Medición de la dinámica de protrusión del borde celular durante la propagación mediante microscopía de células vivas
November 1st, 2021
Este protocolo tiene como objetivo medir los parámetros dinámicos (protuberancias, retracciones, volantes) de las protuberancias en el borde de las células que se propagan.
Se ha demostrado que el ensayo de protrusión del borde celular se correlaciona directamente con la migración celular. Por lo tanto, se puede utilizar como un método preliminar para identificar proteínas críticas y mecanismos de señalización involucrados en la motilidad celular. El método es rápido, simple, rentable y no requiere etiquetado fluorescente ni el uso de un costoso microscopio fluorescente.
Demostrando el procedimiento estará Michal Gendler, un estudiante de mi laboratorio. Agregue dos mililitros de una solución normal de ácido clorhídrico en el centro de un plato con fondo de vidrio e incube durante 20 minutos a temperatura ambiente. Lave el plato tres veces con dos mililitros de PBS.
Diluya la fibronectina a 10 microgramos por mililitro de concentración en PBS y agregue 200 microlitros de la solución diluida al plato central de vidrio. Incubar durante una hora a 37 grados centígrados. Prepare la solución 1% BSA y PBS y páselo a través de un filtro de 0,2 micrómetros.
Desnaturalizar la solución incubando a 70 grados centígrados durante 30 minutos en un baño de agua precalentada. Lave el plato con fondo de vidrio recubierto con dos mililitros de PBS tres veces. Agregue dos mililitros de solución de BSA desnaturalizada e incube el plato a 37 grados centígrados durante una hora.
Lave el plato de vidrio con dos mililitros de PBS tres veces. Antes de 16 a 18 horas de experimento a 0,7 millones de células por placa de cultivo de tejido de 10 centímetros de diámetro para lograr una confluencia del 70 al 80%. Al día siguiente, agregue dos mililitros de solución de tripsina a la placa de cultivo de tejido e incube durante dos o tres minutos hasta que las células se separen.
Agregue cinco mililitros del medio para inactivar la tripsina. Usando un hemaciómetro, cuente las celdas y la placa 20, 000 celdas en dos mililitros del medio completo en un plato inferior. Luego incube el plato con células chapadas en una incubadora durante 15 minutos.
Encienda la unidad de calefacción y configúrela a 37 grados centígrados una hora antes de la toma de imágenes. Además, encienda la unidad de dióxido de carbono y configúrela al 5% 10 minutos antes de la toma de imágenes. Encienda el microscopio y la cámara.
Encienda la computadora y abra el software de adquisición del microscopio. Ajuste el aumento en un contraste de fase de lente seca de 40X. Establezca la duración total de la película en 10 minutos con un intervalo de tiempo de cinco segundos.
Después de 15 minutos de incubación, coloque el plato con fondo de vidrio con células adheridas en un adaptador y fíjelo. Inserte el adaptador con el plato en las ranuras de la etapa del microscopio. Retire la tapa del plato, coloque la tapa de dióxido de carbono y abra la válvula de dióxido de carbono.
Localice una célula apropiada para la obtención de imágenes. Comience la adquisición de películas después de centrarse en la célula. Para realizar el análisis de imagen, seleccione la herramienta recta en el software de análisis de imágenes y haga ocho líneas de 20 unidades arbitrarias perpendiculares a las protuberancias en una disposición radial a cada 45 grados, incluyendo láminas y bordes celulares.
En la barra de herramientas principal, vaya a la imagen, seleccione Pilas y luego haga clic en Reslice para generar una imagen de kymograph que describa el movimiento de puntos individuales dentro de la membrana celular. Utilizando las imágenes del kymograph, extraiga y cuente manualmente el número de protuberancias, retracciones y volantes en cada una de las ocho regiones de la celda marcada por las líneas de la cuadrícula. Estos números representan la frecuencia de protuberancias, retracciones y volantes por 10 minutos.
Determinar la persistencia de la protuberancia, la distancia y la velocidad mediante análisis de quimografía. Para determinar la distancia de protuberancia, dibuje una línea perpendicular desde la base de la protuberancia hasta el pico más alto de la protuberancia. Presione M para medir la longitud de la línea en píxeles y asegúrese de que se sepa que la relación píxel-micrómetro convierte la longitud en micrómetros.
La cuantificación de protuberancias, reacciones y volantes se realizó manualmente por 10 minutos y la frecuencia promedio obtenida para protuberancias y retracciones fue de 5,1 y 2,1 para volantes. El kymograph representativo tenía una distancia de protuberancia de aproximadamente 4,8 micrómetros y un tiempo de protuberancia de aproximadamente 0,6 minutos. Se representa un ejemplo de una celda que debe excluirse del análisis.
El análisis de la gammagrafía reveló que la célula no estaba presente en su fase de propagación y no mostró ninguna protuberancia clara de la membrana. Lo más importante es elegir las células correctas para la obtención de imágenes. Una célula adecuada debe estar en su fase de propagación y no debe tocar otras células para evitar la comunicación y señalización célula-célula.
