Name: Análisis de Desarrollo del diente Germ Inervación Uso de dispositivos de microfluidos Co-cultura (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Aprende a aislar y co-cultivar ganglios trigeminales y germenes dentales en dispositivos microfluídicos. Este método permite estudiar la inervación neuronal y las interacciones tejido-nervio en biología del desarrollo.

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El trabajo fue financiado por la Universidad de Zúrich. Los autores desean agradecer a Estrela Neto y a la Dra. Meriem Lamghari por ayudar a establecer las condiciones de co-cultivo.

Todos los ratones fueron mantenidos y manejados de acuerdo a la Ley de Protección de los Animales de Suiza y en cumplimiento de la normativa de la oficina cantonal Veterinaria, Zurich. 1. Preparación de Material de disección, Medios de Cultivo, dispositivos de microfluidos <ol><li> Fórceps Autoclave micro-disección y tijeras (121 ° C, tiempo de esterilización: 20 min) y almacenarlos en un recipiente estéril. </li><li> Esterilizar cubreobjetos de vidrio (24 mm x 24 mm) mediante su incubación en HCl 1 M durante 24 h en un agitador orbital a 37 ° C. Lavar tres veces con ellos, H 2 O destilada estéril y tres veces con etanol 99%. Seco entonces los cubreobjetos a 37 ° C o bajo campana de flujo estéril. Por último, en autoclave o exponer los cubreobjetos a la luz UV (30 min) para completar la esterilización. Los cubreobjetos se pueden almacenar entonces en etanol al 70%. </li><li> Retire con cuidado los dispositivos de aislamiento AXIS Axon del paquete usando pinzas estériles y colocarlos en una placa de Petri estéril. </li&gt; <li> Usando un punzón de biopsia estéril (ø: 1 mm) crear un agujero por muestra a ser cultivados (Figura 1) en correspondencia de las cámaras de cultivo. NOTA: No perfore demasiado cerca de los microsurcos, ya que podrían ser dañados por la presión aplicada. </li><li> Esterilizar los dispositivos de aislamiento AXIS Axon sumergiéndola en etanol al 70%. Seque luego Dispositivos de aislamiento AXIS Axon y cubreobjetos completamente bajo una campana de flujo estéril. Espere un mínimo de 3 horas antes de proceder. NOTA: secado incompleto resultará en el montaje defectuoso de los dispositivos de microfluidos. </li><li> Coloque cada cubreobjetos en una placa de Petri de 35 mm o en un pozo dentro de una placa de 6 pocillos. </li><li> Coloque el aislamiento de dispositivos AXIS Axon en el cubreobjetos y presione suavemente pero con firmeza con un fórceps con extremos doblados con el fin de permitir la plena adherencia entre el dispositivo de aislamiento y el cubreobjetos de vidrio. </li><li> En cada cámara de cultivo, pipeta 150 l de poli-D-lisina (0,1 mg / ml en estéril, destilada H 2O). Coloque los dispositivos de microfluidos bajo vacío durante 5 min, a fin de eliminar todo el aire de las cámaras de cultivo. </li><li> Si el aire todavía se puede ver dentro de la cámaras, re-pipeta la solución de poli-D-lisina en las cámaras. </li><li> Incubar los dispositivos con O poli-D-lisina / N a 37 ° C. </li><li> Lávese las cámaras tres veces con estéril, H2O destilada </li><li> Rellene cámaras con 150 l solución laminina trabajo (Sigma-Aldrich, 5 mg / ml, en PBS o medio libre de suero), e incubar O / N a 37 ° C. </li><li> Preparar 50 ml de medio para cultivos de ganglios del trigémino 37, compuesta como sigue: 48 ml Neurobasal medio, 1 ml B-27, 100 U de estreptomicina, 2 mM L-glutamina, 5 ng / ml de factor de penicilina / / ml de crecimiento nervioso (NGF) , arabinósido de citosina 24:25. </li><li> Preparar 50 ml de medio para cultivos germinales diente 37, compuesta como sigue: 40 ml de DMEM-F12, 10 ml de suero fetal bovino (FBS, concentración final: 20%), 100 U / ml de penicilina / estreptomicina, 2 mM L-glutamina, 150 mg / ml de ácido ascórbico. </li></ol> 2. Generación de embriones de ratón y disección <ol><li> Determinar la edad embrionaria acuerdo con tapón vaginal (tapón vaginal: día embrionario de desarrollo 0.5, E0.5) y confirmarla mediante criterios morfológicos. Para este protocolo, por lo general usamos embriones de ratón E14.5-E17.5. </li><li> Limpie el área de disección y el estereoscopio con etanol al 70%. </li><li> Sacrificar