Aislamiento y cultivo de somas vestibulares y ganglionares espirales de roedores neonatales para registros de patch-clamp

Muchos canales iónicos y receptores de neurotransmisores que se encuentran en las terminales de las neuronas aferentes auditivas y vestibulares también se encuentran en sus cuerpos celulares. Los cultivos de cuerpos celulares aislados se pueden estudiar in vitro para comprender cómo estos canales iónicos y receptores influyen en las respuestas de las neuronas. La morfología compacta de los cuerpos celulares permite registros eléctricos de alta calidad para caracterizar las propiedades dependientes del voltaje de los canales iónicos y los receptores de neurotransmisores.

Además, el fácil acceso a una amplia variedad de tipos de células permite un alto rendimiento mediante un análisis físico de la diversidad celular. Los procedimientos serán demostrados por la estudiante de posgrado Katherine Regalado, junto con los becarios postdoctorales, el Dr. Daniel Bronson y Nathaniel Nowak de mi laboratorio. Para comenzar, sostenga una pipeta de vidrio para pastos a la llama de un quemador Bunsen para preparar pipetas de tritración para la disociación celular.

Una vez que la punta del vidrio comience a derretirse, estírelo hasta el diámetro deseado de la punta. Tire de un extremo de la pipeta para separarlo de la llama para crear una pequeña curva. Coloque la pipeta doblada bajo un microscopio.

Con una baldosa de incisión, marque y rompa el vidrio en el diámetro deseado. Pase la punta de la pipeta por la parte superior de la llama del quemador. Esto pulirá rápidamente los bordes ásperos cerca de la punta.

Saca el cerebro del ratón sacrificado con unas tijeras quirúrgicas cerradas. Cortar y extirpar el nervio craneal para separar completamente el cerebro del cráneo. Comenzando en la parte posterior de la cabeza, retire el material membranoso transparente con fórceps y luego corte la parte superior del cráneo con unas tijeras quirúrgicas.

Retire el exceso de tejido de la parte posterior de la cabeza y el cuello para que el área de disección y la cápsula ótica estén más limpios y sean más fáciles de acceder. Transfiera el tejido a una segunda placa de Petri con una solución fresca de L-15. A continuación, localice la cápsula ótica y los nervios vestibulares auditivo, superior, vestibular e inferior.

Separe los ganglios superior e inferior con unas tijeras pequeñas y corte el nervio auditivo. Con un bisturí, afeita suavemente la cresta ósea para debilitar el área ósea debajo de la cual el nervio se sumerge en la cápsula ósea. Retire con cuidado los residuos con un bisturí, exponiendo toda la parte hinchada del ganglio.

Use las tijeras de resorte finas para cortar y separar el ganglio de la rama del nervio periférico que se sumerge hacia el utrículo. Retire el ganglio superior con pinzas finas y transfiéralo a una placa de Petri de 35 milímetros con solución fresca de L-15. Después de precalentar la solución de enzimas, vierta la mezcla de enzimas en una placa de Petri de 35 milímetros y colóquela en una incubadora a 37 grados centígrados durante 10 a 15 minutos.

Limpie el ganglio con pinzas finas y tijeras pequeñas de resorte eliminando el hueso, el exceso de tejido, las fibras nerviosas y cualquier otra estructura superflua. Tenga cuidado de minimizar la extirpación de cualquier tejido ganglionar. Transfiera los ganglios limpios a la solución enzimática precalentada y vuelva a colocarlos en la incubadora durante 10 a 40 minutos.

Luego transfiera los ganglios a la placa de Petri de 35 milímetros con una solución fresca de L-15. Después de dos o tres minutos, transfiera los ganglios a otra placa de Petri de 35 milímetros llena de medios de cultivo filtrados. Transfiera aproximadamente 150 microlitros de medios de cultivo filtrados a un plato con fondo de vidrio recubierto.

Luego, transfiera el número deseado de ganglios al cubreobjetos. Extraiga una pequeña cantidad de medio de cultivo de la placa de cultivo y enjuague la pipeta de tritración con medio para evitar que el tejido se pegue a los lados de la pipeta de vidrio. Triturar pasando suave y repetidamente el tejido a través de la pipeta hasta que los ganglios estén suficientemente disociados.

Después de cinco minutos, revise bajo un microscopio óptico para ver si las células se han asentado en el cubreobjetos. Coloque con cuidado una placa de cultivo en una incubadora a 37 grados centígrados durante 12 a 24 horas. A continuación, localiza la cápsula ótica después de dividir la cabeza en dos y extráela del cráneo astillando los bordes con unas pinzas.

