Name: Medición de la dinámica de protrusión del borde celular durante la propagación mediante microscopía de células vivas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 50 s
Description: Aprende a medir la dinámica de protrusiones del borde celular durante la propagación mediante microscopía de células vivas. Este ensayo accesible evalúa la motilidad celular sin necesidad de marcaje fluorescente.

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Este trabajo fue apoyado por las subvenciones NIH MH115939, NS112121, NS105640 y R56MH122449-01A1 (a Anthony J. Koleske) y de la Fundación de Ciencias de Israel (subvenciones número 1462/17 y 2142/21) (a Hava Gil-Henn).

Todos los métodos descritos en este protocolo han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad Bar-Ilan.
NOTA: En la figura 1 aparece una representación gráfica paso a paso del procedimiento descrito en esta sección.
1. Cultivo celular
NOTA: Las células utilizadas en el protocolo son fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) que se generaron a partir de embriones E11.5-13.5 de ratones C57BL/ 6 de tipo salvaje. Los MEFs primarios se generaron de acuerdo con el protocolo de laboratorio Jacks13. Las células de cinco embriones diferentes se agruparon e inmortalizaron mediante infección con un vector retroviral que expresa antígeno T grande SV40 seguido de selección con Histidinol de 4 mM durante 3 semanas.
<ol><li>Células de cultivo en placas de cultivo de tejidos que contienen el Medio Águila Modificada (DMEM) de Dulbecco que contiene 1 g/L de glucosa, 1% de glutamina, 1% de penicilina-estreptomicina y 10% de suero fetal bovino (FBS) (ver Tabla de Materiales), en una incubadora humidificada con 5% de CO2 a 37 °C.</li>
	<li>Cultive las células hasta una confluencia del 90% -95% y divida en una proporción de 1: 5 cada 2-3 días.</li>
</ol>2. Recubrimiento de plato con fondo de vidrio
NOTA: El recubrimiento del plato con fondo de vidrio debe realizarse en la campana de cultivo de tejidos en condiciones estériles.
<ol><li>Agregue 2 ml de solución de HCl 1N en el centro de un plato con fondo de vidrio (Tabla de materiales) e incube durante 20 min a temperatura ambiente (RT). NOTA: Esta etapa está destinada a eliminar los residuos del vidrio que pueden interrumpir las imágenes más adelante.</li>
	<li>Lave el plato con fondo de vidrio tres veces con 2 ml de 1x PBS (Tabla de Materiales) cada uno.</li>
	<li>Diluir la fibronectina (ver Tabla de Materiales) a 10 μg/mL en 1x PBS. Agregue 200 μL de la solución diluida de fibronectina al centro de vidrio del plato. Incubar a 37 °C (incubadora de cultivo de tejidos) durante 1 h. NOTA: Alternativamente, el plato con fondo de vidrio se puede incubar durante la noche a 4 ° C en una superficie plana.</li>
	<li>Durante el tiempo de incubación del recubrimiento de fibronectina, prepare una solución de BSA (Tabla de materiales) al 1% en 1x PBS, filtre a través de 0,2 μm y desnaturalice incubando a 70 ° C durante 30 min en un baño de agua precalentado.</li>
	<li>Lave el plato recubierto con fondo de vidrio tres veces con 2 ml de 1x PBS cada uno.</li>
	<li>Añadir 2 ml de solución de BSA desnaturalizada al centro de vidrio e incubar durante 1 h a 37 °C (incubadora de cultivo de tejidos). NOTA: Alternativamente, el plato con fondo de vidrio se puede incubar durante la noche a 4 ° C en una superficie plana.</li>
	<li>Lave el plato con fondo de vidrio 3 veces con 2 ml de 1x PBS cada uno. NOTA: La incubación de platos con fondo de vidrio con fibronectina debe realizarse durante al menos 1 h a 37 ° C para cubrir la superficie adecuadamente. Un tiempo de incubación más corto puede no producir un recubrimiento adecuado y, como resultado, el fenotipo celular puede no estar relacionado con la activación de la integrina. La capa BSA es inerte y no afectará la dinámica de protrusión y está destinada a bloquear los sitios potenciales libres para la adhesión celular independiente de la integrina. La BSA debe desnaturalizarse antes del recubrimiento para evitar que induzca la apoptosis celular, lo que puede influir en la dinámica del borde celular.</li>
</ol>3. Preparación de células para la obtención de imágenes
