Isolement et culture de somates ganglionnaires vestibulaires et spiralés de rongeurs nouveau-nés pour les enregistrements Patch-Clamp

De nombreux canaux ioniques et récepteurs de neurotransmetteurs qui se trouvent aux extrémités des neurones afférents auditifs et vestibulaires se trouvent également dans leurs corps cellulaires. Les cultures de corps cellulaires isolés peuvent être étudiées in vitro pour comprendre comment ces canaux ioniques et récepteurs influencent les réponses des neurones. La morphologie compacte des corps cellulaires permet des enregistrements électriques de haute qualité pour caractériser les propriétés voltage-dépendantes des canaux ioniques et des récepteurs des neurotransmetteurs.

De plus, l’accès facile à une grande variété de types de cellules permet un débit élevé grâce à une analyse physique de la diversité cellulaire. Les procédures seront démontrées par Katherine Regalado, étudiante aux cycles supérieurs, ainsi que par les boursiers postdoctoraux, le Dr Daniel Bronson et Nathaniel Nowak de mon laboratoire. Pour commencer, tenez une pipette de pâturage en verre sur la flamme d’un bec Bunsen pour préparer des pipettes de tritration pour la dissociation cellulaire.

Une fois que la pointe du verre commence à fondre, étirez le verre jusqu’au diamètre de pointe souhaité. Retirez une extrémité de la pipette de la flamme pour créer une petite courbure. Placez la pipette pliée sous un microscope.

À l’aide d’une tuile d’inciseur, entaillez et cassez le verre au diamètre désiré. Passez l’embout de la pipette sur le dessus de la flamme du brûleur. Cela polira rapidement les bords rugueux près de la pointe.

Retirez le cerveau de la souris euthanasiée à l’aide de ciseaux chirurgicaux fermés. Sectionnez et enlevez le nerf crânien pour détacher complètement le cerveau du crâne. En commençant par l’arrière de la tête, retirez le matériau membraneux transparent avec une pince, puis découpez le haut du crâne à l’aide de ciseaux chirurgicaux.

Retirez l’excès de tissu de l’arrière de la tête et du cou pour rendre la zone de dissection et la capsule otique plus propres et plus faciles d’accès. Transférez le tissu dans une deuxième boîte de Pétri avec une solution fraîche de L-15. Localisez ensuite la capsule otique et les nerfs vestibulaires auditifs, supérieurs, vestibulaires et inférieurs.

Séparez les ganglions supérieurs et inférieurs à l’aide de petits ciseaux à ressort et coupez le nerf auditif. À l’aide d’un scalpel, rasez doucement la crête osseuse pour affaiblir la zone osseuse sous laquelle le nerf plonge dans la capsule osseuse. Retirez soigneusement les débris avec un scalpel, exposant toute la partie enflée du ganglion.

Utilisez les ciseaux à ressort fins pour couper et séparer le ganglion de la branche nerveuse périphérique qui plonge vers l’utricule. Retirez le ganglion supérieur à l’aide d’une pince fine et transférez-le dans une boîte de Pétri de 35 millimètres avec une solution fraîche de L-15. Après avoir préchauffé la solution enzymatique, versez le mélange enzymatique dans une boîte de Pétri de 35 millimètres et placez-la dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant 10 à 15 minutes.

Nettoyez le ganglion à l’aide d’une pince fine et de petits ciseaux à ressort en enlevant l’os, l’excès de tissu, les fibres nerveuses et toute autre structure superflue. Prenez soin de minimiser l’ablation de tout tissu ganglionnaire. Transférez les ganglions nettoyés dans la solution enzymatique préchauffée et remettez-la dans l’incubateur pendant 10 à 40 minutes.

Transférez ensuite les ganglions dans la boîte de Pétri de 35 millimètres avec une solution fraîche de L-15. Après deux à trois minutes, transférez les ganglions dans une autre boîte de Pétri de 35 millimètres remplie de milieux de culture filtrés. Transférez environ 150 microlitres de milieu de culture filtré dans une boîte à fond en verre enduit.

Ensuite, transférez le nombre souhaité de ganglions sur la lamelle. Prélevez une petite quantité de milieu de culture dans la boîte de culture et rincez la pipette de tritration avec un médium pour éviter que le tissu ne colle aux parois de la pipette en verre. Triturer en passant doucement et à plusieurs reprises le tissu à travers la pipette jusqu’à ce que les ganglions soient suffisamment dissociés.

Au bout de cinq minutes, vérifiez au microscope optique si les cellules se sont déposées sur la lamelle. Placez soigneusement une boîte de culture dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant 12 à 24 heures. Ensuite, localisez la capsule otique après avoir coupé la tête en deux et extrayez-la du crâne en ébréchant les bords à l’aide d’une pince.

