Captura óptica de nanopartículas plasmónicas para caracterizaciones de espectroscopía Raman mejorada en superficie in situ
23 de junio de 2022
El presente protocolo describe un enfoque conveniente para integrar la captura óptica y la espectroscopia Raman mejorada en superficie (SERS) para manipular nanopartículas plasmónicas para la detección molecular sensible. Sin agentes agregadores, el láser de captura ensambla nanopartículas plasmónicas para mejorar las señales SERS de los analitos objetivo para mediciones espectroscópicas in situ .
Este protocolo proporciona control espacial y temporal para el ensamblaje de nanopartículas activas SERS en ausencia de agentes de agregación para lograr una detección sensible de analitos objetivo. La principal ventaja de nuestro método es que no se utilizan agentes de agregación para generar el conjunto de nanopartículas activas SERS, por lo que se utiliza adecuado para analizar biomoléculas sensibles en condiciones fisiológicas. Es una plataforma prometedora para detectar moléculas de analito, como biomarcadores de enfermedades, en soluciones y en condiciones fisiológicas en un sistema microfluídico.
Al usar este método por primera vez, un investigador puede necesitar ajustar la potencia del láser de captura, el tiempo de irradiación y la concentración de nanopartículas de plata para lograr el mejor rendimiento. Para comenzar, dirija un rayo láser de 532 nanómetros al puerto flexible del microscopio de pinza óptica. Alinee el rayo láser de 532 nanómetros en las vías estéreo de doble capa del microscopio de pinza óptica con un espejo dicroico de paso largo de 750 nanómetros para combinarlos con los rayos láser de captura originales para enfocar la cámara de muestra.
Recoja la luz retrodispersada de la cámara de muestras utilizando un espejo dicroico de paso largo de 750 nanómetros y rediríjala a un espectrómetro que contenga una cámara de dispositivo de carga acoplada refrigerada por nitrógeno líquido. Coloque un filtro de muesca de 532 nanómetros delante de la ranura de entrada del espectrómetro antes de la adquisición espectral. Limpie el portaobjetos de vidrio y cubra el deslizamiento con agua y etanol.
Fije la cinta adhesiva al portaobjetos de vidrio para crear una cámara. Agregue unas gotas de la solución DSNB de nanopartículas de plata en el marco. Coloque el cubreobjetos en la cinta del marco y séllelo.
Agregue nitrógeno líquido al recipiente de la cámara del dispositivo de carga acoplada refrigerada por nitrógeno líquido hasta que la temperatura alcance menos 120 grados centígrados. Bloquee la trayectoria del haz de la sonda Raman con una pantalla de seguridad láser magnética y, a continuación, encienda el láser de fuente de excitación Raman de 532 nan. Fije la cámara de muestra con la solución DSNB de nanopartículas de plata en el soporte de la cámara.
Agregue agua al objetivo sumergido en agua, luego coloque el soporte de la cámara inmediatamente en el microescenario sobre el objetivo. Coloque el aceite de inmersión sobre el deslizamiento de la cubierta y coloque el condensador sumergido en aceite para visualizar las partículas en la cámara del microscopio. Ajuste la posición Z del objetivo girando la perilla del microscopio hasta que el haz de sonda Raman de 532 nanómetros se enfoque en la superficie inferior de vidrio de la cámara, mostrando una mancha blanca en la cámara del microscopio.
Ajuste las posiciones X e Y de la microetapa para mover la cámara y colocar la región central de la cámara en el punto blanco. Abra el software de control de pinza óptica y use el control de joystick equipado para mover el láser de captura de 1.064 nanómetros para que se superponga con el punto blanco. A continuación, ajuste la perilla del microscopio para mover la posición Z del objetivo hacia arriba.
Encienda el láser de captura de 1.064 nanómetros para atraer nanopartículas de plata en la cámara de muestras y crear un conjunto plasmónico de nanopartículas de plata. Baje el rayo láser de captura para evitar el sobrecalentamiento o la formación de burbujas cuando sea necesario. Ajuste la posición de la microetapa de la muestra para colocar la mancha oscura del conjunto de nanopartículas de plata plasmónica bajo el foco del haz de sonda Raman de 532 nanómetros para mediciones espectroscópicas.