<ol><li>De dieciséis a dieciocho horas antes del experimento, las células alcancen una confluencia del 70% al 80% al día siguiente. Para los MEF, placa 0,7 x 106 células por placa de cultivo de tejido de 10 cm de diámetro un día antes de realizar el experimento. NOTA: Para un experimento de protrusión exitoso, es importante que las células se utilicen durante su fase de crecimiento logarítmico. Para lograr esto, las células deben alcanzar una confluencia del 70% al 80% el día del experimento. Una mayor densidad de células resultará en un mayor tiempo de propagación y / o impedimento en la unión durante el experimento.</li>
	<li>El día del experimento, agregue 2 ml de solución de tripsina (Tabla de materiales) por placa de cultivo de tejido de 10 cm de diámetro e incube durante 2-3 minutos en una incubadora de cultivo de tejidos hasta que las células se desprendan. Inactivar la tripsina añadiendo 5 ml del medio completo.</li>
	<li>Contar las células utilizando un hemocitómetro y una placa de 20.000 células en 2 ml del medio completo en un plato con fondo de vidrio recubierto como se indica arriba (sección 2). NOTA: El número de celdas para el revestimiento depende del tamaño y el tipo de celdas. Para células más grandes o más diseminadas, placa solo 10,000 células para tener suficientes células para la obtención de imágenes. Es importante elegir células individuales que no se toquen, ya que el contacto de célula a célula puede alterar los comportamientos de propagación intrínsecos de la célula.</li>
	<li>Incubar los platos con fondo de vidrio con células chapadas en la incubadora de cultivo de tejidos durante 15 min. NOTA: Durante esta etapa, las células se adhieren al sustrato de fibronectina y se extienden sobre él. Al medir las protuberancias durante la propagación celular, se debe permitir que las células se propaguen durante 15 minutos después del recubrimiento y antes de la toma de imágenes. Las imágenes se pueden realizar dentro de una ventana de tiempo entre 15 minutos y ~ 1 h después del recubrimiento y, en cualquier caso, antes de que las celdas comiencen a migrar.</li>
</ol>4. Configuración del microscopio e imágenes
NOTA: Varios sistemas de microscopía de células vivas están disponibles. El sistema utilizado aquí es un microscopio invertido Leica AF6000 equipado con unidades de CO2 y calefacción y está conectado a una cámara CMOS digital ORCA-Flash 4.0 V2.
<ol><li>Encienda la unidad de calefacción al menos 1 h antes de obtener la imagen y configúrela a 37 °C.</li>
	<li>Encienda la unidad de CO2 al menos 10 minutos antes de la toma de imágenes y configúrela al 5% de CO2.</li>
	<li>Encienda el microscopio, la cámara y la computadora.</li>
	<li>Abra el software de adquisición del microscopio (consulte la Tabla de materiales). Elija la carpeta para guardar las imágenes capturadas y escriba un nombre de archivo. Guarde cada película como un nuevo archivo.</li>
	<li>Ajuste el aumento en una lente seca de 40x, contraste de fase. Establezca el intervalo de tiempo en 5 s, la duración total de la película 10 min.</li>
	<li>Después de 15 minutos de incubación de las células chapadas, coloque el plato con fondo de vidrio con células adheridas en el adaptador y fíjelo. Inserte el adaptador con el plato en su ranura en la etapa del microscopio.</li>
	<li>Retire la tapa del plato y coloque la tapa de CO2 en su lugar. Abra la válvula de CO2 . NOTA: Asegúrese de que la cubierta de CO2 esté limpia antes de colocarla encima del plato con fondo de vidrio. Una cubierta sucia reducirá la calidad de las películas. Limpie la parte inferior de la tapa de CO2 con una toallita sin pelusa empapada con etanol al 70% para eliminar el polvo y la suciedad. Limpie una segunda vez con una toallita seca sin pelusa.</li>
	<li>Vea las células y encuentre una célula adecuada para la obtención de imágenes. Asegúrese de que la celda esté enfocada y comience la adquisición de películas.</li>
</ol>5. Análisis de imágenes
NOTA: El análisis de imágenes se realiza utilizando ImageJ (Tabla de materiales) de la siguiente manera:
<ol><li>Abra la película adquirida en ImageJ.</li>