la madre embarazada a través de la dislocación cervical. Bloquear el cuello del ratón con el primer y segundo dedo sobre una rejilla y tire con la decisión de la cola. </li><li> Diseccionar la piel alrededor del abdomen inferior, y abrir el abdomen con unas tijeras. Busque el útero: durante tales etapas finales del embarazo, el útero abundantemente llenar la cavidad abdominal. </li><li> Diseccionar el útero y colocar en un tubo lleno de PBS en hielo. Cuando en el hielo, el tejido se puede dejar para varias horas. Deseche el cadáver de la madre según las directrices institucionales </li> &lt;li&gt; diseccionar los embriones del útero y liberarlos de sus tejidos extraembrionarias. Coloca los embriones en PBS en hielo. </li><li> Decapitar a los embriones con unas tijeras, y separar la mandíbula inferior del resto de la cabeza con unas tijeras micro-disección (Figura 2). Eliminar precisamente la mandíbula inferior, sin dañar los ganglios del trigémino; como este último se localizan en las proximidades de la mandíbula inferior, su daño accidental es posible. Preservar la mandíbula inferior y el resto de la cabeza en PBS frío, en hielo. </li><li> Para diseccionar TG, toma la cabeza y colocarla en una placa de Petri de vidrio de la disección, previamente llenado con PBS frío. Usando las pinzas, quitar la piel y el cráneo. Retire entonces el telencéfalo y el cerebelo colocando fórceps debajo del telencéfalo y ascensor; el telencéfalo y el cerebelo le dará la vuelta juntos, dejando la parte inferior del cráneo expuesta. </li><li> Localizar los ganglios del trigémino (que se muestra en la Figura 2B). Utilice las pinzaspara separar el TG de los nervios trigémino. Elimine los restos de las proyecciones del trigémino usando las agujas de disección como cuchillos. Coloque el TG diseccionado en una placa de Petri llena de PBS frío y mantenerlos en hielo. </li><li> Para diseccionar dientes embrionarias, colocar la mandíbula inferior, separado previamente del cráneo, en la placa de Petri de vidrio disección, lleno de PBS frío. El uso de agujas de disección como cuchillos, retire la lengua y la piel que rodea la mandíbula. Separar el los hemi-mandíbulas izquierdo y derecho cortando a lo largo de la línea media de la mandíbula. Los gérmenes de los dientes son fácilmente visibles, como se muestra en la Figura 1C. Aislar los gérmenes de dientes utilizando agujas de disección y retirar el exceso de tejidos no dentales. Coloca los gérmenes de dientes disecados en una placa de Petri llena de PBS frío y mantenerlos en hielo. </li></ol> 3. microfluidos Co-culturas <ol><li> Después de la disección, laminina eliminar de los dispositivos de microfluidos. Llenar las cámaras con 200 l de la respecticinco medios de comunicación. </li><li> Con unas pinzas, transfiera suavemente los TG y diente gérmenes disecados en los agujeros creados por la perforación (Figura 1D). Asegúrese de que los gérmenes de dientes no flotan y que se hunden hasta que entran en contacto con los cubreobjetos. </li><li> Cultura las muestras en incubadora a 37 ° C, 5% de CO 2. </li><li> Cambie el medio de cultivo cada 48 horas. No vaciar las cámaras por completo, y no pipetear directamente en las cámaras de cultivo. El vaciado completo de las cámaras daría lugar a la formación de burbujas de aire dentro de las cámaras; pipeteado directa en la cámara podría resultar en daño axonal. Para evitar estos problemas, se elimina el medio que señala la pipeta hacia el lado externo de los pozos; Del mismo modo, pipetear el medio fresco en el lado de los pozos situados frente a las cámaras. </li><li> Durante el período de cultivo, co-cultivos pueden ser fácilmente imágenes de microscopía de lapso de tiempo. Co-culturas se pueden mantener por más de 10 días. </li><li> Después de que el perio culturad, lavar las cámaras con la pipeta 150 l de PBS en un pocillo por cámara, y dejando PBS fluya a través de las cámaras de tres veces. </li><li> Retire el PBS y fijar las muestras con la pipeta 150 l de paraformaldehído al 4% (en PBS) en un pozo por cada cámara; incubar a TA durante 15 min. </li><li> Lavar las cámaras dos veces con PBS como se describe en 3.6. </li><li> Continúe con su posterior análisis. </li></ol>