Coloque los filtros de densidad neutra frente a la salida láser Raman de 532 nanómetros para ajustar la potencia a 10 megavatios. Introduzca el tiempo de adquisición en el panel de configuración del software del espectro y haga clic en el botón Adquirir para iniciar la adquisición espectral. Sin el láser de captura, las nanopartículas de plata dispersas en la cámara de muestra generaron un espectro negro.
Aumentar la potencia y extender el tiempo de irradiación del láser de captura podría atraer más nanopartículas de plata y generar una mancha oscura. Dado que las nanopartículas de plata dispersas estaban bajo movimiento browniano, las uniones entre partículas eran grandes e inestables. Las intensidades generales de DSNB en el conjunto de nanopartículas de plata plasmónicas fueron más altas que las de la nanopartícula de plata dispersa.
Teniendo en cuenta la intensidad del pico característico a 1.444 centímetros inverso, el conjunto plasmónico de nanopartículas de plata puede proporcionar aproximadamente una mejora de 50 veces de la señal de espectroscopia Raman mejorada en superficie de DSNB en comparación con la de las nanopartículas de plata dispersas. Las intensidades de los picos característicos de DSNB en 1, 152, 1, 444 y 1, 579 centímetros inversas a través de estos 20 espectros Raman mejorados en superficie se trazaron como histogramas con desviaciones estándar relativas de 6.88, 6.59 y 5.48% respectivamente. Lo más importante en este procedimiento es localizar la posición del láser de sonda Raman de 532 nanómetros y superponerla con el láser de captura de 1.064 nanómetros.
Esta técnica allana el camino para que los investigadores detecten moléculas de analito con control espacial y temporal en condiciones fisiológicas para futuros análisis in vivo.
Descripción general
Este protocolo describe un método para integrar el trampado óptico con espectroscopia Raman mejorada por superficie (SERS) con el fin de manipular nanopartículas plasmónicas para la detección sensible de moléculas. El enfoque permite mediciones espectroscópicas in situ sin el uso de agentes agregantes, mejorando las señales SERS de los analitos objetivo.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- biofísica
- química analítica
Antecedentes
- El atrapamiento óptico y la espectroscopía SERS son técnicas potentes para la detección molecular.
- Los métodos tradicionales a menudo requieren agentes de agregación, que pueden interferir con el análisis de biomoléculas sensibles.
- Este estudio presenta un enfoque novedoso que elimina la necesidad de tales agentes.
- El método es adecuado para condiciones fisiológicas, lo que lo hace aplicable para la detección de biomarcadores.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un protocolo para ensamblar nanopartículas activas en espectroscopía de dispersión Raman mejorada por superficies (SERS) sin agentes de agregación.
- Mejorar la sensibilidad en la detección molecular en entornos fisiológicos.
- Proporcionar una plataforma para el análisis futuro in vivo de biomoléculas.
Métodos Utilizados
- Integración del atrapamiento óptico con SERS para la manipulación de nanopartículas.
- Uso de un láser de 532 nanómetros para la excitación y un láser de atrapamiento de 1.064 nanómetros.
- Ajuste de la potencia del láser y del tiempo de irradiación para lograr un ensamblaje óptimo de nanopartículas.
- Adquisición espectral mediante una cámara CCD refrigerada con nitrógeno líquido.
Resultados principales
- El ensamblaje de nanopartículas de plata plasmónica mostró un aumento de 50 veces en la señal de SERS en comparación con nanopartículas dispersas.
- Los picos característicos de los analitos se detectaron consistentemente con alta intensidad.
- Las desviaciones estándar relativas de los picos fueron bajas, lo que indica mediciones confiables.
- El método permite un control preciso sobre los aspectos espaciales y temporales del ensamblaje de nanopartículas.
Conclusiones
- Esta técnica proporciona un avance significativo en la detección de biomoléculas bajo condiciones fisiológicas.
