Name: Inyección viral estereotáxica e implantación de lentes de índice de gradiente para imágenes de calcio in vivo en el cerebro profundo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: Aprende a realizar inyección viral estereotáxica e implantación de lentes GRIN para imagen de calcio in vivo en cerebro profundo de ratones. Este protocolo permite registrar la actividad neuronal a gran escala en animales en comportamiento libre.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabajo está respaldado por subvenciones del Instituto Nacional de Salud (NIH) 5P20GM121310, R61NS115161 y UG3NS115608.

<ol><li>Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling.</a> Cell. 131 (6), 1047-1058 (2007).</li>
<li>Brini, M., Cali, T., Ottolini, D., Carafoli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+calcium+signaling%3A+function+and+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Neuronal calcium signaling: function and dysfunction.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (15), 2787-2814 (2014).</li>
<li>Chen, T. W., Li, N., Daie, K., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Map+of+Anticipatory+Activity+in+Mouse+Motor+Cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A Map of Anticipatory Activity in Mouse Motor Cortex.</a> Neuron. 94 (4), 866-879 (2017).</li>
<li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li>
<li>Komiyama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning-related+fine-scale+specificity+imaged+in+motor+cortex+circuits+of+behaving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Learning-related fine-scale specificity imaged in motor cortex circuits of behaving mice.</a> Nature. 464 (7292), 1182-1186 (2010).</li>
<li>Peters, A. J., Lee, J., Hedrick, N. G., O'Neil, K., Komiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reorganization+of+corticospinal+output+during+motor+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Reorganization of corticospinal output during motor learning.</a> Nature Neuroscience. 20 (8), 1133-1141 (2017).</li>
<li>Barbera, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+compact+neural+clusters+in+the+dorsal+striatum+encode+locomotion+relevant+information%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Spatially compact neural clusters in the dorsal striatum encode locomotion relevant information.</a> Neuron. 92 (1), 202-213 (2016).</li>
<li>Cai, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+shared+neural+ensemble+links+distinct+contextual+memories+encoded+close+in+time%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A shared neural ensemble links distinct contextual memories encoded close in time.</a> Nature. 534 (7605), 115-118 (2016).</li>
<li>de Groot, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NINscope%2C+a+versatile+miniscope+for+multi-region+circuit+investigations%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">NINscope, a versatile miniscope for multi-region circuit investigations.</a> Elife. 9, 49987(2020).</li>
<li>Ghosh, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniaturized+integration+of+a+fluorescence+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Miniaturized integration of a fluorescence microscope.</a> Nature Methods. 8 (10), 871-878 (2011).</li>
<li>Jacob, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+compact+head-mounted+endoscope+for+in+vivo+calcium+imaging+in+freely+behaving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A compact head-mounted endoscope for in vivo calcium imaging in freely behaving mice.</a> Current Protocols in Neuroscience. 84 (1), 51(2018).</li>
<li>Liang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+and+Dynamic+ON+and+OFF+neural+ensembles+in+the+prefrontal+cortex+code+social+exploration%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Distinct and Dynamic ON and OFF neural ensembles in the prefrontal cortex code social exploration.</a> Neuron. 100 (3), 700-714 (2018).</li>
<li>Liberti, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unstable+neurons+underlie+a+stable+learned+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Unstable neurons underlie a stable learned behavior.</a> Nature Neuroscience. 19 (12), 1665-1671 (2016).</li>
<li>Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+two-photon+calcium+imaging+of+neuronal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (12), 7319-7324 (2003).</li>
<li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li>
<li>Miyawaki, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+indicators+for+Ca2%2B+based+on+green+fluorescent+proteins+and+calmodulin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin.</a> Nature. 388 (6645), 882-887 (1997).</li>
<li>Bassett, J. J., Monteith, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+calcium+indicators+as+probes+to+assess+the+role+of+calcium+channels+in+disease+and+for+high-throughput+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded calcium indicators as probes to assess the role of calcium channels in disease and for high-throughput drug discovery.</a> Advances in Pharmacology. 79, 141-171 (2017).</li>
<li>Lin, M. Z., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+indicators+of+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded indicators of neuronal activity.</a> Nature Neuroscience. 19 (9), 1142-1153 (2016).</li>
<li>Tian, L., Akerboom, J., Schreiter, E. R., Looger, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+activity+imaging+with+genetically+encoded+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Neural activity imaging with genetically encoded calcium indicators.</a> Progress in Brain Research. 196, 79-94 (2012).</li>
<li>Moore, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gradient-index+optics%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Optics%22%5BJournal%5D)">Gradient-index optics: A review.</a> Applied Optics. 19 (7), 1035-1038 (1980).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniscope+GRIN+Lens+System+for+Calcium+Imaging+of+Neuronal+Activity+from+Deep+Brain+Structures+in+Behaving+Animals%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Miniscope GRIN Lens System for Calcium Imaging of Neuronal Activity from Deep Brain Structures in Behaving Animals.</a> Current Protocols in Neuroscience. 86 (1), 56(2019).</li>
<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+two-step+GRIN+lens+coating+for+in+vivo+brain+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Bulletin%22%5BJournal%5D)">A two-step GRIN lens coating for in vivo brain imaging.</a> Neuroscience Bulletin. 35 (3), 419-424 (2019).</li>
<li>Liang, B., Zhang, L., Moffitt, C., Li, Y., Lin, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+open-source+automated+surgical+instrument+for+microendoscope+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">An open-source automated surgical instrument for microendoscope implantation.</a> Journal of Neuroscience Methods. 311, 83-88 (2019).</li>
<li>Giovannucci, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CaImAn+an+open+source+tool+for+scalable+calcium+imaging+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis.</a> Elife. 8, 38173(2019).</li>
<li>Barbera, G., Liang, B., Zhang, L., Li, Y., Lin, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+wireless+miniScope+for+deep+brain+imaging+in+freely+moving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A wireless miniScope for deep brain imaging in freely moving mice.</a> Journal of Neuroscience Methods. 323, 56-60 (2019).</li>
<li>Shuman, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breakdown+of+spatial+coding+and+interneuron+synchronization+in+epileptic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Breakdown of spatial coding and interneuron synchronization in epileptic mice.</a> Nature Neuroscience. 23 (2), 229-238 (2020).</li>
<li>Werner, C. T., Williams, C. J., Fermelia, M. R., Lin, D. T., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circuit+mechanisms+of+neurodegenerative+diseases%3A+A+new+frontier+with+miniature+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Circuit mechanisms of neurodegenerative diseases: A new frontier with miniature fluorescence microscopy.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, 1174(2019).</li>
<li>Brault, V., Besson, V., Magnol, L., Duchon, A., Herault, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cre%2FloxP-mediated+chromosome+engineering+of+the+mouse+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Handbook+of+Experimental+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Cre/loxP-mediated chromosome engineering of the mouse genome.</a> Handbook of Experimental Pharmacology. (178), 29-48 (2007).</li>
<li>McLellan, M. A., Rosenthal, N. A., Pinto, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cre-loxP-mediated+recombination%3A+General+principles+and+experimental+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Mouse+Biology%22%5BJournal%5D)">Cre-loxP-mediated recombination: General principles and experimental considerations.</a> Current Protocols in Mouse Biology. 7 (1), 1-12 (2017).</li>
</ol>

Los autores informan que no hay intereses financieros en competencia.