	<li>Usando la herramienta Recto en la barra de herramientas principal, haga ocho líneas de 20 unidades arbitrarias cada una perpendicular a las protuberancias, incluyendo la lámina y el borde de la celda, en una disposición radial cada 45°, como se muestra en la Figura 2A.</li>
	<li>En la barra de herramientas principal, vaya a > pilas > Reslice. Esto producirá una imagen de kymograph, que describe el movimiento de puntos individuales dentro de la membrana celular (Figura 2B). Esta acción debe realizarse para cada línea de las ocho líneas por separado.</li>
	<li>Extraiga y cuente manualmente de las respectivas imágenes del kymograph el número de protuberancias, retracciones y volantes en cada una de las ocho regiones de la celda, marcadas por las líneas de la cuadrícula. Estos números representan la frecuencia de protuberancias, retracciones y volantes por 10 min (Figura 2C, D). NOTA: Los volantes se pueden distinguir de otras estructuras en función de su apariencia oscura en microscopía de contraste de fase y su movimiento centrípeto, que comienza en el borde celular y termina en el borde del cuerpo celular, que se puede observar en las películas adquiridas. Cabe destacar que, al cuantificar la protuberancia, la retracción y la frecuencia de los volantes, las películas deben observarse como un control para la cuantificación y especialmente para definir los volantes.</li>
	<li>Determinar la persistencia de la protuberancia, la distancia y la velocidad mediante análisis de quimografía. Para cada uno de los kymographs generados, el eje X representa la distancia y el eje Y representa el tiempo.</li>
	<li>Para medir la distancia de protuberancia, siga los pasos 5.6.1-5.6.2.<ol>
<li>Dibuja una línea perpendicular desde la base de la protuberancia hasta el pico más alto de la protuberancia. Presione M en ImageJ para medir la longitud de la línea en píxeles.</li>
		<li>Para convertir la longitud de píxeles a μm, asegúrese de que se conoce la relación píxel-μm. NOTA: La relación μm a píxel es la longitud física de un píxel en la cámara CCD / aumento total. El tamaño de píxel es característico de cada tipo de cámara. Por ejemplo, para la cámara utilizada en este estudio, el tamaño de píxel es de 6,5 μm x 6,5 μm, la longitud física es de 6,5 μm y el aumento que utilizamos es de 40x. Por lo tanto, la relación μm a píxel de nuestra cámara es de 0,1625 μm/píxel. En el análisis, para una línea en la longitud de 30 píxeles, la distancia de protuberancia sería de 30 píxeles x 0,1625 μm/píxel = 4,875 μm (Figura 3).</li>
	</ol></li>
	<li>Para medir el tiempo de protuberancia (persistencia; la cantidad de tiempo que una protuberancia pasa sobresaliendo antes de retraerse), siga los pasos 5.7.1-5.7.2.<ol>
<li>Dibuje una línea horizontal desde el comienzo de la protuberancia (de izquierda a derecha) hasta la región del pico más alto. Presione M en ImageJ para medir la longitud de la línea en píxeles.</li>
		<li>Para convertir la longitud de píxeles a minutos, calcule la relación píxel-minuto. Este valor depende del intervalo entre imágenes. NOTA: En este ejemplo, el intervalo entre imágenes es de 5 s, la relación mínimo/píxel es de 0,0833 y la longitud de línea horizontal es de 8 píxeles. Por lo tanto, el tiempo de protuberancia es de 8 píxeles x 0,0833 min/píxel = 0,6664 min.</li>
	</ol></li>
	<li>Mida y calcule el tiempo de retracción de manera similar al tiempo de protuberancia para una línea trazada horizontalmente en la base de la protuberancia desde donde el pico de la protuberancia está a su base a la derecha (línea X2 en la Figura 3).</li>
	<li>Calcule la velocidad de protuberancia dividiendo la distancia de protrusión por el tiempo de protuberancia. Calcule la velocidad de retracción dividiendo la distancia de protrusión por el tiempo de retracción. En este ejemplo, la velocidad de protrusión se calcula como 4,875 μm/0,6664 min = 7,315 μm/min., y la velocidad de retracción es idéntica porque la línea que representa el tiempo tiene la misma longitud. NOTA: Al comparar diferentes tipos de células, es decir, células que expresan construcciones de tipo salvaje y mutantes de la misma proteína, es imperativo realizar un análisis ciego, para que no se introduzca ningún sesgo.</li>
</ol>