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<li>Pagella, P., Neto, E., Jiménez-Rojo, L., Lamghari, M., Mitsiadis, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+co-culture+systems+for+studying+tooth+innervation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+physiology%22%5BJournal%5D)">Microfluidics co-culture systems for studying tooth innervation.</a> Frontiers in physiology. 5 (August), (2014).</li>
<li>Connor, R., Tessier-Lavigne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+maxillary+factor%2C+a+maxillary+process-derived+chemoattractant+for+developing+trigeminal+sensory+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Identification of maxillary factor, a maxillary process-derived chemoattractant for developing trigeminal sensory axons.</a> Neuron. 24, 165-178 (1999).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Anterior en estudios in vitro de la inervación de los dientes estaban basados ​​en co-cultivos convencionales de los ganglios del trigémino y los tejidos o células 26,28,29 dentales. Estos estudios se realizaron para investigar principalmente los efectos atractivos de estas células o tejidos en los axones sensoriales 38. Aunque trayendo avances significativos en el campo, se plantearon varias cuestiones técnicas. Gérmenes de dientes empiezan a degenerar después de pocos días de cu...

Inervación juega un papel clave en el desarrollo, la homeostasis y la regeneración de órganos y tejidos 1,2. Además, la inervación está implicado en la regulación de la proliferación de células madre, la movilización y diferenciación 3 - 5 de. De hecho, estudios recientes realizados en los tejidos del complejo orofacial han demostrado que los nervios parasimpáticos son necesarios para la función de las células progenitoras epiteliales durante el desarrollo y la regeneración de la glándulas salivales 6,7. Del mismo modo, se ha demostrado que la inervación es necesaria para el desarrollo y mantenimiento de las papilas gustativas 8-11. Por lo tanto, es importante analizar los papeles todavía descuidados de la inervación en el desarrollo de otros órganos y tejidos orofaciales importantes tales como dientes. A pesar de la rica inervación de los dientes adultos, y en contraste con todos los demás órganos y tejidos del cuerpo, Develode ping dientes comienzan a ser inervado en las etapas postnatales tempranas. Los dientes se desarrollan como resultado de las interacciones secuenciales y recíproca entre el ectodermo oral y craneal mesénquima derivadas de la cresta neural. Estas interacciones dan lugar a ameloblastos epiteliales derivadas de mesénquima y odontoblastos derivados que son responsables de la formación del esmalte y la dentina, respectivamente 12. Los nervios sensoriales de los ganglios del trigémino y los nervios simpáticos de los ganglios cervicales superiores inervan los dientes adultos 13-15. Durante la embriogénesis, las fibras nerviosas que emana del proyecto ganglios del trigémino hacia los gérmenes dentales en desarrollo y progresivamente los rodean, pero que no penetran en el mesénquima papila dental 13. Las fibras nerviosas entran en el mesénquima de pasta dental en las etapas de desarrollo más avanzados que se correlacionan con la diferenciación de odontoblastos y la matriz de dentina deposición 16. Inervación pulpa dental es complETED poco después de la erupción del diente en la cavidad oral 13. Estudios anteriores han revelado que varios semaforinas y las neurotrofinas están implicadas en la regulación de la