Una pregunta central en neurociencia es comprender cómo las dinámicas y los circuitos neuronales codifican y almacenan información, y cómo se alteran en las enfermedades cerebrales. Utilizando un sistema de imágenes Ca2+ in vivo miniscopio, la actividad neuronal individual de varios cientos de neuronas dentro de un microcircuito local puede ser monitoreada simultáneamente desde un animal que se comporta libremente. Aquí, se describe un protocolo de cirugía detallado para la inyección viral y la implantación de lentes GRIN para preparar a los roedores para un cerebro profundo in vivo Ca2 + imágenes a través de un sistema de grabación de miniscopio desarrollado a medida. La Tabla 1 muestra las comparaciones de nuestro sistema de miniscopio con otros sistemas de miniscopio disponibles comercialmente y personalizados 7,8,9,10,11,13,25,26. Vale la pena señalar que la implantación de lentes GRIN utilizando el protocolo quirúrgico actual es compatible con cualquier sistema comercial o personalizado de imágenes de un solo fotón y dos fotones para un cerebro profundo con imágenes de calcio in vivo.
Desde la inyección viral hasta la adquisición de datos de imágenes de calcio in vivo del miniscopio, todo el procedimiento experimental tarda al menos 2 meses en completarse. Es un proceso complicado y laborioso. El éxito final del experimento depende de múltiples factores, incluida la elección adecuada de gecoci, la inyección de virus con precisión en el área cerebral objetivo, la expresión viral suficiente en la población neuronal deseada, la implantación de la lente GRIN precisamente en la ubicación deseada, la recuperación adecuada de las cirugías, así como, si se produce una inflamación grave después de la cirugía y si el comportamiento del animal se ve gravemente afectado por las cirugías. y así sucesivamente.
Dos pasos críticos incluyen la inyección estereotáxica del virus y la implantación de lentes GRIN. Para el propósito de demostración, la microinyección estereotáxica se realizó en el mPFC de ratón, con el virus adenoasociado (AAV1) codificando GCaMP6f bajo el control del promotor CaMKII que etiqueta selectivamente las neuronas piramidales en el mPFC. Se eligió GCaMP6f ya que es uno de los indicadores de calcio más rápidos y sensibles con un tiempo de descomposición de la mitad de 71 ms15. Además, la expresión viral AAV de GCaMP6f es duradera (es decir, varios meses), por lo que es ideal para realizar imágenes repetitivas in vivo de Ca2+ durante un largo período para estudios longitudinales en modelos de ratón de enfermedades neurodegenerativas27. El protocolo de cirugía actual se puede adaptar para dirigirse a diferentes poblaciones celulares en cualquier otra región del cerebro. Varias herramientas virales disponibles permiten el etiquetado selectivo de poblaciones neuronales específicas en la región cerebral deseada a la edad deseada. Además, los investigadores pueden aprovechar el sistema de recombinación Cre-LoxP y varios modelos de ratones transgénicos disponibles para llevar a cabo modificaciones genéticas y estudiar el resultado de los circuitos conductuales y neuronales28,29.
Una característica única del protocolo presentado es que la aspiración automatizada de tejido cerebral capa por capa se realizó antes de la implantación de la lente GRIN (1 mm de diámetro). Esto se logra a través de una aguja de 27 G conectada a un sistema de vacío, controlado por un brazo robótico personalizado y un software23. Según nuestra experiencia, este método genera una superficie uniforme para que la lente GRIN entre en contacto y causa menos daño al tejido vecino que la aspiración manual de tejido23. Por esta razón, este procedimiento aporta una ventaja obvia para las lentes GRIN con un diámetro relativamente más amplio (por ejemplo, 1 mm). Sin embargo, la aspiración de tejido puede no ser necesaria para implantar una lente GRIN con un diámetro más pequeño (0,5 mm o 0,25 mm). En su lugar, se puede plantar directamente a lo largo de la pista principal hecha con una aguja de 30 G21.
Además de los dos pasos críticos discutidos anteriormente, muchos otros factores deben considerarse cuidadosamente para una operación exitosa. (1) Todos los instrumentos que entran en contacto con el cerebro deben ser esterilizados para prevenir la infección. (2) Todos los pasos de la cirugía deben realizarse para minimizar el daño al cerebro para prevenir una mayor inflamación y la formación excesiva de tejido cicatricial. (3) Las dosis de anestesia administradas inicialmente y mantenidas durante la cirugía, especialmente las administradas por vía intraperitoneal, deben considerarse cuidadosamente. Las dosis de anestesia pueden modificarse de acuerdo con diferentes cepas de ratón, ya que algunas pueden ser más susceptibles. (4) La condición del ratón debe ser monitoreada constantemente durante la cirugía. Por último, (5) los ratones necesitan ser monitoreados regularmente después de la cirugía, ya que pueden ocurrir muchas complicaciones después de la cirugía.
Aunque un trozo de tejido cerebral se extrae unilateralmente durante la etapa de implantación de la lente GRIN, no observamos ningún déficit de comportamiento obvio 7,12. El peso del miniscopio es de alrededor de 2 gramos y el cable está diseñado a medida para hacerlo ligero y para garantizar que el mouse pueda transportarlo fácilmente. El miniscopio y el cable solo se conectan al animal antes de la obtención de imágenes in vivo y se separan después de la imagen. Todo el proceso de obtención de imágenes generalmente no toma más de 30 minutos. Por lo tanto, estas instrumentaciones no impiden que el ratón se comporte libremente. Los pasos de instalación y desinstalación del miniscopio necesitan una anestesia breve (menos de 2 minutos) con isoflurano con el fin de restringir a los animales. Por lo general, dejamos que el ratón se recupere de la breve exposición de isoflurano durante 30 minutos antes de realizar imágenes in vivo. Hemos realizado imágenes de calcio miniscopio in vivo una vez por semana durante unas semanas sin notar ningún impacto en la salud del ratón y el comportamiento social del ratón12.
Una limitación importante del sistema de grabación de miniscopio actual es la necesidad de conectar el microscopio a un cable para la adquisición de datos. La presencia del cable a veces restringe el rendimiento de la tarea del mouse y limita la grabación de un animal a la vez. Recientemente, se ha desarrollado un miniscopio inalámbrico25,26. Esto ampliará el rendimiento de la tarea y permitirá imágenes simultáneas in vivo de múltiples animales en un grupo. Además, el desarrollo de GECI más sensibles con longitudes de onda espectralmente separables combinadas con un miniscopio de doble color ofrecerá posibilidades más emocionantes para la investigación en neurociencia.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63049">Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging</a>. The Discussion&#160;was&#160;updated.
The following paragraph was added to the end of the Discussion:
Although a chunk of brain tissue is removed unilaterally during the GRIN lens implantation step, we did not observe any obvious behavior deficits7,12. The weight of the miniscope is around 2 grams and the cable is custom-designed to make it light and to ensure that the mouse can easily carry it. The miniscope and cable are only attached to the animal prior to in vivo imaging and detached after imaging. The entire imaging process usually takes no longer than 30 minutes. Therefore, these instrumentations do not prevent the mouse from freely behaving. The miniscope installation and deinstallation steps need a brief anesthesia (less than 2 minutes) with isoflurane for the purpose of animal restraining. We typically let the mouse recover from the brief exposure of isoflurane for 30 minutes before performing in vivo imaging. We have performed miniscope in vivo calcium imaging once per week for a few weeks without noticing any impact on mouse health and mouse social behavior12.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63049">Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging</a>. The Discussion&#160;was&#160;updated.