<ol><li>Kurosaka, S., Kashina, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+biology+of+embryonic+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Research+Part+C+-+Embryo+Today%3A+Reviews%22%5BJournal%5D)">Cell biology of embryonic migration.</a> Birth Defects Research Part C - Embryo Today: Reviews. 84 (2), 102-122 (2008).</li>
<li>Pollard, T. D., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+motility+driven+by+assembly+and+disassembly+of+actin+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments.</a> Cell. 112 (4), 453-465 (2003).</li>
<li>Ponti, A., Machacek, M., Gupton, S. L., Waterman-Storer, C. M., Danuser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+distinct+actin+networks+drive+the+protrusion+of+migrating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two distinct actin networks drive the protrusion of migrating cells.</a> Science. 305 (5691), 1782-1786 (2004).</li>
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<li>Chesarone, M. A., Goode, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+nucleation+and+elongation+factors%3A+mechanisms+and+interplay%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Actin nucleation and elongation factors: mechanisms and interplay.</a> Current Opinion in Cell Biology. 21 (1), 28-37 (2009).</li>
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<li>Giannone, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lamellipodial+actin+mechanically+links+myosin+activity+with+adhesion-site+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Lamellipodial actin mechanically links myosin activity with adhesion-site formation.</a> Cell. 128 (3), 561-575 (2007).</li>
<li>Tojkander, S., Gateva, G., Lappalainen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+stress+fibers--assembly%2C+dynamics+and+biological+roles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Actin stress fibers--assembly, dynamics and biological roles.</a> Journal of Cell Science. 125, Pt 8 1855-1864 (2012).</li>
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<li>Chhabra, E. S., Higgs, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+many+faces+of+actin%3A+matching+assembly+factors+with+cellular+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The many faces of actin: matching assembly factors with cellular structures.</a> Nature Cell Biology. 9 (10), 1110-1121 (2007).</li>
<li>Hinz, B., Alt, W., Johnen, C., Herzog, V., Kaiser, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+lamella+dynamics+of+cultured+cells+by+SACED%2C+a+new+computer-assisted+motion+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Quantifying lamella dynamics of cultured cells by SACED, a new computer-assisted motion analysis.</a> Experimental Cell Research. 251 (1), 234-243 (1999).</li>
<li>Bear, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonism+between+Ena%2FVASP+proteins+and+actin+filament+capping+regulates+fibroblast+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Antagonism between Ena/VASP proteins and actin filament capping regulates fibroblast motility.</a> Cell. 109 (4), 509-521 (2002).</li>
<li>Jacks laboratory protocol. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://jacks-lab.mit.edu/protocols/making_mefs">http://jacks-lab.mit.edu/protocols/making_mefs</a> (2021).</li>
<li>Doggett, T. M., Breslin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+the+actin+cytoskeleton+in+live+endothelial+cells+expressing+GFP-actin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Study of the actin cytoskeleton in live endothelial cells expressing GFP-actin.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (57), e3187(2011).</li>
<li>Miller, A. L., Wang, Y., Mooseker, M. S., Koleske, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Abl-related+gene+%28Arg%29+requires+its+F-actin-microtubule+cross-linking+activity+to+regulate+lamellipodial+dynamics+during+fibroblast+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The Abl-related gene (Arg) requires its F-actin-microtubule cross-linking activity to regulate lamellipodial dynamics during fibroblast adhesion.</a> Journal of Cell Biology. 165 (3), 407-419 (2004).</li>
<li>Bryce, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortactin+promotes+cell+motility+by+enhancing+lamellipodial+persistence%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Cortactin promotes cell motility by enhancing lamellipodial persistence.</a> Current Biology. 15 (14), 1276-1285 (2005).</li>
<li>Lapetina, S., Mader, C. C., Machida, K., Mayer, B. J., Koleske, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arg+interacts+with+cortactin+to+promote+adhesion-dependent+cell+edge+protrusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Arg interacts with cortactin to promote adhesion-dependent cell edge protrusion.</a> Journal of Cell Biology. 185 (3), 503-519 (2009).</li>
<li>Miller, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+actin+polymerization+and+adhesion-dependent+cell+edge+protrusion+by+the+Abl-related+gene+%28Arg%29+tyrosine+kinase+and+N-WASp%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Regulation of actin polymerization and adhesion-dependent cell edge protrusion by the Abl-related gene (Arg) tyrosine kinase and N-WASp.</a> Biochemistry. 49 (10), 2227-2234 (2010).</li>
<li>Lukic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyk2+regulates+cell-edge+protrusion+dynamics+by+interacting+with+Crk%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Pyk2 regulates cell-edge protrusion dynamics by interacting with Crk.</a> Molecular Biology of the Cell. , (2021).</li>
</ol>