inervación durante odontogenesis 16-19. Estudios anteriores han demostrado claramente que la inervación es un requisito previo para la formación de los dientes en los peces 20. Estudios más recientes han demostrado que la homeostasis de las células madre mesenquimales dental en incisivos ratón está regulada por los nervios sensoriales a través de la secreción de sonic hedgehog (Shh) 21. Sin embargo, el papel de la inervación en diente de iniciación, el desarrollo y la regeneración es todavía muy controvertido en mamíferos 22-24. Una gran cantidad de estudios in vivo han proporcionado información importante acerca de los patrones de inervación de los tejidos dentales durante los procesos de desarrollo y reparación de diversos modelos animales 13,25,26. Sin embargo, la mayoría de estos APPROdolores no son óptimas para resaltar las bases moleculares de las interacciones entre las fibras nerviosas y órganos diana y tejidos. Co-culturas constituyen un valioso método para investigar y manipular las interacciones entre las fibras nerviosas y los dientes en un ambiente controlado y aislado 26-29. Al mismo tiempo, co-cultivo está sujeto a diversos ajustes técnicos. Por ejemplo, los nervios y los tejidos dentales específicos (por ejemplo, la pulpa dental, folículo dental, epitelio dental) a menudo requieren diferentes medios de cultivo con el fin de garantizar la supervivencia del tejido durante largos períodos de tiempo 30-32. En las últimas décadas, se han realizado co-cultivos convencionales utilizando el mismo medio de cultivo durante períodos muy cortos (por ejemplo, dos días) para investigar los efectos de atracción o repulsión de desarrollar tejidos bucales y dentales en las fibras nerviosas sensoriales 27-29.Sin embargo, se requiere la extensión del período de cultivo para investigar los efectos de la inervación de la morfogénesis y dientes citodiferenciación, y para estudiar la dinámica de las fibras nerviosas se ramifican en los órganos diana. Por lo tanto, co-cultivos no contiguos serían más adecuados para llevar a cabo estudios sobre neuronales dental tejidos interacciones. Sistemas de microfluidos permiten co-cultivos de neuronas y diferentes tipos de células en su medio de cultivo apropiado. En estos dispositivos, los tejidos dentales y las neuronas se separan en diferentes compartimentos, mientras que permite el crecimiento de los axones de los cuerpos de las células neuronales a través de microcanales hacia el compartimento que contiene su tejido diana 33. Los dispositivos microfluídicos han sido ya utilizado para estudiar las interacciones entre las neuronas y la microglia 34,35, así como interacciones célula a célula en el cáncer y la neovascularización 35. Además, estos sistemas se han utilizado para estudiar las interacciones entre dorsal ganglios de la raíz y osteoblastos 36. Hemos demostrado recientemente que los ganglios del trigémino (TG) y los dientes son capaces de sobrevivir por largos períodos de tiempo cuando se co-cultivaron en dispositivos de microfluidos 37. Por otra parte, hemos demostrado que los dientes de las diferentes etapas de desarrollo mantienen en estas condiciones in vitro los mismos efectos repulsivas o atractivas en la inervación del trigémino que muestran in vivo 37. Este protocolo proporciona información acerca de una forma sencilla, potente y flexible para co-cultura ganglios / nervios y los tejidos diana y para estudiar los papeles de moléculas específicas en tales interacciones en un ambiente controlado y aislado.

