Name: Aislamiento y cultivo de somas vestibulares y ganglionares espirales de roedores neonatales para registros de patch-clamp (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-21T12:40:00.000+00:00
Duration: 11 min 5 s
Description: Aprenda a aislar y cultivar neuronas vestibulares y ganglionares espirales de roedores neonatales para realizar registros de patch-clamp. Este método permite estudiar propiedades electrofisiológicas de canales iónicos en neurociencia.

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Agradecemos a los doctores Jing Bing Xue y Ruth Anne Eatock por sus primeras contribuciones a estos métodos. Este trabajo fue apoyado por NIH NIDCD R03 DC012652 y NIDH NIDCD DC012653S, y R01 DC0155512 a RK y T32 DC009975 a DB, NN y KR.

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<li>Adamson, C. L., Reid, M. A., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposite+actions+of+brain-derived+neurotrophic+factor+and+neurotrophin-3+on+firing+features+and+ion+channel+composition+of+murine+spiral+ganglion+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Opposite actions of brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 on firing features and ion channel composition of murine spiral ganglion neurons.</a> The Journal of Neuroscience. 22 (4), 1385-1396 (2002).</li>
<li>Zhou, Z., Liu, Q., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+regulation+of+spiral+ganglion+neuron+firing+patterns+by+neurotrophin-3%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Complex regulation of spiral ganglion neuron firing patterns by neurotrophin-3.</a> The Journal of Neuroscience. 25 (33), 7558-7566 (2005).</li>
<li>Liu, X. -P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sodium+channel+diversity+in+the+vestibular+ganglion%3A+NaV1.5%2C+NaV1.8%2C+and+tetrodotoxin-sensitive+currents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Sodium channel diversity in the vestibular ganglion: NaV1.5, NaV1.8, and tetrodotoxin-sensitive currents.</a> Journal of Neurophysiology. 115 (5), 2536-2555 (2016).</li>
</ol>

Los autores declaran que no existen conflictos de intereses.

Los métodos presentados aquí son específicos para grabaciones de neuronas aisladas; Estudios anteriores se han centrado en grabaciones de terminales axónicos en una preparación semiintacta. En comparación con las técnicas de grabación de terminales existentes, las grabaciones aisladas ofrecen un comportamiento superior de fijación de espacio e isopotencial. Además, este protocolo proporciona acceso a una muestra más amplia de neuronas, ya que solo las subpoblaciones portadoras de cáliz son accesibles en los registros sem...

Las neuronas bipolares del nervio vestibulococlear conectan las células ciliadas sensoriales del oído interno con el tronco encefálico. Son los principales portadores de información sobre el sonido y los movimientos de la cabeza; El daño a estas células importantes conduce a la sordera y a los trastornos del equilibrio. Las porciones vestibular y auditiva del nervio están compuestas por distintos tipos de células que son morfológica y funcionalmente diversas 1,2. En el sistema vestibular, dos subpoblaciones aferentes disparan espontáneamente a intervalos regulares o irregulares2. Se cree que la sincronización de picos aferentes refleja una diversidad subyacente en la composición de los canales iónicos 3,4. En el sistema auditivo, hay dos subpoblaciones principales de neuronas ganglionares espirales (SGN); mientras que las SGN de tipo I entran en contacto con células ciliadas internas individuales5, las SGN de tipo II contactan con múltiples células ciliadas externas5. Los registros in vitro de cultivos semiintactos y organotípicos sugieren diferencias en las propiedades de membrana de las SGN de tipo I y tipo II 6,7.
Muchos canales iónicos y receptores de neurotransmisores que se encuentran en las terminales de estas neuronas también se encuentran en sus cuerpos celulares. Como tal, los cultivos del soma vestibular aislado y del ganglio espiral se pueden estudiar in vitro para comprender cómo los canales iónicos y los receptores de neurotransmisores contribuyen a la respuesta de estas neuronas. La morfología compacta de los cuerpos celulares aislados permite registros eléctricos de alta calidad, adecuados para la caracterización detallada de canales iónicos dependientes de voltaje y receptores de neurotransmisores. El fácil acceso a una variedad representativa de subtipos de neuronas permite un análisis de alto rendimiento de la diversidad celular.
Este artículo presenta un método para aislar y cultivar cuerpos de células ganglionares disociadas de la porción superior del ganglio vestibular en ratas en el día postnatal (P)9 a P20. También se proporcionan sugerencias para extender estos métodos al ganglio espiral, además de los pasos necesarios para extraer, disociar y colocar placas con éxito en las células ganglionares. Estos métodos son una evolución de los ideados en publicaciones de diversos laboratorios 8,9,10. También se incluye en este documento una guía para seleccionar células sanas para los registros de patch-clamp.
Por último, el protocolo describe el procedimiento para el registro de patch-clamp utilizando la configuración de patch-patch-perforado11. Aunque la configuración de parche perforado requiere más tiempo y es más desafiante técnicamente que la configuración de parche roto más común, es mejor para mantener el entorno citoplasmático que permite sesiones de grabación largas y estables. Los beneficios de esta configuración de grabación se ilustran aquí a través de la estabilidad mejorada de las corrientes catiónicas activadas por hiperpolarización en parches perforados en relación con los registros de parches rotos.
Este protocolo está organizado en cinco secciones. En las secciones 1 a 3 se describen las soluciones y herramientas que se pueden preparar y almacenar con antelación. En la sección 4 se describen los pasos para la disección y la siembra de las células vestibulares y las SGN, y en la sección 5 se describen los pasos para el registro de las neuronas después de un período de cultivo. En nuestras manos, la sección 4 y la sección 5 se realizan durante un período de 2 días consecutivos.