Los autores no tienen ningún conflicto de intereses que revelar.

La dinámica de protrusión del borde celular, compuesta de protuberancias, retracciones y volantes, es tanto un requisito previo como un evento potencial limitante de la velocidad en la motilidad celular. Aquí describimos un método rápido y simple para medir la dinámica de las protuberancias del borde celular durante la propagación. Este método permite obtener imágenes a corto plazo, genera una cantidad significativa de datos, no requiere el etiquetado fluorescente de las células o el costoso equipo de microscopía fluores...

La migración celular es un proceso crítico que controla el desarrollo y la función de todos los organismos vivos. La migración celular ocurre tanto en condiciones fisiológicas, como la embriogénesis, la cicatrización de heridas y la respuesta inmune, como en condiciones patológicas, como metástasis de cáncer y enfermedades autoinmunes. A pesar de las diferencias en los tipos de células que participan en diferentes eventos migratorios, todos los eventos de motilidad celular comparten mecanismos moleculares similares, que se han conservado en la evolución de los protozoos a los mamíferos, e involucran mecanismos comunes de control citoesquelético que pueden detectar el entorno, responder a las señales y modular el comportamiento celular en la respuesta1.
Una etapa inicial en la migración celular puede ser la formación de protuberancias altamente dinámicas en el borde delantero de la célula. Detrás del lamellipodium se puede encontrar la lámina, que acopla la actina a la contractilidad mediada por la miosina II y media la adhesión al sustrato subyacente. Los lamellipodia son inducidos por estímulos extracelulares como factores de crecimiento, citoquinas y receptores de adhesión celular y son impulsados por la polimerización de actina, que proporciona la fuerza física que empuja la membrana plasmática hacia adelante2,3. Muchas proteínas estructurales y de señalización han sido implicadas en esto; entre ellas se encuentran las Rho GTPasas, que actúan coordinadamente con otras señales para activar proteínas reguladoras de actina como el complejo Arp 2/3, las proteínas de la familia WASP y miembros de las familias Formin y Spire en lamellipodia2,4,5.
Además de la polimerización de actina, se requiere actividad de miosina II para generar fuerzas contráctiles en el lamelepodeio y la lámina anterior. Estas contracciones, también definidas como retracciones del borde celular, también pueden resultar de la despolimerización de la actina dendrítica en la periferia celular y son críticas para desarrollar el borde de ataque lamellipodial y permitir que la protuberancia detecte la flexibilidad de la matriz extracelular y otras células y determine la dirección de la migración6,7,8 . Las protuberancias del borde celular que no pueden unirse al sustrato formarán volantes de membrana periférica, estructuras en forma de lámina que aparecen en la superficie ventral de los lamellipodia y las láminas y se mueven hacia atrás en relación con la dirección de la migración. A medida que el lamellipodium no se adhiere al sustrato, se forma un lamellipodium posterior debajo de él y empuja mecánicamente el primer lamellipodium hacia la superficie ventral superior. Los filamentos de actina en el volante que antes eran paralelos al sustrato ahora se vuelven perpendiculares a él, y el volante ahora se coloca sobre el lamellipodium que avanza. El volante que se mueve hacia atrás cae de nuevo en el citosol y representa un mecanismo celular para reciclar la actina lamellipodial9,10.
Aquí, describimos un ensayo para la medición de la dinámica de protrusión del borde celular. El ensayo de protrusión utiliza microscopía de video de lapso de tiempo para medir la dinámica de protrusión de borde celular único durante 10 minutos durante la fase de propagación de la célula. La dinámica de protrusión se analiza generando kymographs a partir de estas películas. En principio, un kymograph imparte datos cuantitativos detallados de partículas en movimiento en una gráfica espaciotemporal para obtener una comprensión cualitativa de la dinámica del borde celular. La intensidad de la partícula en movimiento se traza para todas las pilas de imágenes en una gráfica de tiempo versus espacio, donde el eje X y el eje Y representan el tiempo y la distancia, respectivamente11. Este método utiliza un análisis manual de kymograph con ImageJ para obtener datos cuantitativos detallados, lo que permite recuperar información de películas e imágenes en caso de baja relación señal-ruido y / o alta densidad de características, y el análisis de imágenes adquiridas en microscopía de luz de contraste de fase o mala calidad de imagen.
El ensayo de dinámica de protrusión de borde celular descrito aquí es un método rápido, simple y rentable. Como tal, y debido a que se ha demostrado que se correlaciona directamente con la migración celular11,12, se puede utilizar como un método preliminar para probar la dinámica citoesquelética involucrada en la motilidad celular antes de decidir realizar métodos más exigentes en recursos. Además, también permite la medición cuantitativa de cómo las manipulaciones genéticas (knockout, knockdown o construcciones de rescate) de proteínas citoesqueléticas afectan la dinámica citoesquelética utilizando una plataforma sencilla. El ensayo es un modelo instructivo para explorar la dinámica citoesquelética en el contexto de la migración celular y podría usarse para dilucidar los mecanismos y moléculas subyacentes a la motilidad celular.