Erratum: Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging

La señalización intracelular de Ca2+ es un regulador esencial del crecimiento celular, proliferación, diferenciación, migración, transcripción de genes, secreción y apoptosis1. En las neuronas, la señalización de Ca2+ se controla con precisión ya que su patrón espacio-temporal está relacionado con funciones cruciales como la excitabilidad de la membrana, la liberación de neurotransmisores y la plasticidad sináptica2.
Las imágenes de calcio in vivo son una técnica poderosa que se puede utilizar para decodificar la representación del circuito neuronal elemental a los comportamientos normales de los animales, identificar actividades neuronales aberrantes en modelos animales de trastornos cerebrales y desentrañar posibles objetivos terapéuticos que pueden normalizar estos circuitos alterados. Los dos sistemas comunes de imágenes de calcio in vivo son la microscopía de fluorescencia de barrido láser de dos fotones 3,4,5,6 y la microendoscopía miniaturizada montada en la cabeza (miniscopio)7,8,9,10,11,12,13 . La microscopía convencional de dos fotones ofrece ventajas imponentes como una mejor resolución, menor ruido y menor fotoblanqueo; sin embargo, se requiere que los animales de experimentación estén fijos en la cabeza, limitando los estudios de comportamiento que se pueden realizar 3,4,5,6. Por el contrario, el sistema de miniscopio montado en la cabeza es pequeño y portátil, lo que permite estudiar una amplia variedad de pruebas de comportamiento utilizando animales que se comportan libremente 7,8,9,10,11,12,13.
Existen dos indicadores principales de Ca2+, los indicadores químicos 5,14 y los indicadores de calcio codificado genéticamente (GECI)15,16. Las imágenes de Ca2+ se han facilitado mediante el uso de GECI altamente sensibles administrados con vectores virales que permiten el etiquetado específico de las neuronas en el circuito objetivo. El esfuerzo continuo para mejorar la sensibilidad, la longevidad y la capacidad de etiquetar incluso los compartimentos subcelulares, hace que los GECI sean ideales para varios estudios de imágenes de calcio in vivo 17,18,19.
La dispersión de la luz en el tejido cerebral durante las imágenes limita la penetración óptica en profundidad, incluso con la microscopía de dos fotones. Sin embargo, la lente de índice de gradiente (GRIN) supera este problema, ya que la lente GRIN se puede incrustar directamente en los tejidos biológicos y transmitir imágenes desde la región profunda del cerebro hasta el objetivo del microscopio. A diferencia de la lente convencional hecha de material ópticamente homogéneo y requiere una superficie de forma complicada para enfocar y crear imágenes, el rendimiento de la lente GRIN se basa en un cambio gradual del índice de refracción dentro del material de la lente que logra el enfoque con una superficie plana20. La lente GRIN se puede fabricar hasta 0,2 mm de diámetro. Por lo tanto, una lente GRIN miniaturizada se puede implantar en el cerebro profundo sin causar demasiado daño.
En este artículo, se presenta un protocolo completo de cirugía para el cerebro profundo in vivo por imágenes de calcio. Para el propósito de demostración, describimos cirugías cerebrales dirigidas específicamente a la corteza prefrontal medial (mPFC) del cerebro del ratón y el registro de imágenes de calcio in vivo a través de un sistema de miniscopio personalizado desarrollado por el grupo del Dr. Lin en el Instituto Nacional sobre el Abuso de Drogas (NIDA / IRP)7,12. El procedimiento experimental implica dos cirugías cerebrales principales. La primera cirugía consiste en inyectar estereotáxicamente un vector viral que expresa GCaMP6f (un GECI) en el mPFC. La segunda cirugía es implantar la lente GRIN en la misma región del cerebro. Después de la recuperación de estas cirugías cerebrales, el procedimiento posterior es colocar el soporte del miniscopio (base) en el cráneo del ratón con cemento dental. In vivo Lasimágenes Ca 2+ se pueden realizar en cualquier momento después de montar el miniscopio en su base. El protocolo de cirugía para la inyección viral y la implantación de lentes GRIN es compatible con cualquier sistema comercial o personalizado de imágenes de un solo fotón y dos fotones para el cerebro profundo imágenes de calcio in vivo.