<table><tbody><tr><td>Dispositivos de aislamiento de axones AXIS</td><td>Millipore</td><td>AX15010-TC</td><td>Microcanales de diferentes longitudes están disponibles</td></tr><tr><td>Laminina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504</td><td></td></tr><tr><td>Ratón recombinante beta-NGF</td><td>R& D Systems</td><td>1156-NG-100</td><td>Humano y Rata beta-NGF (R& D Systems) son equivalentes</td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>Gibco</td><td>11320-033</td><td></td></tr></tbody></table>

análisis de desarrollo del diente germ inervación uso de dispositivos de microfluidos co-cultura

Analysis of Developing Tooth Germ Innervation Using Microfluidic Co-culture Devices

Inervación juega un papel clave en el desarrollo, la homeostasis y la regeneración de órganos y tejidos. Sin embargo, los mecanismos subyacentes a estos fenómenos no son bien entendidos todavía. En particular, se descuida el papel de la inervación en desarrollo de los dientes y la regeneración. Varios estudios in vivo han proporcionado información importante acerca de los patrones de inervación de los tejidos dentales durante los procesos de desarrollo y reparación de diversos modelos animales. Sin embargo, la mayoría de estos enfoques no son óptimas para resaltar las bases moleculares de las interacciones entre las fibras nerviosas y órganos diana y tejidos. Co-culturas constituyen un valioso método para investigar y manipular las interacciones entre las fibras nerviosas y los dientes en un ambiente controlado y aislado. En las últimas décadas, se han realizado co-cultivos convencionales utilizando el mismo medio de cultivo durante períodos muy cortos (por ejemplo, dos días)para investigar los efectos de atracción o repulsión de desarrollar tejidos bucales y dentales en las fibras nerviosas sensoriales. Sin embargo, se requiere la extensión del período de cultivo para investigar los efectos de la inervación de la morfogénesis y dientes citodiferenciación. Sistemas de microfluidos permiten co-cultivos de neuronas y diferentes tipos de células en su medio de cultivo apropiado. Hemos demostrado recientemente que los ganglios del trigémino (TG) y los dientes son capaces de sobrevivir durante un largo período de tiempo cuando se co-cultivaron en dispositivos de microfluidos, y que se mantienen en estas condiciones el mismo patrón de inervación que muestran in vivo. Sobre esta base, se describe cómo aislar y co-desarrollo de la cultura y de los ganglios del trigémino diente gérmenes en el protocolo de un co-cultivo de microfluidos sistema.Este describe una forma simple y flexible para co-cultura ganglios / nervios y los tejidos diana y para estudiar los papeles de moléculas específicas sobre tales interacciones en un controlled y entorno aislado.

Estos resultados muestran que los ganglios del trigémino aislados pueden crecer en un compartimiento del dispositivo de microfluidos y, además, que el desarrollo de los gérmenes de los dientes aislados se mantiene durante un largo período de tiempo en el otro compartimento del dispositivo de microfluidos. Diferentes medios de cultivo se utilizan en los dos compartimentos, y los microsurcos entre los dos compartimentos permitir la extensión de axones desde el ganglio del trigémino hacia los gérmenes dentales en desarroll...

Los cocultivos representan un método valioso para estudiar las interacciones entre los nervios y los tejidos y órganos diana. Los sistemas microfluídicos permiten el cocultivo de ganglios y órganos o tejidos enteros en desarrollo en diferentes medios de cultivo, lo que representa una valiosa herramienta para el estudio in vitro de la diafonía entre las neuronas y sus dianas.

Análisis de Desarrollo del diente Germ Inervación Uso de dispositivos de microfluidos Co-cultura

Innervation plays a key role in the development, homeostasis and regeneration of organs and tissues. However, the mechanisms underlying these phenomena ...