<table><tbody><tr><td>Placas de cultivo celular de 10 cm</td><td>Greiner</td><td>P7612-360EA</td> Albúmina sérica bovina <td></td></tr><tr><td>(BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s medio Eagle modificado (DMEM)</td><td>Biological Industries, Israel</td><td>01-055-1A</td><td>El medio contiene alta glucosa (4,5 g/L D-glucosa)</td></tr><tr><td>Dulbecco' Solución salina tamponada con fosfato (1xDPBS)</td><td>Biological Industries, Israel</td><td>02-023-1A</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Biological Industries, Israel</td><td>04-001-1A</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina de plasma humano, líquido, 0,1%, apto para cultivo celular</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0895</td><td></td></tr><tr><td>Platos con fondo de vidrio</td><td>Cellvis</td><td>D35-20-1.5-N</td><td>Plato con fondo de vidrio de 35 mm, tamaño del plato 35 mm, tamaño de pozo 20 mm, cubreobjetos # 1.5 (0.16-0.19 mm).</td></tr><tr><td>Software ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>Feely disponible en:</td></tr><tr><td>https://imagej.nih.gov/ij/download.html LAS-AF Leica Application Suite 3.2</td><td></td><td></td><td>Software de adquisición de microscopio equipado con un CMOS digital ORCA-Flash 4.0 V2</td></tr><tr><td>Leica AF6000</td> Microscopio de campo claro <td>invertido Leica</td><td></td> (<td>40x, NA 1.3 ) equipado con óptica de contraste de fase, una incubadora y una unidad de CO2 con software de adquisición LAS AF equipado con un Cámara digital CMOS ORCA-Flash 4.0 V2.</td></tr><tr><td>Solución de L-glutamina</td><td>Biological Industries, Israel</td><td>03-020-1B</td><td></td></tr><tr><td>Cámara CMOS digital ORCA-Flash 4.0 V2</td><td>Hamamatsu Photonics</td> Solución de <td></td><td></td></tr><tr><td>penicilina-estreptomicina</td><td>Biological Industries, Israel</td><td>03-031-1B</td><td></td></tr><tr><td>Solución de tripsina-EDTA B (0,25%), EDTA (0,05%)</td><td>Biological Industries, Israel</td><td>03-052-1A</td><td></td></tr></tbody></table>

medición de la dinámica de protrusión del borde celular durante la propagación mediante microscopía de células vivas

Measuring Cell-Edge Protrusion Dynamics during Spreading using Live-Cell Microscopy

El desarrollo y la homeostasis de los organismos multicelulares se basan en la regulación coordinada de la migración celular. La migración celular es un evento esencial en la construcción y regeneración de tejidos, y es fundamental en el desarrollo embrionario, las respuestas inmunológicas y la cicatrización de heridas. La desregulación de la motilidad celular contribuye a los trastornos patológicos, como la inflamación crónica y la metástasis del cáncer. La migración celular, la invasión tisular, el axón y el crecimiento de la dendrita se inician con protuberancias de borde celular mediadas por polimerización de actina. Aquí, describimos un método simple, eficiente y que ahorra tiempo para la obtención de imágenes y el análisis cuantitativo de la dinámica de protrusión del borde celular durante la propagación. Este método mide las características discretas de la dinámica de la membrana del borde celular, como protuberancias, retracciones y volantes, y se puede utilizar para evaluar cómo las manipulaciones de los reguladores clave de actina afectan las protuberancias del borde celular en diversos contextos.

En el experimento descrito en la Figura 2, los MEF inmortalizados se enchaparon en platos con fondo de vidrio precubiertos con fibronectina para activar la señalización mediada por integrina, bloqueada por BSA desnaturalizada, para bloquear sitios potenciales libres para la adhesión celular que no depende de la activación de integrina. Para alcanzar la fase de crecimiento logarítmico al 70%-80% de confluencia de células el día del experimento, se colocaron 0,7 x 106 MEF en una pla...

Este protocolo tiene como objetivo medir los parámetros dinámicos (protuberancias, retracciones, volantes) de las protuberancias en el borde de las células que se propagan.

Medición de la dinámica de protrusión del borde celular durante la propagación mediante microscopía de células vivas

The development and homeostasis of multicellular organisms rely on coordinated regulation of cell migration. Cell migration is an essential event in the ...