<table><tbody><tr><td>Fresas de 0,6 mm y 1,2 mm</td><td>Tecnología KF</td><td>8000037800</td><td>Para craneotomía</td></tr><tr><td>Aguja de 27-G y 30-G Aguja</td><td>BD PrecisionGlide</td><td>REF 305109 y REF305106</td><td>Para ambas cirugías</td></tr><tr><td>45 pinzas en ángulo</td><td>Herramientas Fine Science</td><td>11251-35</td><td>Para cirugías</td></tr><tr><td>Solución de povidona yodada al 7,5% (Betadine)</td><td>Purdue Products L.P.</td><td>NDC 67618-151-17</td><td>Desinfectante de superficies</td></tr><tr><td>Acetona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179124-1L Limpiador de</td><td>lentes GRIN</td></tr><tr><td>Agarosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539-25G</td><td>Para implante de lentes GRIN</td></tr><tr><td>Pomada antibiótica</td><td>HeliDerm Technology</td><td>81073087</td><td>Para inyección</td></tr><tr><td>de virus Medicamento antiinflamatorio (ibuprofeno)</td><td>Johnson & Johnson Consumer Inc</td><td>30043308</td><td>Actúa como analgésico después de las cirugías</td></tr><tr><td>AutoStereota</td><td>github.com/liang-bo/autostereota NIDA/IRP</td><td></td><td>para la implantación de lentes GRIN</td></tr><tr><td>Software de recodificación de comportamiento (Point Grey FlyCap2)</td><td>Point Grey</td><td>Point Grey Research Blackfly BFLY-PGE-12A2C</td><td>Para registrar el comportamiento</td></tr><tr><td>Tuerca hexagonal de latón</td><td>McMASTER-CARR</td><td>92736A112</td><td>para la implantación de lentes GRIN</td></tr><tr><td>Buprenorfina</td><td>Par</td><td>Pharmaceuticals NDC 4202317905</td><td>para la implantación de lentes GRIN</td></tr><tr><td>Cloruro de calcio</td><td>Sigma</td><td>10043-52-4</td><td>Para la preparación de un</td></tr><tr><td>conmutador</td> de CSF <td>NIDA/IRP</td> Componente <td>de diseño personalizado</td><td>del sistema de adquisición de imágenes</td></tr><tr><td>Tanque de oxígeno comprimido y óxido de Caxbondióxido Soluciones</td><td>de aire de las Montañas Rocosas</td><td>BI-OX-CD5C-K</td><td>para lentes GRIN Tanque de</td></tr><tr><td>oxígeno comprimido</td> para implantación <td>Rocky Mountain Air Solutions</td><td>OX-M-K</td><td>Para inyección de virus</td></tr><tr><td>Microdrill</td> inalámbrico <td>Tecnología KF</td><td>8000037800</td><td>Para craneotomía</td></tr><tr><td>Cianoacrilato</td><td>Henkel Coorporation</td><td># 1811182</td><td>Para la implantación de lentes GRIN</td></tr><tr><td>Controlador de adquisición de datos</td><td>NIDA/IRP</td><td>Diseñado a medida</td><td>Componente de adquisición de imágenes sistema</td></tr><tr><td>Cable de transmisión de datos</td><td>NIDA/IRP</td><td>Diseñado a medida</td><td>Componente del sistema de adquisición de imágenes</td></tr><tr><td>Juego de cemento dental</td><td>C& B Metabond y Catalyst</td><td>A00253revA306 y A00168revB306</td><td>Para la implantación de lentes GRIN</td></tr><tr><td>Juego de cemento dental</td><td>Duralay</td><td>2249D</td><td>Para la implantación de lentes GRIN</td></tr><tr><td>Dexametasona</td><td>VETone</td><td>NDC 1398503702</td><td>para la implantación de lentes GRIN</td></tr><tr><td>Dextrosa</td><td>Sigma</td><td>50-99-7</td><td>Para la preparación de aCSF</td></tr><tr><td>Gel dietético</td><td>Clear H20</td><td>72-06-5022</td><td>Suplemento dietético para ratón</td></tr><tr><td>Lente GRIN</td><td>GRINTECH</td><td>NEM-100-25-10-860-S</td><td>Para la implantación de lentes GRIN</td></tr><tr><td>Almohadilla térmica</td><td>Physitemp Instruments LLC.</td><td>#10023</td><td>Para mantener el cuerpo del ratón caliente durante las cirugías</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>VETone</td><td>V1</td><td>502017 Anestesia</td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>VETone</td><td>V1 501072</td><td>Para la implantación de lentes GRIN</td></tr><tr><td>Lidocaína</td><td>WEST-WARD</td><td>NDC 0143-9575-01</td><td>Anestesia local</td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio hexahidratado</td><td>Sigma</td><td>7791-18-6</td><td>Para la preparación de un</td></tr><tr><td>microlitro de CSF jeringa (Hamilton)</td><td>Hamilton</td><td>7653-01</td><td>Para inyección de virus</td></tr><tr><td>MicroSyringe Pump Controller</td><td>World Precision Instrument</td><td>#178647</td><td>Para inyección de virus</td></tr><tr><td>Miniscope</td><td>NIDA/IRP</td><td>Diseñado</td><td>a medida Para la obtención de imágenes</td></tr><tr>Base <td>de miniscopio Protolabs Diseñado</td><td>a medida Para montar la base</td><td></td> Brazo <td>de</td></tr><tr><td>sujeción del miniscopio</td><td>NIDA/IRP</td><td>Diseño a medida</td><td>Para el montaje de la base</td></tr><tr><td>Tapa de protección del miniscopio</td><td>Protolabs</td><td>Diseño a medida</td><td>Para proteger el miniscopio</td></tr><tr><td>Controlador motorizado</td><td>Thorlabs KMTS50E</td><td></td><td>Para el montaje de la base</td></tr><tr><td>NeuView</td><td>https://github.com/giovannibarbera/miniscope_v1.0 NIDA/IRP</td><td></td><td>Para la obtención de imágenes in vivo</td></tr><tr><td>Pomada oftálmica</td><td>Puralube Pomada veterinaria</td><td>NDC 17033-211-38</td> Tubo de PCR <td>oftálmico</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-0622</td><td>Para la implantación de lentes GRIN</td></tr><tr><td>Pinza de pellizco</td><td>World Precision Instrument</td><td>14040</td><td>Para sujetar el tubo Cinta</td></tr> de <tr><td>politetrafluoroetileno (PTFE)</td><td>TegaSeal Cinta de PTFE</td><td>A-A-58092</td><td>Para la fijación de miniScope a la base</td></tr><tr><td>Cloruro de potasio Sigma</td><td></td><td>7447-40-7</td><td>Para la preparación de un brazo</td></tr><tr><td>robótico</td><td>SCF NIDA/IRP</td><td>Diseñado</td><td>a medida Para la implantación de lentes GRIN</td></tr><tr><td>Solución salina</td><td>Hospira</td><td>RL 7302</td><td>Para ambas cirugías</td></tr><tr><td>Tornillo de fijación</td><td>DECORAH LLC.</td><td>3BT-P9005-00-0025</td><td>Para atornillar la tuerca hexagonal de latón en la base del miniscopio</td></tr><tr><td>&nbsp; Tubo de caucho de silicona, 0.062" ID, 1/8" OD</td><td>McMaster</td><td>2124T3</td><td>Para la irrigación de aCSF</td></tr><tr><td>Bicarbonato de sodio</td><td>Sigma</td><td>144-55-8</td><td>Para la preparación de aCSF</td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Sigma</td><td>7647-14-5</td><td>Para la preparación de aCSF</td></tr><tr><td>Fosfato de sodio monobásico</td><td>Sigma</td><td>7558-80-7</td><td>Para la preparación de aCSF</td></tr><tr><td>Etapa estereotáxica</td><td>KOPF</td><td>Modelo 962 Dual Ultra Precise Pequeño Animal Estereotáxico</td><td>Para ambas cirugías</td></tr><tr><td>Hisopo de algodón estéril</td><td>Puritan</td><td>REF 806-WC</td><td>Para ambas cirugías</td></tr><tr><td>Herramientas quirúrgicas</td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>11251-35</td><td>Para cirugías</td></tr><tr><td>Sutura</td><td>Sofsilk</td><td>REF SS683</td><td>Para inyección de virus</td></tr><tr><td>&nbsp; Filtro de jeringa (0,22 y micro; m)</td><td>Millex</td><td>SLGVR33RS</td><td>Para filtrar aCSF durante la implantación de lentes GRIN</td></tr><tr><td>Suspensión viral (AAV1-CamKII-GCamp6f)</td><td>Addgene</td><td>100834-AAV1</td><td>Para inyección</td></tr><tr><td></td><td></td> de virus <td>Título: 2.8 X 10^13 GC/ml</td><td></td></tr><tr><td>Xilacina</td><td>VETone</td><td>V1 510650</td><td>Para implantación de lentes GRIN</td></tr></tbody></table>