El objetivo general de este procedimiento es mostrar cómo aislar y cultivar conjuntamente los ganglios trigéminos en desarrollo y los gérmenes dentales. Esto se logra primero esterilizando, montando y recubriendo los dispositivos microfluídicos. El segundo paso consiste en diseccionar los ganglios trigéminos y los gérmenes dentales a partir de una etapa de desarrollo específica en el ratón de interés.A continuación, los ganglios trigéminos y los gérmenes dentales se colocan en los dispositivos microfluídicos y se cultivan en co-cultivo. El último paso consiste en fijar las células y teñirlas mediante inmunofluorescencia. Finalmente, se utiliza microscopía para mostrar el patrón de inervación resultante del co-cultivo.La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como los cultivos co convencionales, es que este método permite el cultivo co de diferentes órganos y tejidos, cada uno en su medio de cultivo óptimo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la formación de dientes, como el papel de diferentes moléculas en la formación de dientes y la función de la formación en el desarrollo dentario. Comience por autoclavar las herramientas de disección, que incluyen un par de pinzas de microdisección y un par de tijeras.A continuación, esterilice un lote de cubreobjetos de vidrio de 24 milímetros por 24 milímetros colocándolos en una solución de ácido clorhídrico uno molar en un agitador orbital a 37 grados Celsius durante 24 horas. Luego lave los cubreobjetos tres veces con agua destilada estéril, seguido de tres enjuagues con etanol al 99 %, séquelos bajo una campana de flujo estéril; una vez secos, encienda la luz ultravioleta de la campana durante 30 minutos. A continuación, almacene los cubreobjetos en etanol al 70 % hasta que sean necesarios.A continuación, utilice fórceps estériles para retirar cuidadosamente los dispositivos microfluídicos de aislamiento de axones de su envase y colóquelos en una placa de Petri estéril utilizando un punzón estéril de biopsia de un milímetro. Cree un orificio en los dispositivos para cada muestra, en correspondencia con las cámaras de cultivo.Tenga cuidado de no perforar demasiado cerca de las microranuras, ya que podrían dañarse por la presión. A continuación, esterilice los dispositivos sumergiéndolos en etanol al 70%. Teniendo cuidado de eliminar todo el aire atrapado.Luego retire los dispositivos del etanol y séquelos completamente bajo una campana de flujo estéril. Asimismo, retire las laminillas de la solución de etanol al 70% y déjelas secar bajo la campana de flujo estéril. Espere un mínimo de tres horas antes de continuar.Coloque cada cubreobjetos en un pocillo de una placa de seis pocillos. Luego, coloque el dispositivo microfluídico sobre el cubreobjetos y presione suavemente pero firmemente con la pinza para permitir una adhesión completa entre el dispositivo de aislamiento y el cubreobjetos de vidrio. A continuación, agregue mediante pipeta 150 microlitros de poli-D-lisina al 0,1 miligramos por mililitro en cada una de las cámaras de cultivo.Luego, coloque los dispositivos microfluídicos bajo vacío durante cinco minutos para eliminar todo el aire de las cámaras. Si aún se observa aire dentro de las cámaras, repita la adición de la solución de poli-D-lisina en las cámaras.Incube los dispositivos con poli-L-lisina durante la noche a 37 grados Celsius al día siguiente. Lave las cámaras tres veces con agua destilada estéril y luego llene las cámaras con 150 microlitros de solución de trabajo de laminina al cinco microgramos por mililitro e incube durante la noche a 37 grados Celsius. A continuación, prepare los medios para los cultivos de ganglios trigéminos y gérmenes dentales según se describe en el protocolo de texto adjunto.Limpie el área de disección y el estereoscopio con etanol al 70 % y coloque los instrumentos de disección tras el sacrificio. Diseque la piel alrededor del abdomen