Se ha demostrado que el ensayo de protrusión del borde celular se correlaciona directamente con la migración celular. Por lo tanto, se puede utilizar como un método preliminar para identificar proteínas críticas y mecanismos de señalización involucrados en la motilidad celular. El método es rápido, simple, rentable y no requiere etiquetado fluorescente ni el uso de un costoso microscopio fluorescente.Demostrando el procedimiento estará Michal Gendler, un estudiante de mi laboratorio. Agregue dos mililitros de una solución normal de ácido clorhídrico en el centro de un plato con fondo de vidrio e incube durante 20 minutos a temperatura ambiente. Lave el plato tres veces con dos mililitros de PBS.Diluya la fibronectina a 10 microgramos por mililitro de concentración en PBS y agregue 200 microlitros de la solución diluida al plato central de vidrio. Incubar durante una hora a 37 grados centígrados. Prepare la solución 1% BSA y PBS y páselo a través de un filtro de 0,2 micrómetros.Desnaturalizar la solución incubando a 70 grados centígrados durante 30 minutos en un baño de agua precalentada. Lave el plato con fondo de vidrio recubierto con dos mililitros de PBS tres veces. Agregue dos mililitros de solución de BSA desnaturalizada e incube el plato a 37 grados centígrados durante una hora.Lave el plato de vidrio con dos mililitros de PBS tres veces. Antes de 16 a 18 horas de experimento a 0,7 millones de células por placa de cultivo de tejido de 10 centímetros de diámetro para lograr una confluencia del 70 al 80%. Al día siguiente, agregue dos mililitros de solución de tripsina a la placa de cultivo de tejido e incube durante dos o tres minutos hasta que las células se separen.Agregue cinco mililitros del medio para inactivar la tripsina. Usando un hemaciómetro, cuente las celdas y la placa 20, 000 celdas en dos mililitros del medio completo en un plato inferior. Luego incube el plato con células chapadas en una incubadora durante 15 minutos.Encienda la unidad de calefacción y configúrela a 37 grados centígrados una hora antes de la toma de imágenes. Además, encienda la unidad de dióxido de carbono y configúrela al 5% 10 minutos antes de la toma de imágenes. Encienda el microscopio y la cámara.Encienda la computadora y abra el software de adquisición del microscopio. Ajuste el aumento en un contraste de fase de lente seca de 40X. Establezca la duración total de la película en 10 minutos con un intervalo de tiempo de cinco segundos.Después de 15 minutos de incubación, coloque el plato con fondo de vidrio con células adheridas en un adaptador y fíjelo. Inserte el adaptador con el plato en las ranuras de la etapa del microscopio. Retire la tapa del plato, coloque la tapa de dióxido de carbono y abra la válvula de dióxido de carbono.Localice una célula apropiada para la obtención de imágenes. Comience la adquisición de películas después de centrarse en la célula. Para realizar el análisis de imagen, seleccione la herramienta recta en el software de análisis de imágenes y haga ocho líneas de 20 unidades arbitrarias perpendiculares a las protuberancias en una disposición radial a cada 45 grados, incluyendo láminas y bordes celulares.En la barra de herramientas principal, vaya a la imagen, seleccione Pilas y luego haga clic en Reslice para generar una imagen de kymograph que describa el movimiento de puntos individuales dentro de la membrana celular. Utilizando las imágenes del kymograph, extraiga y cuente manualmente el número de protuberancias, retracciones y volantes en cada una de las ocho regiones de la celda marcada por las líneas de la cuadrícula. Estos números representan la frecuencia de protuberancias, retracciones y volantes por 10 minutos.Determinar la persistencia de la protuberancia, la distancia y la velocidad mediante análisis de quimografía. Para determinar la distancia de protuberancia, dibuje una línea perpendicular desde la base de la protuberancia hasta el pico más alto de la protuberancia. Presione M para medir la longitud de la línea en píxeles y asegúrese de que se sepa que la relación píxel-micrómetro convierte la longitud en micrómetros.La cuantificación de protuberancias, reacciones y volantes se realizó manualmente por 10 minutos y la frecuencia promedio obtenida para protuberancias y retracciones fue de 5,1 y 2,1 para volantes. El kymograph representativo tenía una distancia de protuberancia de aproximadamente 4,8 micrómetros y un tiempo de protuberancia de aproximadamente 0,6 minutos. Se representa un ejemplo de una celda que debe excluirse del análisis.El análisis de la gammagrafía reveló que la célula no estaba presente en su fase de propagación y no mostró ninguna protuberancia clara de la membrana. Lo más importante es elegir las células correctas para la obtención de imágenes. Una célula adecuada debe estar en su fase de propagación y no debe tocar otras células para evitar la comunicación y señalización célula-célula.El método se puede utilizar como una herramienta preliminar para probar la dinámica citoesquelética que involucra la motilidad celular antes de decidir realizar más resultados que exijan ensayos de migración celular.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Imágenes microscópicas de vida las células endoteliales que expresan GFP-actina permite la caracterización de los cambios dinámicos en las estructuras del citoesqueleto. A diferencia de las técnicas que utilizan las muestras fijadas, este método proporciona una evaluación detallada de los cambios temporales en el citoesqueleto de actina en las células del mismo, antes, durante y después de diversos estímulos físicos, farmacológicos o inflamatorios.