<table><tbody><tr><td>Anfotericina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4888-100MG</td><td>Para grabaciones de parches perforados.</td></tr><tr><td>ATP disódico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7699</td><td>Aditivo a la solución interna</td></tr><tr><td>B27 Suplemento (50x), sin suero</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17504044</td><td>aditivo para medio de cultivo, para SGN</td></tr><tr><td>Beakers (1000, 100, 10) centrífuga de sobremesa de mililitros</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>USA Scientific</td><td>2641-0016</td><td></td></tr><tr><td>Mechero</td><td></td><td></td><td></td> Bunsen</tr><tr><td>CaCl2</td><td>J.T. Baker</td><td>1311-01</td><td>Aditivo a la solución interna</td></tr><tr><td>Colagenasa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5318</td><td>una de cada tres enzimas para digerir el tejido</td></tr><tr><td>Cubreobjetos, rectangular, #1 de grosor, 22x40&nbsp;</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0707</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Biotium</td><td>90082</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I, del páncreas bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11284932001</td><td>una de cada tres enzimas para digerir el tejido</td></tr><tr><td>Pinzas Dumont #3 (romas)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11231-30</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Pinzas (finas)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-10</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #55 Pinzas ( Fine)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E0396</td><td>Aditivo para solución interna</td></tr><tr><td>Extractor de electrodos</td><td>Narashige</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>Fuente de luz de epiiluminación&nbsp;</td><td>Zeiss&nbsp;</td><td>CL 1500 ECO</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Ethanol Decon Labs</td><td>2716</td><td>para la limpieza del cabezal y alrededor del banco de disección</td></tr><tr><td>Capilares de borosilicato filamentado para electrodos</td><td>Sutter Instruments</td><td>BF140-117-10</td><td></td></tr><tr><td>Cuchilla de disección de filo</td><td>fino Fine Science Tools</td><td>10010-00</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas Pasteur de vidrio</td><td>VWR</td><td>14673-010</td><td>para tirar pipetas de trituración</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino inactivado por calor</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16140063</td><td>aditivo para el medio de cultivo</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375-100G</td><td>para la amortiguación de pH de todas las soluciones en protocolo</td></tr><tr><td>Placa caliente / agitadores magnéticos&nbsp;</td><td>VWR</td><td>76549-914</td><td></td></tr><tr><td>Cubo aislado lleno de hielo</td><td></td><td></td><td>para mantener frías todas las muestras y soluciones</td></tr><tr><td>K2SO4, sulfato de potasio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9458-250G</td><td>Aditivo a la solución interna</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P93333</td><td>Aditivo a la solución interna</td></tr><tr><td>KOH (1 M)</td><td>Honeywell</td><td>319376-500ML</td><td>Para llevar la solución interna a pH deseado.</td></tr><tr><td>Tijeras de resorte grandes</td><td>Fine Science Tools</td><td>14133-13</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz medium&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L4386</td><td>soluciones de disección y baño&nbsp;</td></tr><tr><td>Cámara de grabación de baño de perfil bajo para placas de cultivo</td><td>Jeringas Luer-Lok Warner Instruments</td><td>64-0236</td><td></td></tr>, <tr><td>302832</td><td>BD</td><td>de 30 ml</td><td>para extraer la solución L-15/HEPES/HEPES.</td></tr><tr><td>MEM + Glutamax Suplemento</td><td>Fisher Scientific</td><td>41-090-101</td><td>base del medio de cultivo</td></tr><tr><td>MgCl2-Hexahidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1028</td><td>Aditivo a la solución interna</td></tr><tr><td>aguja microFil para el llenado de micropipetas - calibre 34&nbsp;</td><td>World Precision Instruments</td><td>MF34G</td><td></td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narashige</td><td>MF-90</td><td>Para el pulido de electrodos.