inferior de un ratón preñado con embriones en estadio E 14.5 a E 17.5. Luego abra cuidadosamente el abdomen utilizando tijeras.Localice el útero, retírelo y colóquelo en un tubo lleno de hielo. Enfríe con PBS frío, diseca los embriones y colóquelos individualmente en una nueva placa de Petri con PBS frío. Una vez que todos los embriones hayan sido separados de los tejidos extraembrionarios, seccionar sus cabezas utilizando tijeras.Seccione la mandíbula inferior del resto de la cabeza mediante disección microquirúrgica con tijeras, teniendo cuidado de no dañar los ganglios trigéminos. A continuación, tome la cabeza y colóquela sobre una placa de vidrio para disección fría en una placa de Petri. Utilice pinzas para retirar la piel y el cráneo.Luego, coloque la pinza por debajo del cefalón y levante. Para retirar el cefalón y el cerebelo, localice los ganglios trigeminales y utilice la pinza y las agujas de disección para separar los ganglios trigeminales de los nervios trigeminales y limpie los ganglios. Guárdelos en PBS frío utilizando las agujas de disección como cuchillos.Retire la lengua y la piel que rodea la mandíbula. Separe las hemimandíbulas izquierda y derecha cortando a lo largo de la línea media de la mandíbula. Luego, localice los gérmenes dentales y aíslelos utilizando agujas de disección. Después del disección de los ganglios trigéminos y los gérmenes dentales, retire la laminina de los dispositivos microfluídicos y llene las cámaras con 200 microlitros del medio respectivo.Con pinzas, transfiera suavemente los ganglios trigéminos disecados y los gérmenes dentales a los orificios creados con un punzón de biopsia. Asegúrese de que los gérmenes dentales no floten y de que se hundan hasta que hagan contacto con las laminillas. Incube las muestras en un incubador a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono.Cambie el medio de cultivo cada 48 horas durante 10 días para renovar el medio. Primero, retire el medio dirigiendo la pipeta hacia el lado externo de los pocillos. Luego, agregue el medio precalentado fresco al lado de los pocillos ubicado opuesto a las cámaras durante el período de cultivo.Obtenga imágenes de los cultivos co mediante microscopía óptica en cualquier momento. Después del período de cultivo, lave las cámaras pipeteando 150 microlitros de PBS en un pozo por cámara y permitiendo que el PBS fluya a través de las cámaras. Repita el lavado un total de tres veces tras el último lavado.Elimine el PBS y fije las muestras pipeteando 150 microlitros de paraformaldehído al 4 % en PBS en un pocillo por cámara, permitiendo que fluya hacia la otra cámara. Incube el dispositivo a temperatura ambiente durante 15 minutos. Luego lave las cámaras dos veces con PBS y continúe con análisis adicionales, como tinción por inmunofluorescencia y obtención de imágenes del crecimiento celular.Durante el cultivo en colaboración, las neuritas de los ganglios trigéminos se ramifican desde su compartimento de cultivo y se extienden hacia el germen dental en desarrollo. A mayor aumento, se pueden observar las neuritas extendiéndose a través de las cámaras axonales y los surcos microscópicos del dispositivo microfluídico. El progreso del crecimiento nervioso puede rastrearse a lo largo del tiempo para describir el desarrollo de la innovación.Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la extracción de ARN o PROTEINIZACIÓN para estudiar, por ejemplo, los cambios en la expresión génica o en la secreción de proteínas en los tejidos diana tras la innovación.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Este estudio describe los procedimientos de instalación de un axón neuronal y la novela (astro) glia plataforma de co-cultivo. En este sistema de co-cultivo, la manipulación de la interacción directa entre un solo axón (y células gliales único) se hace factible, permitiendo un análisis mecanicista de la neurona mutuo de señalización gliales.