inyección viral estereotáxica e implantación de lentes de índice de gradiente para imágenes de calcio in vivo en el cerebro profundo

Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging

Un microscopio de fluorescencia en miniatura (miniscopio) es una herramienta potente para obtener imágenes de calcio in vivo de animales que se comportan libremente. Ofrece varias ventajas sobre los sistemas convencionales de imágenes de calcio multifotón: (1) compacto; (2) ligero; (3) asequible; y (4) permite la grabación de animales que se comportan libremente. Este protocolo describe las cirugías cerebrales para imágenes de calcio in vivo en el cerebro profundo utilizando un sistema de grabación de miniscopio desarrollado a medida. El procedimiento de preparación consta de tres pasos, que incluyen (1) inyectar estereotáxicamente el virus en la región cerebral deseada del cerebro de un ratón para etiquetar un subgrupo específico de neuronas con un sensor de calcio codificado genéticamente; (2) implantación de lente de índice de gradiente (GRIN) que puede transmitir imágenes de calcio desde la región profunda del cerebro al sistema de miniscopio; y (3) colocar el soporte del miniscopio sobre el cráneo del ratón donde el miniscopio se puede unir más tarde. Para realizar imágenes de calcio in vivo , el miniscopio se sujeta al soporte y se recopilan imágenes de calcio neuronal junto con registros de comportamiento simultáneos. El protocolo de cirugía actual es compatible con cualquier sistema comercial o personalizado de imágenes de un solo fotón y dos fotones para imágenes de calcio in vivo del cerebro profundo.