</td></tr><tr><td>N2 Suplemento (100x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17502-048</td><td>aditivo para medio de cultivo, para SGN</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>Aditivo para solución interna</td></tr><tr><td>NaOH (1 M)</td><td>Thomas Scientific</td><td>319511-500ML</td><td>para valoración</td></tr><tr><td>Osmómetro</td> de pH <td>Advanced Instruments Inc.</td><td>3320</td><td></td></tr><tr><td>Oxígeno, grado médico, con regulador y tubo adecuados</td><td>MEDOX200 de gestión de materiales USC</td><td>(Identificador: 00015)</td><td>para disolver en soluciones de disección y baño</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM992</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur bulbo de pipeta (3 ml)</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-448-25</td><td>bombilla para pipetas de trituración</td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Thermo Fisher Aditivo científico</td><td>15140122</td><td>para prevenir la contaminación del medio de cultivo Solución de</td></tr><tr><td>eutanasia a base de pentobarbital (p. ej., Fatal Plus. 50 &ndash; dosis de 60 mg/kg)&nbsp;</td><td>MWI Animal Health</td><td>15199</td><td>para</td></tr><tr><td>filtros de membrana PES para eutanasia, &nbsp; 0,2 micrómetros&nbsp;</td><td>Nalgene</td><td>566-0020</td><td>para soluciones filtrantes</td></tr><tr><td>Filtros de jeringa estériles de membrana PES, 0,22 mmm, 30 mm&nbsp;</td><td>CELLTREAT</td><td>229747</td><td>para filtrar soluciones introducidas en jeringas Placas</td></tr><tr>de<td>Petri, 35 x 10 mm</td><td>Genessee Scientific</td><td>32-103</td><td>para microdisección y para retener la solución de inmersión de punta en configuración de parche perforado</td></tr><tr><td>Placas de Petri, 60 x 15 mm</td><td>Midland Scientific</td><td>P7455</td><td>para disección macroscópica</td></tr><tr><td>Medidor de pH Mettler</td><td>Toledo</td><td>Modelo S20</td><td></td></tr><tr><td>Pipettores (1000, 200, 10) microlitro</td><td>USA Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plato de cultivo con fondo de vidrio recubierto de poli-d-lisina</td><td>Mattek</td><td>P35GC-0-10-C</td><td>para placas de neuronas para cultivo</td></tr><tr><td>Plataforma de cambio rápido, base calefactada, para placas de cultivo de 35 mm</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0375</td><td></td></tr><tr><td>Referencia</td><td>Cell World Precision Instruments</td><td>RC1T</td><td></td></tr><tr><td>Hoja de bisturí Miltex</td><td></td><td>4-315</td><td></td></tr><tr><td>Mango de bisturí</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Escala Científica</td><td>Mettler Toledo</td><td>XS64</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas serológicas (10, 25) mililitros</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit de grasa de silicona (para sellar cubreobjetos y cámaras)</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0378</td><td></td></tr><tr><td>Guillotina para animales pequeños</td><td>Kent Scientific</td><td>DCAP</td><td></td></tr><tr><td>Guillotina para animales pequeños</td><td>Kent Scientific</td><td>DCAP</td><td>para la decapitación si se diseccionan ratas mayores de P15.</td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico de disección&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras quirúrgicas rectas</td><td>Fine Science Tools</td><td>14060-09</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa (3, 10, 30) mililitro</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1426</td><td>una de cada tres enzimas para digerir el tejido Jeringa de</td></tr><tr><td>tuberculina&nbsp;</td><td>Covidien</td><td>8881500105</td><td>para administrar una solución de eutanasia por inyección intraperitoneal</td></tr><tr><td>Tijera de resorte Vannas, 2,5 mm Cutting Edge</td><td>Science Tools</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>Matraz aforado, 1000 mililitros</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>VWR</td><td>945300</td><td></td></tr><tr><td>Agua, estéril u ltrapure, R>18.18 megaOhms cm (p. ej., filtrada por un sistema de purificación de agua Millipore-Sigma sistema)</td><td>Millipore-Sigma</td><td>CDUFBI001</td><td></td></tr></tbody></table>

