Análisis de Desarrollo del diente Germ Inervación Uso de dispositivos de microfluidos Co-cultura

El objetivo general de este procedimiento es mostrar cómo aislar y cocultivar los ganglios trigéminos en desarrollo y los gérmenes dentales. Esto se logra primero esterilizando, montando y recubriendo los dispositivos microfluídicos. El segundo paso es diseccionar los ganglios del trigémino y los gérmenes dentales de una etapa de desarrollo específica en el ratón de interés.

A continuación, los ganglios del trigémino y los gérmenes dentales se colocan en los dispositivos microfluídicos y se cultivan conjuntamente. El paso final es fijar las células y teñirlas mediante inmunofluorescencia. En última instancia, la microscopía se utiliza para mostrar el patrón de inervación que es el resultado del cocultivo.

La principal ventaja de esta técnica de los métodos existentes, como los cocultivos convencionales, es que este método permite el cocultivo de diferentes órganos y tejidos, cada uno en su propio cultivo óptimo. Medio. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la innovación artificial, como el papel de diferentes moléculas en la innovación dental y la regla de la innovación en el desarrollo dental. Comience por esterilizar en autoclave las herramientas de disección, que incluyen un par de pinzas de microdisección y unas tijeras.

A continuación, esterilice un lote de cubreobjetos de vidrio de 24 milímetros por 24 milímetros colocándolos en una solución de ácido clorhídrico molar en un agitador orbital a 37 grados centígrados durante 24 horas. A continuación, lave los cubreobjetos tres veces con agua destilada estéril, seguidos de tres enjuagues con etanol al 99%, séquelos bajo una campana de flujo estéril una vez secos, encienda la funda con luz ultravioleta durante 30 minutos. A continuación, guarde los cubreobjetos en etanol al 70% hasta que los necesite.

A continuación, utilice pinzas estériles para retirar con cuidado los dispositivos microfluídicos de aislamiento de axones de su embalaje y colóquelos en una placa de Petri estéril con un punzón de biopsia estéril de un milímetro. Cree un orificio en los dispositivos para cada muestra. En correspondencia de las cámaras de cultura.

Tenga cuidado de no perforar demasiado cerca de las microranuras, ya que podrían dañarse con la presión. A continuación, esterilice los dispositivos introduciéndolos en etanol al 70%. Teniendo cuidado de eliminar todo el aire atrapado.

A continuación, retire los dispositivos del etanol y séquelos completamente bajo una campana de flujo estéril. Además, retire los cubreobjetos de la solución de etanol al 70% y déjelos secar bajo la campana de flujo estéril. Espere un mínimo de tres horas antes de continuar.

Coloque cada cubreobjetos en un pocillo dentro de una placa de seis pocillos. A continuación, coloque el dispositivo microfluídico en el cubreobjetos y presione suave pero firmemente con las pinzas para permitir la adhesión total entre el dispositivo de aislamiento y el cubreobjetos de vidrio. A continuación, pipetee 150 microlitros de 0,1 miligramos por mililitro, poli D licina en cada una de las cámaras de cultivo.

A continuación, coloque los dispositivos microfluídicos al vacío durante cinco minutos para eliminar todo el aire de las cámaras. Si todavía se puede ver aire dentro de las cámaras. Repita la solución de lisina poli D en las cámaras.

Incubar los dispositivos con poli de lisina durante la noche a 37 grados centígrados al día siguiente. Lave las cámaras tres veces con agua destilada estéril y luego llene las cámaras con 150 microlitros de cinco microgramos por mililitro, solución de trabajo laminada, e incube durante la noche a 37 grados centígrados. A continuación, los medios de reparación para los ganglios del trigémino y los cultivos de gérmenes dentales como se describe en el protocolo de texto adjunto.

Limpie el área de disección y el estereoscopio con etanol al 70% y coloque los instrumentos de disección después del sacrificio. Diseccionar la piel alrededor de la parte inferior del abdomen de una rata embarazada con embriones de ratón en estadio E 14.5 a E 17.5. A continuación, abra con cuidado el abdomen con unas tijeras.

Localiza el útero, extráigalo y colóquelo en un tubo lleno de hielo. PBS frío: disecciona los embriones y los coloca individualmente en una nueva placa de Petri llena de PBS helado. Una vez que se hayan extraído todos los embriones de los tejidos embrionarios adicionales, decapitarlos con unas tijeras.

Separe la mandíbula inferior del resto de la cabeza mediante microdisección, tijeras, teniendo cuidado de no dañar los ganglios del trigémino. A continuación, tome la cabeza y colóquela en una placa de Petri de vidrio de disección fría. Use fórceps para extraer la piel y el cráneo.

A continuación, coloque unas pinzas por debajo del céfalo y levántelas. Para extirpar el céfalo y el cerebelo, localice los ganglios del trigémino y utilice las pinzas y las agujas de disección para separar los ganglios del trigémino de los nervios del trigémino y limpiar los ganglios. Consérvelos en PBS fríos usando agujas de disección como cuchillos.

Retire la lengua y la piel que rodea la mandíbula. Separe las mandíbulas hemis izquierda y derecha cortando a lo largo de la línea media de la mandíbula. A continuación, localice los gérmenes dentales y aíslelos con agujas de disección, después de la disección de los ganglios del trigémino y los gérmenes dentales, retire la laminina de los dispositivos microfluídicos y llene las cámaras con 200 microlitros de los medios respectivos.

Con pinzas, transfiera suavemente los ganglios trigéminos disecados y los gérmenes dentales a los orificios creados con un punzón de biopsia. Asegúrese de que los gérmenes de los dientes no floten y que se hundan hasta que entren en contacto con los cubreobjetos. Cultivo, las muestras en una incubadora a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono.

Cambie el medio de cultivo cada 48 horas durante 10 días para cambiar el medio. Primero, retire el medio apuntando la pipeta hacia el lado externo de los pocillos. A continuación, añada el medio precalentado fresco en el lado de los wels situado frente a las cámaras durante el período de cultivo.

Obtener imágenes de los cocultivos en cualquier momento utilizando microscopía óptica. Después del período de cultivo, lave las cámaras pipeteando 150 microlitros de PBS en un pocillo por cámara y deje que PBS fluya a través de las cámaras. Repita el lavado un total de tres veces después del último lavado.

Retire el PBS y fije las muestras pipeteando 150 microlitros de aldehído paraformado al 4% en PBS en un pocillo por cámara y permitiendo que fluya a través de la otra cámara. Incubar el dispositivo a temperatura ambiente durante 15 minutos. A continuación, lave las cámaras dos veces con PBS y proceda con análisis adicionales, como la tinción inmunofluorescente y la obtención de imágenes de la excrecencia.

Durante el cultivo con carbón, las neuritas de los ganglios del trigémino se ramifican fuera de su compartimento de cultivo y se extienden hacia el germen dental en desarrollo. A un aumento mayor, se pueden ver las neuritas que se extienden a través de las cámaras axonales y los microrancos en el dispositivo microfluídico. El progreso del crecimiento de los nervios se puede rastrear a lo largo del tiempo para describir el desarrollo de la innovación.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como el ARN o la PROTEINIZACIÓN para estudiar, por ejemplo, los cambios en la expresión génica o la secreción de proteínas en los tejidos diana tras la innovación.