La Figura 1 muestra el procedimiento experimental esquemático, incluida la inyección viral, la implantación de lentes GRIN, la fijación de la base del miniscopio al cráneo del ratón y las imágenes de calcio in vivo a través de un miniscopio. Todo el procedimiento toma ~ 2 meses. La Figura 2 muestra los principales componentes descritos en el protocolo para imágenes de calcio in vivo de miniscopio. La Figura 3 muestra las interfaces del software AutoStereota durante la implantación de la lente GRIN. La Figura 4 muestra las interfaces de NeuView y el software de grabación de comportamiento durante las imágenes de calcio in vivo.
El resultado de las imágenes de calcio in vivo depende del éxito de las cirugías de inyección viral e implantación de lentes GRIN. La Figura 5 muestra una variedad de resultados (es decir, no exitosos, subóptimos y buenos) de los registros de imágenes de calcio in vivo . En casos fallidos, la imagen de calcio podría aparecer oscura o brillante, pero generalmente revela ninguna o muy pocas neuronas activas. Por lo general, no realizamos experimentos de registro de calcio in vivo si hay menos de cinco neuronas activas. Una buena imagen de calcio in vivo generalmente revela varios cientos de neuronas activas. Si una grabación contiene menos de cien neuronas activas, la consideramos una grabación subóptima.
Tanto en los registros subóptimos como en los buenos registros se llevaron a cabo experimentos de imágenes de calcio in vivo, y se realizó el análisis de datos posterior. La película 1 muestra una grabación representativa de imágenes de calcio in vivo del mPFC del ratón. Los videos de comportamiento y los datos de imágenes de calcio generalmente se procesan por separado. Los videos de comportamiento del mouse se pueden calificar manualmente. Los archivos de imágenes de calcio se procesan utilizando la caja de herramientas de procesamiento de imágenes de calcio CaImAn24. La Figura 6 muestra un mapa celular representativo y varios rastros de calcio de un buen registro de imágenes de calcio in vivo .
Después de completar las imágenes de calcio in vivo , el paso final es confirmar si la inyección viral y la implantación de la lente GRIN se han producido en la región cerebral deseada. Para este propósito, el ratón fue perfundido con solución salina tamponada con fosfato (PBS) seguida de paraformaldehído al 4% (PFA). El cerebro del ratón se recolectó, se colocó en PFA al 4% durante 12 h y se almacenó en PBS a 4 ° C. El cerebro del ratón se seccionó en rodajas de 50 μm de grosor con un vibratome. Las rebanadas cerebrales fueron teñidas con DAPI y observadas bajo el microscopio (no descritas en el protocolo)12. La Figura 7 es una rebanada de cerebro de ratón ~ 1.94 mm anterior a bregma de un ratón experimental, que muestra la pista donde se implantó la lente GRIN. La región de fluorescencia verde debajo y alrededor de la pista de la lente GRIN indica la expresión de GCaMP6f en la región mPFC.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig01.jpg"> Figura 1: Visión general esquemática del procedimiento experimental. (A) Inyección estereotáxica del virus en el mPFC. (B) Implantación de lente GRIN en el mPFC. (C) Fijación de la base del miniscopio al cráneo del ratón. (D) Montaje del miniscopio e imágenes de calcio in vivo . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig02.jpg"> Figura 2: Principales componentes necesarios para la obtención de imágenes de calcio in vivo . (A) Una lente GRIN con 1 mm de diámetro y 4,38 mm de longitud. (B) Una aguja de extremo romo pulida manualmente de 27 G utilizada para la aspiración de tejido cerebral. (C) El brazo robótico acoplado al soporte de la aguja. (D) Una tapa hecha a medida de un tubo de PCR para proteger la lente GRIN expuesta hasta la fijación de la base del miniscopio en el cráneo del ratón. (E) El soporte del miniscopio (base) con una tuerca hexagonal. (F) Un miniscopio cuya parte de rosca está envuelta con la cinta de PTFE. (G) Un miniscopio sujeto a su base con un tornillo de bloqueo. (H) El brazo de sujeción del miniscopio. (I) Un controlador motorizado 3D personalizado utilizado para facilitar el movimiento del miniscopio en posiciones XYZ. (J) Una tapa protectora sujeta a la base para proteger la lente GRIN expuesta mientras el ratón no está realizando imágenes de calcio in vivo . (K) El miniscopio conectado al cable. (L) El sistema de adquisición de datos para imágenes In vivo Ca2+ . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig03.jpg"> Figura 3: Interfaces del software AutoStereota durante la aspiración de tejido cerebral capa por capa. (A) La interfaz correspondiente a los pasos 2.17.1 a 2.17.3. (B) La interfaz correspondiente a los pasos 2.17.4 a 2.17.6. (C) La interfaz correspondiente a los pasos 2.17.7 a 2.17.9. (D) La interfaz correspondiente a los pasos 2.17.10 a 2.17.12. Los cuadros rojos resaltan los valores de entrada. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig04.jpg"> Figura 4: Interfaces del software NeuView y el software de registro de comportamiento durante la obtención de imágenes de calcio in vivo . (A) La interfaz de NeuView. (B,C) Las interfaces del software de registro de comportamiento. Los cuadros rojos resaltan los botones en los que es necesario hacer clic. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig05.jpg"> Figura 5: Mapas celulares de fluorescencia de proyección máxima para mostrar el rango de posibles resultados. (A, B) Imágenes de calcio in vivo sin éxito que no son aceptables para el análisis de datos posterior. (A) es oscuro y contiene menos de 5 neuronas activas. (B) es brillante pero no tiene neuronas activas. (C) El mapa celular de una imagen de calcio in vivo subóptima que contiene algunas neuronas activas. (D) El mapa celular de una buena imagen de calcio in vivo que incluye varios cientos de neuronas activas. Barra de escala: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig06.jpg"> Figura 6: Mapa celular representativo y transitorios de calcio de una imagen de calcio in vivo exitosa. El panel izquierdo es el mapa celular de fluorescencia de proyección máxima de un registro de imágenes de calcio in vivo en el mPFC durante una prueba de campo abierto. La grabación dura 5 min. El panel derecho muestra los transitorios de calcio de 15 regiones de interés (de color emparejado). Barra de escala: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig07.jpg"> Figura 7: Evaluación post mortem de un ratón experimental. La evaluación post mortem para la expresión de GCaMP6f y la implantación de lente GRIN en el mPFC de un ratón experimental. El área rectangular indica la ruta para la implantación de la lente GRIN. El área verde debajo de la región implantada de la lente GRIN confirma que GCaMP6f se expresó, y la lente GRIN se implantó con precisión en la región cerebral deseada. Cg, corteza cingulada; PrL: corteza prelímbica; IL: corteza infralímbica. Barra de escala: 400 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig07large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Tabla 1: Comparaciones del sistema de miniscopios hecho a medida en el NIDA con otros sistemas de miniscopios 7,8,9,10,11,13,25,26. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049_Table%201_1.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>
Película 1: Una grabación de imágenes de calcio in vivo del mPFC del ratón durante una prueba de campo abierto. Para fines de demostración, este video muestra solo 1 minuto de grabación. La velocidad de fotogramas de grabación original es de 10 fotogramas/s. El video es 6 veces más rápido que la grabación original. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/movie.mp4" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta película.</a>

El miniscopio de imágenes de calcio in vivo es una técnica poderosa para estudiar la dinámica neuronal y los microcircuitos en ratones que se comportan libremente. Este protocolo describe la realización de cirugías cerebrales para lograr buenas imágenes de calcio in vivo utilizando un miniscopio.

Inyección viral estereotáxica e implantación de lentes de índice de gradiente para imágenes de calcio in vivo en el cerebro profundo

A miniature fluorescence microscope (miniscope) is a potent tool for in vivo calcium imaging from freely behaving animals. It offers several advantages ...

