Análisis de Desarrollo del diente Germ Inervación Uso de dispositivos de microfluidos Co-cultura

El objetivo general de este procedimiento es mostrar cómo aislar y cultivar conjuntamente los ganglios trigéminos en desarrollo y los gérmenes dentales. Esto se logra primero esterilizando, montando y recubriendo los dispositivos microfluídicos. El segundo paso consiste en diseccionar los ganglios trigéminos y los gérmenes dentales a partir de una etapa de desarrollo específica en el ratón de interés.

A continuación, los ganglios trigéminos y los gérmenes dentales se colocan en los dispositivos microfluídicos y se cultivan en co-cultivo. El último paso consiste en fijar las células y teñirlas mediante inmunofluorescencia. Finalmente, se utiliza microscopía para mostrar el patrón de inervación resultante del co-cultivo.

La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como los cultivos co convencionales, es que este método permite el cultivo co de diferentes órganos y tejidos, cada uno en su medio de cultivo óptimo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la formación de dientes, como el papel de diferentes moléculas en la formación de dientes y la función de la formación en el desarrollo dentario. Comience por autoclavar las herramientas de disección, que incluyen un par de pinzas de microdisección y un par de tijeras.

A continuación, esterilice un lote de cubreobjetos de vidrio de 24 milímetros por 24 milímetros colocándolos en una solución de ácido clorhídrico uno molar en un agitador orbital a 37 grados Celsius durante 24 horas. Luego lave los cubreobjetos tres veces con agua destilada estéril, seguido de tres enjuagues con etanol al 99 %, séquelos bajo una campana de flujo estéril; una vez secos, encienda la luz ultravioleta de la campana durante 30 minutos. A continuación, almacene los cubreobjetos en etanol al 70 % hasta que sean necesarios.

A continuación, utilice fórceps estériles para retirar cuidadosamente los dispositivos microfluídicos de aislamiento de axones de su envase y colóquelos en una placa de Petri estéril utilizando un punzón estéril de biopsia de un milímetro. Cree un orificio en los dispositivos para cada muestra, en correspondencia con las cámaras de cultivo.

Tenga cuidado de no perforar demasiado cerca de las microranuras, ya que podrían dañarse por la presión. A continuación, esterilice los dispositivos sumergiéndolos en etanol al 70%. Teniendo cuidado de eliminar todo el aire atrapado.

Luego retire los dispositivos del etanol y séquelos completamente bajo una campana de flujo estéril. Asimismo, retire las laminillas de la solución de etanol al 70% y déjelas secar bajo la campana de flujo estéril. Espere un mínimo de tres horas antes de continuar.

Coloque cada cubreobjetos en un pocillo de una placa de seis pocillos. Luego, coloque el dispositivo microfluídico sobre el cubreobjetos y presione suavemente pero firmemente con la pinza para permitir una adhesión completa entre el dispositivo de aislamiento y el cubreobjetos de vidrio. A continuación, agregue mediante pipeta 150 microlitros de poli-D-lisina al 0,1 miligramos por mililitro en cada una de las cámaras de cultivo.

Luego, coloque los dispositivos microfluídicos bajo vacío durante cinco minutos para eliminar todo el aire de las cámaras. Si aún se observa aire dentro de las cámaras, repita la adición de la solución de poli-D-lisina en las cámaras.

Incube los dispositivos con poli-L-lisina durante la noche a 37 grados Celsius al día siguiente. Lave las cámaras tres veces con agua destilada estéril y luego llene las cámaras con 150 microlitros de solución de trabajo de laminina al cinco microgramos por mililitro e incube durante la noche a 37 grados Celsius. A continuación, prepare los medios para los cultivos de ganglios trigéminos y gérmenes dentales según se describe en el protocolo de texto adjunto.

Limpie el área de disección y el estereoscopio con etanol al 70 % y coloque los instrumentos de disección tras el sacrificio. Diseque la piel alrededor del abdomen inferior de un ratón preñado con embriones en estadio E 14.5 a E 17.5. Luego abra cuidadosamente el abdomen utilizando tijeras.

Localice el útero, retírelo y colóquelo en un tubo lleno de hielo. Enfríe con PBS frío, diseca los embriones y colóquelos individualmente en una nueva placa de Petri con PBS frío. Una vez que todos los embriones hayan sido separados de los tejidos extraembrionarios, seccionar sus cabezas utilizando tijeras.

Seccione la mandíbula inferior del resto de la cabeza mediante disección microquirúrgica con tijeras, teniendo cuidado de no dañar los ganglios trigéminos. A continuación, tome la cabeza y colóquela sobre una placa de vidrio para disección fría en una placa de Petri. Utilice pinzas para retirar la piel y el cráneo.

Luego, coloque la pinza por debajo del cefalón y levante. Para retirar el cefalón y el cerebelo, localice los ganglios trigeminales y utilice la pinza y las agujas de disección para separar los ganglios trigeminales de los nervios trigeminales y limpie los ganglios. Guárdelos en PBS frío utilizando las agujas de disección como cuchillos.

Retire la lengua y la piel que rodea la mandíbula. Separe las hemimandíbulas izquierda y derecha cortando a lo largo de la línea media de la mandíbula. Luego, localice los gérmenes dentales y aíslelos utilizando agujas de disección. Después del disección de los ganglios trigéminos y los gérmenes dentales, retire la laminina de los dispositivos microfluídicos y llene las cámaras con 200 microlitros del medio respectivo.

Con pinzas, transfiera suavemente los ganglios trigéminos disecados y los gérmenes dentales a los orificios creados con un punzón de biopsia. Asegúrese de que los gérmenes dentales no floten y de que se hundan hasta que hagan contacto con las laminillas. Incube las muestras en un incubador a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono.

Cambie el medio de cultivo cada 48 horas durante 10 días para renovar el medio. Primero, retire el medio dirigiendo la pipeta hacia el lado externo de los pocillos. Luego, agregue el medio precalentado fresco al lado de los pocillos ubicado opuesto a las cámaras durante el período de cultivo.

Obtenga imágenes de los cultivos co mediante microscopía óptica en cualquier momento. Después del período de cultivo, lave las cámaras pipeteando 150 microlitros de PBS en un pozo por cámara y permitiendo que el PBS fluya a través de las cámaras. Repita el lavado un total de tres veces tras el último lavado.

Elimine el PBS y fije las muestras pipeteando 150 microlitros de paraformaldehído al 4 % en PBS en un pocillo por cámara, permitiendo que fluya hacia la otra cámara. Incube el dispositivo a temperatura ambiente durante 15 minutos. Luego lave las cámaras dos veces con PBS y continúe con análisis adicionales, como tinción por inmunofluorescencia y obtención de imágenes del crecimiento celular.

Durante el cultivo en colaboración, las neuritas de los ganglios trigéminos se ramifican desde su compartimento de cultivo y se extienden hacia el germen dental en desarrollo. A mayor aumento, se pueden observar las neuritas extendiéndose a través de las cámaras axonales y los surcos microscópicos del dispositivo microfluídico. El progreso del crecimiento nervioso puede rastrearse a lo largo del tiempo para describir el desarrollo de la innovación.

Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la extracción de ARN o PROTEINIZACIÓN para estudiar, por ejemplo, los cambios en la expresión génica o en la secreción de proteínas en los tejidos diana tras la innovación.