Estudio del citoesqueleto de actina en vivo las células endoteliales que expresan GFP-actina

Se desarrolló un novedoso protocolo de imagen utilizando un actuador mecánico accionado por motor personalizado para permitir la medición de las respuestas en tiempo real a la tensión mecánica en células vivas. Relevante para la mecanobiología, el sistema puede aplicar deformaciones de hasta el 20% al tiempo que permite obtener imágenes casi en tiempo real con microscopía confocal o de fuerza atómica.

Imágenes de células vivas durante el estiramiento mecánico

Presentamos una solución de software para el seguimiento semi-automatizado de la concentración relativa de proteínas a lo largo de la longitud de protrusiones celulares dinámicas.

Una interfaz gráfica de usuario para el seguimiento asistido por software de la concentración de proteínas en protones dinámicos celulares

Aquí detallamos las técnicas experimentales usadas para evaluar las fuerzas de la saliente que podosomes aplicar sobre una película compatible con, desde la preparación de la película para el análisis automatizado de imágenes topográficas.

Microscopia de la fuerza de protrusión: Un método para cuantificar las fuerzas desarrolladas por salientes de celular

Describimos cómo técnicas de micro - y Fotomanipulación como FRAP y fotoactivación permiten la determinación de los parámetros de motilidad y la dinámica espacio-temporal de las proteínas a migración de las células. Lecturas experimentales incluyen la dinámica subcelular y facturación de los reguladores de la motilidad o subyacente del citoesqueleto de actina.

Técnicas de micromanipulación que permite el análisis de las dinámicas morfogenéticas y facturación de los reguladores citoesqueléticos

Utilizando un dispositivo previamente diseñado para aplicar la cepa mecánica a las células adherentes, este papel describe una geometría de sustrato rediseñado y un aparato personalizado para la imagen de célula única de alta resolución de células tensas con un objetivo de inmersión de aceite 100x.

Imágenes de alta resolución de la dinámica nuclear en células vivas bajo tensión de tracción uniaxial

Este método es útil para cuantificar la dinámica temprana de la adhesión celular y la propagación de células dependientes del anclaje en la fibronectina. Además, este ensayo se puede utilizar para investigar los efectos de la homeostasis redox alterada en la propagación celular y/ o vías de señalización intracelular relacionadas con la adhesión celular.

Examen de la dinámica de la adhesión celular y la propagación de células epiteliales en la fibronectina durante el estrés oxidativo

Las imágenes en vivo de la exocitosis lisosomal en células micropatrnadas permiten una cuantificación espacial de este proceso. La normalización de la morfología utilizando micropatrón es una herramienta excepcional para descubrir reglas generales sobre la distribución espacial de los procesos celulares.

Cuantificación de parámetros espaciotemporales de la exocitostosis celular en células micropatr babeadas

En este protocolo, presentamos los procedimientos experimentales de un ensayo de propagación celular que se basa en microscopía de células vivas. Proporcionamos una herramienta computacional de código abierto para la segmentación imparcial de células etiquetadas fluorescentemente y análisis cuantitativos de dinámicas de lamellipodia durante la propagación celular.

Análisis cuantitativo de la dinámica del borde celular durante la propagación celular

Este documento presenta un protocolo detallado sobre cómo utilizar un sistema integrado multifuncional y programable por el usuario que permite la obtención automática de imágenes multicanal y el análisis mecanobiológico para dilucidar la mecanosensibilidad de la proteína asociada al Sí (YAP).

Interrogatorio de mecanobiología totalmente óptica de proteína asociada a sí en cáncer humano y células normales utilizando un sistema multifuncional

Aquí, presentamos un dispositivo de estiramiento equibiaxial versátil que se acciona neumáticamente y es compatible con la microscopía de alta resolución.

Dispositivo de estiramiento equibiaxial para microscopía de fluorescencia confocal de células vivas de gran aumento

Aprende a medir la dinámica de protrusiones del borde celular durante la propagación mediante microscopía de células vivas. Este ensayo accesible evalúa la motilidad celular sin necesidad de marcaje fluorescente.

Medición de la dinámica de protrusión del borde celular durante la propagación mediante microscopía de células vivas

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