Las imágenes de calcio in vivo de miniscope permiten a los investigadores examinar la actividad coordinada espacial y temporalmente de cientos de neuronas en estructuras cerebrales profundas de animales que se comportan libremente. Las imágenes de calcio in vivo de miniscopio ofrecen muchas ventajas, incluida la capacidad de realizar grabaciones que son específicas del tipo de célula, a gran escala y longitudinales. Nuestro protocolo de cirugía para inyección viral e implantación de lentes GRIN es compatible con cualquier sistema comercial o personalizado de imágenes de fotón único y dos fotones para el cerebro profundo imágenes de calcio in vivo.Demostrando el procedimiento estará Rashmi Thapa, un estudiante graduado de mi laboratorio. Después de desinfectar el área quirúrgica afeitada de un ratón anestesiado, use un bisturí para hacer una incisión de dos centímetros a través de la piel a lo largo de la línea media para exponer la lambda y el bregma del cráneo. Después de localizar la rebaba de taladro dental de 0,5 milímetros a una posición de 1,94 milímetros posterior anterior y lateral medial de 0,5 milímetros desde el bregma, comience a perforar a través del cráneo.A continuación, cargue el virus en la jeringa de microlitro utilizando el panel de control de la microbomba y retire 500 nanolitros de burbuja de aire seguidos de 800 nanolitros del virus a una velocidad de flujo de 50 nanolitros por segundo. Desplácese lentamente por la aguja hacia el tejido cerebral hasta la coordenada Z objetivo del ventral dorsal de 1,75 milímetros y luego muévalo ligeramente hasta la coordenada Z del ventral dorsal de 1,65 milímetros. En el panel de control, configure la microbomba para inyectar 500 nanolitros del virus a una velocidad de flujo de 50 nanolitros por minuto antes de presionar el botón Ejecutar para inyectar el virus.Cuando termine la inyección, alinee los bordes de la piel y cierre cuidadosamente la incisión con una sutura 4-0. Aplique ungüento antibiótico en el área cosida para prevenir la infección. Para implantar el índice de gradiente o lente GRIN, extirpa un área triangular de la piel de 1,5 centímetros de altura y 1,5 centímetros de base desde el lado anterior entre los ojos hasta el lado posterior detrás de la lambda usando tijeras finas.Después de limpiar y secar bien el cráneo, aplique cianoacrilato en los bordes de la piel y adhiera la piel al cráneo. Después de cinco minutos cuando el cianoacrilato se seque, localice una rebaba de taladro dental de 1,2 milímetros de diámetro a una posición de 1,94 milímetros posterior anterior, medial lateral de 0,8 milímetros de la bregma. Perfore a través del cráneo, seguido de quitar la duramadre con una punta de aguja de calibre 30.Limpie todas las piezas de escombros óseos con pinzas afiladas en ángulo de 45 grados. A continuación, conecte una aguja de extremo romo pulido manualmente de calibre 27 al soporte de la aguja acoplado a un brazo robótico inclinado con un ángulo de 10 grados y conecte el otro extremo del soporte de la aguja al sistema de vacío de la casa. Ubique la punta de la aguja con solo tocar el bregma antes de hacer clic en el botón Bregma para establecer la coordenada Z de bregma en cero.Establezca el valor de la entrada X en 0.8, ingrese el valor Y en 1.94, ingrese el valor Z en 1.0 y haga clic en el botón Buscar para mover la aguja a la parte superior del orificio perforado en el cráneo. Centra la punta de la aguja en el orificio perforado y llévala a la posición Z cero. Encienda la aspiradora y comience a enjuagar el área expuesta del cerebro con líquido cefalorraquídeo artificial, o ACSF, a través de un sistema de tubos controlados por gravedad conectado a una aguja de calibre 30 con una punta doblada.El ACSF se burbujea continuamente con una mezcla de gases de 95% de oxígeno y 5% de dióxido de carbono mientras se filtra a través de un filtro de 0,2 micras. Utilizando el software AutoStereota, la aspiración del tejido cerebral se completará en cuatro rondas. Para la primera ronda de aspiración, asegúrese de que el valor Z muestre cero.Luego, en la sesión zStep, haga clic y verifique la primera y la segunda fila. Establezca los valores de la primera fila en 0,2 y 1. Establezca los valores de la segunda fila en 0,15 y 4.En la sesión de modo, establezca el tamaño de la aguja calibre 27 y 1.2. Establecer Dims 0.9. Todos los demás valores serán predeterminados.Para iniciar la aspiración, haga clic secuencialmente en los botones NotSet, KeepZero e Inicio. La primera ronda de aspiración genera un bolsillo de columna con 0,8 milímetros de profundidad y 1 milímetro de diámetro. En la tercera ronda de aspiración, haga clic y compruebe la primera fila de la sesión zStep y establezca los valores de la primera fila en 1,8 y 1.En la sesión de modo, establezca el tamaño de la aguja calibre 27 y 2.2. Comienza la aspiración manteniendo otros valores iguales a los de la ronda anterior. Después de la tercera ronda de aspiración, la profundidad del bolsillo de la columna es de 1,8 milímetros.La última ronda de aspiración es limpiar la sangre acumulada en la parte inferior del bolsillo. Establezca los valores de la primera fila en 1.6 y 1 en la sesión zStep y establezca el calibre de aguja 27 y 2.2 y Dims 0.6 en la sesión de modo antes de iniciar la aspiración. Una vez que el bolsillo esté libre de sangre, detenga el vacío, detenga la irrigación de ACSF y suba la aguja 2 milímetros en coordenada Z y 0,5 milímetros antes del centro.Coloque la lente GRIN estéril de 1 milímetro en el bolsillo del tejido cerebral. A continuación, aplique la agarosa derretida en el espacio entre la lente GRIN y el tejido cerebral con la ayuda de una espátula. Después de que la agarosa forme un gel, retire el exceso de agarosa con una micro cuchilla.Mezcle el polvo de cemento dental y el líquido catalizador en un pozo de mezcla preenfriado y aplique una capa de cemento de resina adhesiva autocurable en el cráneo, comenzando rodeando la lente GRIN y luego cubriendo todo el cráneo expuesto. En un pozo de plástico limpio, mezcle el polvo de cemento dental y el carbón negro con líquido para aplicar una capa delgada de la mezcla sobre la primera capa de cemento dental. Deja que se endurezca durante cinco minutos.Conecte el Miniscope al cable y encienda el software desarrollado a medida NuView. En NuView, haga clic en Hardware, marque LED1 y haga clic en el botón Transmitir para ver las imágenes en vivo. Para detener la transmisión en vivo, haga clic en el botón Detener.A continuación, coloque el Miniscope en un brazo de sujeción Miniscope personalizado. Con la ayuda de controladores motorizados, ubique el Miniscope justo encima de la lente GRIN expuesta, haciéndola paralela a la superficie de la lente. Baje lentamente el Miniscope hacia la lente GRIN y ajuste su posición Z hasta que se encuentre el mejor plano de enfoque.Aplique la primera capa de cemento dental alrededor de la base del Miniscope sin alterar la posición del Miniscope. Después de endurecer el cemento, retire suavemente el brazo de sujeción para que el Miniscope pueda pararse por sí solo en la cabeza del mouse. Aplique una segunda capa de cemento dental alrededor de la base para llenar todos los huecos, asegurándose de que no haya fugas de luz LED de los huecos.Deja que el cemento dental se endurezca. Después de anestesiar brevemente el ratón con isoflurano, afloje el tornillo de bloqueo en la base con un pequeño destornillador antes de quitar la tapa protectora y limpie la superficie de la lente GRIN con un hisopo de algodón empapado en acetona. Conecte el Miniscope al cable e inicie el software NuView para comenzar a identificar el mejor plano focal ajustando la posición del Miniscope en relación con la base apretando o aflojando ligeramente con la ayuda de pinzas romas.Una vez que se determine el mejor plano focal, apriete el tornillo de bloqueo antes de desconectar el cable y colocar el mouse de nuevo en su jaula de inicio. Encienda el software de la cámara de comportamiento para ver el campo de comportamiento del mouse a través de una función de transmisión en vivo. Ajuste manualmente el enfoque de la cámara superior.Seleccione Trigger Strobe y marque activar/desactivar disparador, seguido de hacer clic en el botón Grabar. A continuación, utilice Examinar para seleccionar una ubicación donde se guardarán las grabaciones de comportamiento. Seleccione el formato de imagen deseado.Acerque el ratón a la arena y conecte el Miniscope al cable conectado al sistema de adquisición de datos. Luego coloque el mouse en el centro de la arena. En el software de la cámara de comportamiento, haga clic en Iniciar grabación.En NuView, verifique LED1, haga clic en Capturar y luego active los botones para comenzar a grabar. Esto permite grabaciones simultáneas de imágenes de calcio y comportamiento del ratón. Presione Detener después de 3, 000 cuadros y guarde los archivos.Cuando finalice la grabación, anestesia brevemente el ratón con isoflurano, separa el Miniscope de la base y coloca la tapa protectora sobre la base antes de volver a colocar el ratón en su jaula de origen. El mapa celular de las imágenes de calcio in vivo subóptimos contenía algunas neuronas activas, mientras que el de las imágenes exitosas incluía varios cientos de neuronas activas en el área enfocada. En el ejemplo típico de una imagen de calcio in vivo sin éxito, se observó que la región era oscura y contenía menos de cinco neuronas activas, o la región era brillante pero no tenía neuronas activas.En el análisis representativo, se muestra el mapa celular de fluorescencia de proyección máxima y los transitorios de calcio de un registro sucesivo de imágenes de calcio in vivo. La evaluación postmortem para la expresión de GCaMP6f y la implantación de lente GRIN en el PFC medial de un ratón experimental indicó que GCaMP6f se expresó y la lente GRIN se implantó con precisión en la región cerebral deseada. Para obtener una buena imagen de calcio, es necesario asegurarse de que el sangrado se haya detenido por completo y que el campo esté libre de coágulos de sangre antes de implantar la lente GRIN.Esta técnica se puede utilizar para estudiar los cambios en el circuito neuronal en el modelo de ratón de diferentes trastornos cerebrales humanos y probar si un candidato a fármaco puede normalizar los circuitos alterados.