- La ausencia de agentes de agregación mejora la fiabilidad de los resultados.
- Las aplicaciones futuras podrían incluir el análisis in vivo de biomarcadores de enfermedades.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Las plataformas integradas de trampa óptica y espectroscopía de dispersión Raman mejorada por superficies (SERS) abordan una necesidad crítica de detección molecular reproducible y ultrasensible en entornos fisiológicamente relevantes, sin necesidad de agentes químicos de agregación. Esta capacidad mejora la confianza predictiva en el descubrimiento de biomarcadores en etapas tempranas y apoya flujos de trabajo analíticos robustos para la interrogación de sistemas relacionados con enfermedades. El control espacial y temporal del método sobre el ensamblaje de nanopartículas permite análisis confiables y de baja perturbación, esenciales para las líneas de investigación traslacional.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la interrogación directa de dianas biomoleculares en solución bajo condiciones fisiológicas.
- Reduce la ambigüedad mecanicista al eliminar la interferencia de agentes agregantes en la detección molecular.
- Apoya la validación funcional de dianas mediante la amplificación reproducible y cuantitativa de la señal SERS.
- Facilita la confianza predictiva en la identificación y triaje tempranos de biomarcadores.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Proporciona una plataforma estandarizada y libre de agregación para la preparación de ensamblajes activos en SERS en sistemas microfluídicos o acuosos.
- Ofrece alta reproducibilidad y resultados cuantitativos con baja desviación estándar relativa entre mediciones.
- Permite el desarrollo escalable de ensayos para la detección sensible de compuestos o biomarcadores.
- Facilita la evaluación confiable de moléculas analito en concentraciones subnanomolares.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Se alinea con el análisis de sistemas relevantes para la enfermedad al permitir la detección in situ en entornos fisiológicos.
- Mantiene la continuidad traslacional desde el descubrimiento hasta la validación preclínica al minimizar la perturbación de las muestras.
- Reduce los riesgos en las decisiones de avance al proporcionar datos sólidos y reproducibles de caracterización molecular.
- Apoya los flujos de trabajo futuros de análisis de biomarcadores in vivo.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
Este método de atrapamiento óptico-SERS se integra en la continuidad desde el descubrimiento hasta la fase preclínica, apoyando la comprobación de hipótesis, la validación de objetivos y los flujos de trabajo de biomarcadores traslacionales.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la detección basada en hipótesis de analitos y la aclaración de vías en entornos similares a los nativos.
- Detección: Proporciona resultados cuantitativos y reproducibles de SERS para la preparación de ensayos y la evaluación de compuestos.
- Análisis: Ofrece mediciones espectrales robustas y resultados estadísticos para la comparación entre diferentes condiciones.
- Investigación Traducional: Permite la alineación de biomarcadores y su continuidad en modelos preclínicos con mínima perturbación.
- Reutilización Empresarial: Ofrece una capacidad analítica reutilizable y libre de agregación para diversas necesidades de detección molecular.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y la validación de objetivos al permitir la detección sensible y reproducible sin artefactos de agregación.
- Valor operativo: Estandariza la formación de ensamblajes activos para SERS y su medición, para flujos de trabajo escalables y reproducibles.
- Valor estratégico: Mejora la calidad de las decisiones de avance o interrupción de proyectos y la eficiencia del capital al reducir el riesgo analítico en etapas avanzadas.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización y el avance ajustados al riesgo de programas de biomarcadores y objetivos.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en trampas ópticas, instrumentación de SERS y análisis espectral.
- Necesita acceso a microscopios de pinzas ópticas con láser doble y espectrómetros CCD refrigerados con nitrógeno líquido.
- Exige la estandarización entre equipos de los parámetros de alineación del láser, potencia y adquisición.
- Adaptable a diversos sistemas de nanopartículas recubiertas con analitos y plataformas microfluídicas.
- El rendimiento puede depender del solapamiento espacial preciso y del control ambiental, tal como se indica en el protocolo.