aislamiento y cultivo de somas vestibulares y ganglionares espirales de roedores neonatales para registros de patch-clamp

Isolating and Culturing Vestibular and Spiral Ganglion Somata from Neonatal Rodents for Patch-Clamp Recordings

La morfología compacta de las neuronas ganglionares del oído interno aisladas y cultivadas permite caracterizaciones detalladas de los canales iónicos y los receptores de neurotransmisores que contribuyen a la diversidad celular en esta población. Este protocolo describe los pasos necesarios para la disección, disociación y cultivo a corto plazo exitosos de la somata de las neuronas bipolares del oído interno con el fin de realizar registros de pinzas de parche. Se proporcionan instrucciones detalladas para preparar las neuronas ganglionares vestibulares con las modificaciones necesarias para colocar placas en las neuronas ganglionares espirales. El protocolo incluye instrucciones para realizar registros de patch-clamp de celda completa en la configuración de patch perforado. Los resultados de ejemplo que caracterizan los registros de pinza de voltaje de corrientes mediadas por nucleótidos cíclicos activados por hiperpolarización (HCN) resaltan la estabilidad de la configuración de registro de parches perforados en comparación con la configuración de parches rotos más estándar. La combinación de estos métodos, somata aislado más registros de pinza de parche perforado, se puede utilizar para estudiar procesos celulares que requieren registros largos y estables y la preservación del medio intracelular, como la señalización a través de receptores acoplados a proteínas G.

La ejecución de protocolos de pinza de voltaje mediante la aplicación de familias de pasos de voltaje revela la activación dependiente del voltaje de una variedad de diferentes familias de corrientes. En la Figura 1A,B se muestran ejemplos representativos de corrientes de células enteras evocadas a partir de una VGN y adaptadas de grabaciones publicadas13. La aplicación de voltajes despolarizantes (Figura 1B) activa una c...

A continuación se presentan métodos que proporcionan instrucciones detalladas para la disección, la disociación, el cultivo y el registro de pinzas de parche de las neuronas ganglionares vestibulares y ganglionares espirales del oído interno.

Aislamiento y cultivo de somas vestibulares y ganglionares espirales de roedores neonatales para registros de patch-clamp

The compact morphology of isolated and cultured inner ear ganglion neurons allows for detailed characterizations of the ion channels and neurotransmitter ...

Muchos canales iónicos y receptores de neurotransmisores que se encuentran en las terminales de las neuronas aferentes auditivas y vestibulares también se encuentran en sus cuerpos celulares. Los cultivos de cuerpos celulares aislados se pueden estudiar in vitro para comprender cómo estos canales iónicos y receptores influyen en las respuestas de las neuronas. La morfología compacta de los cuerpos celulares permite registros eléctricos de alta calidad para caracterizar las propiedades dependientes del voltaje de los canales iónicos y los receptores de neurotransmisores.Además, el fácil acceso a una amplia variedad de tipos de células permite un alto rendimiento mediante un análisis físico de la diversidad celular. Los procedimientos serán demostrados por la estudiante de posgrado Katherine Regalado, junto con los becarios postdoctorales, el Dr. Daniel Bronson y Nathaniel Nowak de mi laboratorio. Para comenzar, sostenga una pipeta de vidrio para pastos a la llama de un quemador Bunsen para preparar pipetas de tritración para la disociación celular.Una vez que la punta del vidrio comience a derretirse, estírelo hasta el diámetro deseado de la punta. Tire de un extremo de la pipeta pa

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Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Este video muestra el proceso para aislar explantes de ganglios espirales del oído interno y co-cultivarlos con el órgano de Corti en una matriz de electrodos múltiples. Los ganglios espirales se extraen cuidadosamente y se seccionan en secciones de tejido más pequeñas o explantes. Estos explantes se cultivan en el área activa de la matriz de electrodos múltiples para promover el crecimiento del proceso neuronal.

Cultivo de explantes de neuronas espirales murinas en matrices de electrodos múltiples

Este video muestra un método para aislar neuronas vestibulares del oído interno de un cachorro de ratón. Describe meticulosamente los pasos involucrados en la disección del oído interno, la recolección del ganglio vestibular y, posteriormente, la disociación del ganglio en células individuales. A continuación, estas células se cultivan en placas con fondo de cristal para establecer un cultivo de neuronas vestibulares.