La partie spirale de la capsule otique abrite la cochlée avec l’organe de Corti. Ébrécher l’os, en recouvrant les virages cochléaires avec une pince fine parallèle à la courbe de l’os. Utilisez de petits ciseaux à ressort pour sectionner le modiolus à la base de la cochlée afin de le libérer du reste de la capsule otique.

Coupez l’organe de Corti en deux ou trois tours à l’aide de petits ciseaux à ressort de manière à ce qu’il repose à plat, et excisez le modiolus de chaque tour. Retirez la strie vasculaire en pinçant la strie à la base avec une pince fine. Déroulez autour de la spirale et jusqu’à l’apex pour la libérer de l’organe de Corti.

Retirez le ganglion spiralé en coupant au bord de l’endroit où les faisceaux de fibres neuronales ganglionnaires spirales se projettent vers les cellules ciliées, puis nettoyez le ganglion comme indiqué précédemment. Après un traitement enzymatique du ganglion spiral, tritrer le ganglion spiral dans le milieu de culture complété par N2 et B27. Placez la boîte de culture contenant les ganglions dissociés dans un incubateur à 37 degrés Celsius, 5% de dioxyde de carbone pendant 12 à 24 heures.

Trempez l’embout de la pipette dans la solution propre de la boîte de culture pour la remplir d’une solution propre qui ne contient pas d’amphotéricine. Remplissez l’arrière de la pipette avec la solution interne contenant l’amphotéricine. Replongez l’embout de la pipette dans la solution propre de la boîte de culture pendant que l’amphotéricine pénètre lentement dans l’embout par l’arrière de la pipette.

Ensuite, terminez le remplissage de la pipette avec la solution d’amphotéricine des deux tiers de la pipette. Abaissez la pipette dans le bain de la chambre d’enregistrement et placez la pointe de la pipette au milieu du champ de vision. Assurez-vous que l’embout est exempt de bulles d’air ou d’autres débris.

Positionnez la pipette près de la membrane et atterrissez fermement au centre de la cellule. Appliquez une pression négative ou une aspiration à l’aide d’une seringue ou d’une pipette buccale. Activez le potentiel de maintien de moins 60 millivolts.

La résistance de l’étanchéité devrait augmenter jusqu’à ce qu’elle dépasse un giga ohm. Une fois qu’un joint giga ohm se forme, relâchez la pression négative. Avant que la tyrosine ne commence à agir, la résistance d’entrée diminue lentement et le courant circulant en réponse au pas de tension de cinq millivolts augmente progressivement à mesure que l’amphotéricine pénètre dans la membrane.

Les exemples représentatifs de courants de cellules entières évoqués par un neurone ganglionnaire vestibulaire sont présentés dans cette figure. Les courants nets de sodium entrants sont identifiés ici par leur activation et leur inactivation transitoires. Les courants nets vers l’extérieur sont transportés en grande partie par les ions potassium et ont une cinétique d’activation et d’inactivation beaucoup plus lente que les courants de sodium.

Les courants cycliques nucléotidiques activés par hyperpolarisation, ou courants HCN, sont activés par une famille de tensions hyperpolarisantes de longue durée. La stabilité de la caractérisation des canaux ioniques dans la zone perforée à différents moments de l’enregistrement est illustrée dans cette figure. Les courbes d’activation dépendantes de la tension des courants HCN ont été mesurées dans une configuration de patch perforé.

La courbe a une forme sigmoïdale et était stable tout au long d’un long enregistrement. L’instabilité relative du mode de patch rompu est illustrée par des courbes sigmoïdales qui ne se chevauchent pas à partir de différents points temporels. Les courbes d’activation des courants HCN lors d’une configuration de patch rompue sont présentées ici.

Les schémas de déclenchement dans cinq somara ganglionnaire vestibulaire, cinq neurones ganglionnaires spiralés et les étapes actuelles correspondantes sont présentés ici. Cette hétérogénéité dans les schémas de déclenchement reflète une diversité fondamentale dans la composition des canaux sodiques et potassiques sous-jacents dans les neurones ganglionnaires vestibulaires et les neurones ganglionnaires spiralés. Pour maximiser la survie des cellules au cours de cette procédure, évitez de former des bulles d’air, ne surmenez pas les tissus et laissez les cellules se déposer avant de placer les échantillons dans l’incubateur.

La pince de raccordement perforée permet d’étudier les canaux ioniques qui sont modulés par les seconds messagers cytosoliques, ce qui est essentiel pour étudier les effets des neurotransmetteurs efférents sur les neurones ganglionnaires. Les enregistrements par patch clamp de ces neurones bipolaires ont joué un rôle déterminant dans la révélation de la façon dont la diversité biophysique contribue à la diversité fonctionnelle des neurones sensoriels.