La porción espiral de la cápsula ótica alberga la cóclea con el órgano de Corti. Astillar el hueso, cubriendo las vueltas cocleares con pinzas finas paralelas a la curva del hueso. Use unas tijeras de resorte pequeñas para cortar el modiolo en la base de la cóclea y liberarlo del resto de la cápsula ótica.

Corta el órgano de Corti en dos o tres vueltas con unas tijeras pequeñas de resorte de modo que quede plano, y extirpa el modiolo de cada vuelta. Retire la estría vascular pellizcándola en la base con pinzas finas. Desenrolle alrededor de la espiral y suba hasta el ápice para despegarla del órgano de Corti.

Retire el ganglio espiral cortando en el borde de donde los tractos de fibras de las neuronas del ganglio espiral se proyectan hacia las células ciliadas y luego limpie el ganglio como se muestra anteriormente. Después de tratar enzimáticamente el ganglio espiral, tritrate el ganglio espiral en el medio de cultivo suplementado con N2 y B27. Coloque la placa de cultivo que contiene los ganglios disociados en una incubadora de dióxido de carbono al 5% a 37 grados Celsius durante 12 a 24 horas.

Sumerja la punta de la pipeta en la solución limpia de la placa de cultivo para llenarla con una solución limpia que no contenga anfotericina. Llene la parte posterior de la pipeta con la solución interna que contiene anfotericina. Vuelva a sumergir la punta de la pipeta en la solución limpia de la placa de cultivo mientras la anfotericina entra lentamente en la punta desde la parte posterior de la pipeta.

A continuación, termine de llenar la pipeta con la solución de anfotericina de hasta dos tercios de la pipeta. Baje la pipeta en el baño de la cámara de registro y sitúe la punta de la pipeta en el centro del campo de visión. Asegúrese de que la punta esté libre de burbujas de aire u otros residuos.

Coloque la pipeta cerca de la membrana y aterrice firmemente en el centro de la célula. Aplique presión negativa o succión con una jeringa o pipeta bucal. Encienda el potencial de retención de menos 60 milivoltios.

La resistencia del sello debe aumentar hasta que pase un giga ohmio. Una vez que se forme un sello de giga ohmios, libere la presión negativa. Antes de que la tirosina comience a funcionar, la resistencia de entrada disminuye lentamente y la corriente que fluye en respuesta al paso de voltaje de cinco milivoltios aumenta progresivamente a medida que la anfotericina ingresa a la membrana.

En esta figura se muestran los ejemplos representativos de corrientes celulares enteras evocadas por una neurona ganglionar vestibular. Las corrientes netas de sodio entrantes se identifican aquí por su activación e inactivación transitorias. Las corrientes netas hacia afuera son transportadas en gran parte por iones de potasio y tienen una cinética de activación e inactivación mucho más lenta que las corrientes de sodio.

Las corrientes activadas por nucleótidos cíclicos activados por hiperpolarización, o corrientes HCN, son activadas por una familia de voltajes hiperpolarizantes de larga duración. En esta figura se muestra la estabilidad de la caracterización del canal iónico en el parche perforado en diferentes puntos de tiempo durante el registro. Las curvas de activación dependientes de la tensión de las corrientes de HCN se midieron en una configuración de parche perforado.

La curva tiene una forma sigmoidal y se mantuvo estable a lo largo de una larga grabación. La inestabilidad relativa del modo de parche roto se ilustra mediante curvas sigmoidales no superpuestas de diferentes puntos temporales. Aquí se muestran las curvas de activación de las corrientes de HCN durante una configuración de parche roto.

Aquí se muestran los patrones de disparo en cinco somara ganglionar vestibular, cinco neuronas ganglionares espirales y los pasos actuales correspondientes. Esta heterogeneidad en los patrones de disparo refleja una diversidad fundamental en la composición de los canales subyacentes de sodio y potasio tanto en las neuronas ganglionares vestibulares como en las neuronas ganglionares espirales. Para maximizar la supervivencia celular durante este procedimiento, evite la formación de burbujas de aire, no trabaje demasiado el tejido y permita que las células se asienten antes de colocar las muestras en la incubadora.

La pinza de parche perforada permite el estudio de los canales iónicos que son modulados por segundos mensajeros citosólicos, lo cual es fundamental para investigar los efectos de los neurotransmisores eferentes en las neuronas ganglionares. Las grabaciones de estas neuronas bipolares han sido fundamentales para revelar cómo la diversidad biofísica contribuye a la diversidad funcional de las neuronas sensoriales.