Aislamiento de neuronas ganglionares vestibulares del oído interno de un ratón

Este video muestra una técnica de patch-clamp de celda completa para el registro electrofisiológico de la retina de un ratón de montaje plano. Se utiliza una pipeta de vidrio delgada con un electrodo para acercarse a las células amacrinas (SAC) dentro de la retina. Después de formar un sello, se aplica succión para romper la membrana y formar la configuración de abrazadera de parche de celda completa. Finalmente, se mide el flujo de iones a través de los receptores sinápticos SAC utilizando la...

Establecimiento de una pinza de parche de celda completa para el registro electrofisiológico de una retina de ratón de montaje plano

Este video muestra la técnica de patch-clamp para medir las corrientes iónicas en los cuerpos de las células de las neuronas sensoriales del oído interno. En él se detalla la preparación y el uso de una pipeta de pinza parche pulida rellena con una solución interna que contiene anfotericina B, que perfora la membrana para permitir el movimiento de los iones mientras se conservan las condiciones intracelulares. Los pulsos de voltaje se aplican para activar y registrar la actividad del canal...

Grabaciones de patch-clamp perforado de cuerpos de células de neuronas sensoriales del oído interno

La estimulación del nervio infrarrojos ha sido propuesta como una alternativa a la estimulación eléctrica en una gama de tipos de nervios, incluyendo los asociados con el sistema auditivo. Este protocolo describe un método de patch clamp para estudiar el mecanismo de estimulación nerviosa de infrarrojos en un cultivo de neuronas auditivas primarias.

Whole Cell Patch Clamp para investigar los mecanismos de la Estimulación Neural infrarrojos

Análisis de la función de las células ciliadas vestibulares se complica por su ubicación en lo profundo de la parte más dura del cráneo, hueso temporal pétreo. La mayoría de los estudios de células pilosas funcionales han utilizado intensamente células ciliadas aislados. A continuación se describe una preparación semi-intacta de ratón epitelio vestibular para estudios electrofisiológicos y de microscopía de dos fotones.

Una preparación semi-intacta aislada del ratón epitelio sensorial vestibular de Electrofisiología y de alta resolución de la microscopía de dos fotones

Se describe la disección del sistema nervioso de la liebre de mar...

El aislamiento de las neuronas sensoriales de<em&gt; Aplysia californica</em&gt; Se Patch clamp grabaciones de Corrientes glutamatérgicos

Este manuscrito describe cómo preparar ganglios de raíz dorsal intactos para grabaciones de pinza de parche. Esta preparación mantiene el microambiente para las neuronas y las células gliales satélite, evitando así los cambios fenotípicos y funcionales observados con las neuronas DRG disociadas.

Patch Clamp grabaciones en Intacto dorsal ganglios de la raíz de ratas adultas

Este protocolo describe métodos para registrar la respuesta auditiva del médula oblonga de crías de rata postnatal. Para examinar el desarrollo funcional de las células de pelo externas, el procedimiento experimental de la abrazadera del remiendo de célula entera en aisladas células de pelo externas se describe paso a paso.

Respuesta auditiva del médula oblonga y la célula de pelo externa celulares parche abrazadera grabación en ratas postnatales

Aquí presentamos un protocolo para el aislamiento, purificación y cultivo de células marginales primarias de la stria vascular del ratón, y para establecer modelos in vitro de estrés oxidativo y senescencia celular para estudiar trastornos de la pared coclear lateral.

Aislamiento y cultivo de células marginales primarias de la Stria vascularis en ratones neonatales

We present a new dissection method to extract the vestibular ganglion and all five vestibular organs (utricle, saccule, and three cristae: lateral/horizontal, anterior, and posterior) as one whole-mount vestibular complex. Confocal imaging allows visualization of vestibular neuron cell bodies for quantification, as well as neuronal projections to the sensory...

Whole-Mount Dissection of the Vestibular Complex and Quantification of Vestibular Ganglion Neurons in Mice

Aprenda a aislar y cultivar neuronas vestibulares y ganglionares espirales de roedores neonatales para realizar registros de patch-clamp. Este método permite estudiar propiedades electrofisiológicas de canales iónicos en neurociencia.

Aislamiento y cultivo de somas vestibulares y ganglionares espirales de roedores neonatales para registros de patch-clamp

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