El método se puede utilizar como una herramienta preliminar para probar la dinámica citoesquelética que involucra la motilidad celular antes de decidir realizar más resultados que exijan ensayos de migración celular.
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Visión general
Este estudio presenta un ensayo de protrusión de borde celular para investigar los parámetros dinámicos de las células en expansión, incluyendo protrusión, retracción y arrugas. Este método es particularmente significativo ya que se correlaciona con la migración celular, ayudando en la identificación de proteínas críticas y mecanismos de señalización involucrados en la motilidad celular.
Componentes clave del estudio
Área de investigación
- Migración celular
- Motilidad celular
- Dinámica del citoesqueleto
Fundamentos
- Existe una correlación entre las protrusiónes del borde celular y la migración celular.
- El ensayo es sencillo, rentable y no necesita marcado fluorescente.
- Entender las protrusiónes puede proporcionar información sobre el comportamiento celular y los mecanismos que impulsan la motilidad.
Métodos utilizados
- Ensayo de protrusión de borde celular
- Células adheridas en una placa de fondo de vidrio
- Análisis de kinografía para evaluar las protrusiónes
Resultados principales
- La frecuencia promedio de protrusiónes fue de 5.1 por 10 minutos, con arrugas en 2.1.
- El análisis de kinografía reveló una distancia de protrusión de aproximadamente 4.8 micrometros.
- Identificó la importancia de elegir células apropiadas en la fase de expansión para obtener resultados precisos.
Conclusiones
- El estudio introduce un ensayo accesible para evaluar la dinámica de motilidad celular.
- Este método sirve como herramienta de evaluación preliminar antes de emprender ensayos de migración más complejos.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Cell-edge protrusion dynamics serve as an early, predictive readout of cell motility, enabling rapid assessment of cytoskeletal regulators before committing to resource-intensive migration assays. This method supports target validation by linking molecular perturbations to functional membrane dynamics, providing mechanistic de-risking in discovery workflows. Its label-free, cost-effective design facilitates high-throughput screening of signaling pathways relevant to wound healing, immune response, and cancer metastasis.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Measures protrusion frequency, persistence, distance, and velocity to interrogate therapeutic hypotheses on actin regulators and motility pathways.
- Operational Value: Enables rapid, label-free screening of protein knockdowns or inhibitors affecting cytoskeletal dynamics.
- Predictive Value: Correlates protrusion dynamics with cell migration, supporting go/no-go decisions based on early phenotypic readouts.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative kymograph-derived metrics (protrusion count, distance, velocity) for standardized comparison across experimental conditions.
- Operational Value: Uses phase-contrast microscopy and accessible image analysis tools, reducing dependency on specialized equipment or fluorescent probes.
- Scalability: Supports multi-condition testing via radial sampling of eight membrane regions per cell, enhancing data robustness.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges molecular target modulation to functional cellular behavior in disease-relevant systems like fibroblasts or immune cells.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed phenotypic effects stem from altered protrusion dynamics rather than secondary cytotoxicity or adhesion defects.
- Biomarker Alignment: Protrusion parameters can serve as translational biomarkers when linked to in vivo motility or invasion phenotypes.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from target engagement to phenotypic validation, acting as a bridge between biochemical screening and functional cell-based assays.
- Discovery Biology: Tests how genetic or pharmacological manipulations of actin regulators (e.g., Arp2/3, cofilin, Rho GTPases) impact protrusion dynamics as a proxy for motility.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs (e.g., protrusions per 10 minutes, protrusion velocity) that enable comparison across compound libraries or genetic screens.
- Analytics: Kymography provides temporal and spatial resolution of membrane dynamics, allowing extraction of kinetic parameters critical for mechanistic modeling.
- Translational Research: Supports continuity to preclinical models by validating that target hits produce consistent protrusion phenotypes in primary or disease-relevant cell lines.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, low-cost platform for repeated use across projects investigating cell motility in development, inflammation, or oncology.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by directly linking molecular perturbations to quantifiable membrane dynamics.
- Operational Value: Eliminates need for fluorescent labeling and expensive imaging hardware, lowering assay barrier and increasing accessibility.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by filtering targets early using a predictive, phenotypic anchor to cell migration.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on concordance between protrusion dynamics and migratory potential.
Implementation Considerations
- Requires expertise in live-cell imaging, kymograph generation, and manual or semi-automated protrusion analysis.
- Depends on phase-contrast microscopy and image analysis software capable of reslice and kymograph generation.
- Necessitates standardization of cell seeding density, substrate coating (fibronectin/BSA), and environmental controls (37°C, 5% CO2) for reproducibility.
- Requires training to identify appropriate spreading-phase cells and avoid confluent or contacting cells that confound protrusion measurements.
- Limited to 2D substrate-associated spreading; may not fully capture 3D invasion or confined migration phenotypes.
