidos los análisis de expresión génica.

Aislamiento de células epiteliales pigmentarias de la retina de ojos de conejillo de indias

Este protocolo describe el procedimiento para obtener y cultivar células epiteliales pigmentarias primarias de la retina (EPR) a partir de ojos porcinos de origen local. Estas células sirven como una alternativa de alta calidad a las células madre y son adecuadas para la investigación in vitro de la retina.

Aislamiento de células epiteliales pigmentarias primarias de la retina porcina para modelado in vitro

El epitelio pigmentario de la retina (EPR) actúa como una barrera crucial entre la coroides y la retina, promoviendo la salud y la función de los tipos de células de la retina, como los fotorreceptores. En este trabajo se describe un protocolo sencillo y eficaz para el aislamiento y cultivo de EPR murino adulto.

Un método simplificado para el aislamiento y cultivo de células epiteliales pigmentarias de la retina de ratones adultos

Aprende a aislar y cultivar células epiteliales de pigmento primario de mamíferos para terapia génica ocular no viral. Este protocolo flexible utiliza cinco especies y el sistema SB100X con alta viabilidad celular.

Aislamiento, cultivo e ingeniería genética de células epiteliales de pigmento primario de mamíferos para terapia génica no viral (Video) | JoVE Journal

Aislamiento, cultivo e ingeniería genética de células epiteliales de pigmento primario de mamíferos para terapia génica no viral

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