Análisis de imágenes de Neuron a la interacción glía en la Plataforma Cultura Microfluidic (MCP)-basada en Axón Neuronal y Sistema Glia Co-cultura

El video muestra la formación de uniones neuromusculares utilizando un dispositivo microfluídico. Las células precursoras neurales y las células progenitoras musculares se siembran en diferentes pocillos dentro del dispositivo y se dejan madurar en neuronas motoras y miotubos, respectivamente. La creación de un gradiente químico y de volumen conduce al desarrollo de uniones neuromusculares activas.

Generación de uniones neuromusculares mediante un dispositivo microfluídico

Este video muestra una técnica para establecer un cocultivo de neuronas trigémino y células primarias de pulpa dental utilizando un filtro transwell. En esta condición físicamente separada, las células mesenquimales obtenidas del tejido de la pulpa dental secretan moléculas de señalización paracrina que atraviesan los poros, promoviendo la diferenciación y migración de las neuronas hacia las células mesenquimales estableciendo un sistema de cocultivo.

Establecimiento de un cocultivo de células de pulpa dental y neuronas del trigémino para la comunicación cruzada

Este video muestra la utilización de un dispositivo microfluídico para estudiar las interacciones entre la pulpa germinal dental y los ganglios del trigémino. Muestra la ubicación de los tejidos dentro del dispositivo microfluídico y proporciona una visualización detallada del crecimiento de la neurita trigémino hacia el germen dental a través de las microranuras del dispositivo. Además, destaca el papel de los factores moleculares derivados del diente en la promoción o inhibición de la...

Análisis de las interacciones entre el germen dental y los ganglios del trigémino mediante un sistema de cocultivo microfluídico

Este video demuestra la evaluación de la actividad eléctrica neuronal en un cocultivo de neuronas glutamatérgicas corticales derivadas de hiPSC y células de glioma utilizando un dispositivo microfluídico con matrices de electrodos múltiples.

Evaluación de las interacciones entre las neuronas glutamatérgicas y las células de glioma en un cocultivo

Aquí detallamos un método de cultivo de gérmenes dentales en rodajas mandíbula usando un cortador de tejidos. Este método permite un acceso único a los dientes durante el desarrollo, que proporciona una excelente oportunidad para la manipulación y el linaje de rastreo, no está disponible utilizando métodos de cultivo más tradicionales.

El método de cultivo de la rebanada por Siguiendo desarrollo de gérmenes de dientes en Explante Cultura

Se describen protocolos para sola neurona arraying microfluidos y el enmascaramiento de agua para el patrón de plasma en el chip de recubrimientos de biomateriales. Co-cultivos altamente interconectadas se pueden preparar usando entradas de celda mínimos.

Preparación de Neuronales Co-culturas con precisión Single Cell

Describimos el aislamiento, dispersión y chapado de células primarias de pulpa dental (DP) con neuronas trigéminos (TG) cultivadas sobre filtros transwell. Las respuestas celulares de las células DP se pueden analizar con inmunofluorescencia o análisis de ARN/proteína. La inmunofluorescencia de marcadores neuronales con microscopía confocal permite el análisis de las respuestas de crecimiento de neurita.

Un método de cocultura para estudiar el crecimiento de Neurita en respuesta a las señales de paracrina de pulpa dental

El método de cultivo de órganos tipo Trowell se ha utilizado para desentrañar redes de señalización complejas que gobiernan el desarrollo de los dientes y, más recientemente, para estudiar la regulación involucrada en las células madre del incisivo de ratón en continuo crecimiento. Los modelos animales de reporteros fluorescentes y los métodos de imágenes en vivo facilitan los análisis en profundidad de las células madre dentales y su microambiente de nicho específico.

Uso del cultivo de órganos tipo Trowell para estudiar la regulación de las células madre dentales

Trabajos recientes descubren el impacto neuronal en las células de glioma pediátrico de alto grado (pHGG) y sus interacciones recíprocas. El presente trabajo muestra el desarrollo de un modelo in vitro que co-cultiva células pHGG y neuronas glutamatérgicas y registra sus interacciones electrofisiológicas para imitar esas interactividades.

Cocultivo de neuronas glutamatérgicas y células pediátricas de glioma de alto grado en dispositivos microfluídicos para evaluar las interacciones eléctricas

neuroHuMiX es un modelo avanzado de intestino en un chip para estudiar las interacciones de células bacterianas, epiteliales y neuronales en condiciones de cocultivo proximales y representativas. Este modelo permite desentrañar los mecanismos moleculares que subyacen a la comunicación entre el microbioma intestinal y el sistema nervioso.

Un modelo de intestino en un chip para estudiar el eje microbioma intestinal-sistema nervioso

Aprende a aislar y co-cultivar ganglios trigeminales y germenes dentales en dispositivos microfluídicos. Este método permite estudiar la inervación neuronal y las interacciones tejido-nervio en biología del desarrollo.

Análisis de Desarrollo del diente Germ Inervación Uso de dispositivos de microfluidos Co-cultura

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