stereotaxic-viral-injection-gradient-index-lens-implantation-for-deep

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Para comprender la dinámica de la red de microcircuitos de la neocorteza, que es esencial para grabar simultáneamente la actividad de un gran número de neuronas. En vivo de dos fotones de imágenes de calcio es el único método que permite grabar la actividad de una densa población neuronal con una sola célula de resolución.

En Vivo 2-Photon imágenes de calcio en la capa 2 / 3 de los ratones

En este artículo, se muestra un método para fabricar agujas capilar de vidrio con una luz de 50 micras. Esta técnica reduce significativamente el daño cerebral, minimiza la difusión pasiva de las drogas y permite una segmentación precisa en el cerebro de roedores.

Focalización de estructuras profundas del cerebro con microinyecciones de entrega de medicamentos, vectores virales, o trasplantes de células

Fuente: Lee, H. et. al., Imágenes exitosas de calcio in vivo con un microscopio miniaturizado de montaje en la cabeza en la amígdala de un ratón que se comporta libremente. J. Vis. Exp. (2020)Este video muestra imágenes de calcio in vivo en un ratón utilizando un índice de refracción de gradiente, o lente GRIN, y un microscopio miniaturizado. La configuración combina la fijación de la cabeza dentro de un sistema de jaula móvil sin fricción, estimulando las neuronas y desencadenando la entrada...

Imágenes microendoscópicas de calcio en tiempo real en un ratón que se mueve libremente

Fuente: Thapa, R., et. al., Inyección viral estereotáxica e implantación de lentes de índice de gradiente para imágenes de calcio en el cerebro profundo In Vivo.  J. Vis. Exp. (2021)El video muestra imágenes de calcio en tiempo real utilizando un miniscopio en un ratón transducido, correlacionando la actividad neuronal con el comportamiento.

Imágenes de calcio en tiempo real de la corteza prefrontal medial de un ratón utilizando un miniscopio

Aquí se describen los procedimientos experimentales que participan en dos fotones de imágenes de la corteza del ratón durante comportamiento en un entorno de realidad virtual.

Dos fotones de imágenes de calcio en ratones Recorriendo un entorno de realidad virtual

La imagen de calcio microendoscópica in vivo es una herramienta invaluable que permite el monitoreo en tiempo real de las actividades neuronales en animales que se comportan libremente. Sin embargo, aplicar esta técnica a la amígdala ha sido difícil. Este protocolo tiene como objetivo proporcionar una guía útil para atacar con éxito las células de amígdala con un microscopio miniaturizado en ratones.

Imágenes de calcio in vivo exitosas con un microscopio miniaturizado head-mount en la amígdala del ratón que se comporta libremente

Presentamos un protocolo para exponer el médula oblonga del ratón adulto del lado ventral. Mediante el uso de una lente de índice de refracción de gradiente con un microscopio en miniatura, las imágenes de calcio se pueden utilizar para examinar la actividad de los somatas neuronales oliva inferiores in vivo.

In vivo Imágenes de calcio en la aceituna inferior de ratón

La contracción del cemento dental durante el curado desplaza la placa base. Este protocolo minimiza el problema al crear una base inicial del cemento dental que deja espacio para cementar la placa base. Semanas más tarde, la placa base se puede cementar en posición en este andamio con poco cemento nuevo, reduciendo así la contracción.

Uso de placas base y un miniscopio preanclado con una lente objetiva para la investigación transitoria de calcio en ratones

El giro dentado del hipocampo lleva a cabo funciones esenciales y distintas en el aprendizaje y la memoria. Este protocolo describe un conjunto de procedimientos robustos y eficientes para la obtención de imágenes de calcio in vivo de células granulosas en el giro dentado en ratones que se mueven libremente.

Imágenes de calcio in vivo de células granulosas en el giro dentado del hipocampo en ratones 

Este protocolo detalla la imagen in vivo de calcio de neuronas hipotalámicas utilizando un microscopio miniaturizado (miniscopio) en ratones que se comportan libremente durante la manipulación del estado social (aislamiento social y reencuentro social). Este método permite la obtención de imágenes a resolución neuronal única de la actividad hipotálmica que representa la necesidad social y la saciedad social, facilitando estudios mecanicistas de la homeostasis social.

In Vivo Imagen de calcio con microscopio miniaturizado en el hipotálamo para comprender los comportamientos sociales en ratones

Aprende a realizar inyección viral estereotáxica e implantación de lentes GRIN para imagen de calcio in vivo en cerebro profundo de ratones. Este protocolo permite registrar la actividad neuronal a gran escala en animales en comportamiento libre.

Inyección viral estereotáxica e implantación de lentes de índice de gradiente para imágenes de calcio in vivo en el cerebro profundo (Video) | JoVE Journal

Inyección viral estereotáxica e implantación de lentes de índice de gradiente para imágenes de calcio in vivo en el cerebro profundo

Explorar más videos