Visualización bidimensional de superresolución de la microvasculatura cerebral de rata mediante microscopía de localización por ultrasonido

El alcance de nuestra investigación se centra en desarrollar un protocolo para la microscopía de localización por ultrasonido para lograr imágenes de súper resolución de la microvasculatura cerebral de rata. Nuestro objetivo es abordar los desafíos de equilibrar la resolución especial y las profundidades de penetración en la obtención de imágenes de vasos pequeños, proporcionando información detallada sobre la estructura vascular y la dinámica del flujo sanguíneo en estados sanos y de enfermedad.

Nuestro protocolo ofrece la ventaja de lograr una alta resolución espacial de 12,5 micrómetros, manteniendo una profundidad de penetración de hasta 12 milímetros, superando los métodos convencionales, como la resonancia magnética, la tomografía computarizada y el ultrasonido doble. A diferencia de las técnicas ópticas, permite obtener imágenes de regiones cerebrales profundas, reconstruir estructuras microvasculares y visualizar la dinámica del flujo sanguíneo simultáneamente.

Nuestros resultados allanan el camino para investigar los cambios microvasculares en trastornos neurológicos, como el tumor glioblástico y la enfermedad de Alzheimer. La capacidad de visualizar la dinámica del flujo sanguíneo y la arquitectura microvascular con alta resolución abre nuevas oportunidades para estudiar la progresión de la enfermedad, la eficacia del tratamiento y la relación entre las alteraciones musculares y la función cerebral.

[Narrador] Para comenzar, coloque la rata anestesiada en la mesa de operaciones. Asegure los incisivos superiores de la rata en la muesca de la barra incisiva, colocando la mandíbula inferior debajo de la barra. Coloque las barras de los oídos en la hendidura ósea, ligeramente anterior y superior al canal auditivo, asegurándose de que la superficie craneal permanezca horizontal. Aplique una pequeña cantidad de presión en diferentes partes de la cabeza para evaluar la estabilidad. Ajuste la altura de la plataforma de imágenes y ajuste el ángulo de la cabeza de la rata utilizando la muesca de la barra incisiva para garantizar una respiración sin obstrucciones. Aplique ungüento de eritromicina o solución de glicerina al 30% en los ojos de la rata para protegerlos de las luces quirúrgicas y mantener la humedad. Con una cortadora eléctrica de mano, afeite la cabeza de la rata en contra de la dirección del crecimiento del vello, cubriendo el área entre las orejas y desde los ojos hasta el cuello. Ahora, haga una incisión a lo largo de la sutura sagital del cráneo de la rata, comenzando solo el hueso occipital y extendiéndose aproximadamente cuatro centímetros hacia arriba. Use hemostáticos para retraer la piel en ambos lados. Opcionalmente, extirpe la piel sobre el cráneo para un mayor acceso. Use unas tijeras pequeñas para quitar el periostio del cráneo, exponiendo completamente la capa de hueso duro. Realice la craneotomía con un mini taladro craneal de mano, con una broca esférica de 2,5 milímetros. Golpee suavemente para trenzar el hueso, perforando durante dos o tres segundos a la vez, comenzando en el centro y progresando hacia afuera. Inyecte aproximadamente un mililitro de solución de cloruro de sodio al 0.9% cada dos minutos en el área de perforación para enfriar y enjuagar los escombros. Cambie a una broca más fina de un milímetro una vez que el tejido óseo blanco ya no parezca estar conectado de manera consistente. Continúe perforando hasta que los vasos sanguíneos principales centrales sean claramente visibles como de color marrón oscuro con el tejido circundante que aparece rosado y los microvasos ligeramente rojizos. Para preparar el agente de contraste, disuelva el gas SF6 y el polvo de agente de contraste liofilizado en cinco mililitros de cloruro de sodio al 0,9%. Agite vigorosamente la mezcla para formar una microburbuja, o suspensión MB, con una concentración final de SF6 de ocho microlitros por mililitro. Extraiga 0,8 mililitros de la suspensión MB en una jeringa de un mililitro conectada a una bomba de microinyección. Inserte una aguja permanente de calibre 26 con un catéter en la vena de la cola de la rata e inyecte. Antes de la imagen, monte una sonda con una frecuencia central de 15,625 megahercios en el brazo manipulador del instrumento estereotáxico cerebral equipado con una pinza. Coloque la sonda de ultrasonido directamente sobre el cerebro de rata expuesto y aplique gel de acoplamiento a la superficie cerebral expuesta para garantizar una transmisión óptima de la señal. Abra la interfaz principal del software, que integra un atlas cerebral envolvente con programas de control de movimiento motor. Establezca el punto BGMA como origen y use la pantalla en tiempo real del software para monitorear la trayectoria de la sonda y la ubicación correspondiente del corte de cerebro de rata. Seleccione el plano de imagen de destino, como BGMA menos un milímetro. Inicie el software MATLAB 2021a e introduzca el script de adquisición de datos en MATLAB 2021a. En el directorio raíz, escriba "activar" en la ventana de línea de comandos para activar el entorno de ejecución. Luego, establezca las profundidades de inicio y final de la recopilación de datos en cinco y 120 longitudes de onda, respectivamente, para capturar de manera efectiva la región de interés. Establezca los ángulos de dirección de transmisión de onda plana de menos cinco grados a cinco grados en incrementos de 2,5 grados para mejorar la resolución y el contraste de la imagen. La microscopía de localización por ultrasonido reveló una visualización clara de los microvasos a profundidades de hasta 12 milímetros. El análisis de la anchura total a la mitad del máximo indicó que el diámetro del vaso detectable más pequeño era de 13 micrómetros. La correlación del anillo de Fourier confirmó la resolución espacial de las imágenes microvasculares como 12,5 micrómetros. Las direcciones del flujo sanguíneo en una corte transversal del cerebro de rata demostraron un flujo descendente en pequeñas arterias corticales y un flujo ascendente en pequeñas venas, representadas por colores azul y rojo, respectivamente. Un mapa de velocidad mostró tasas de flujo más altas en recipientes más grandes, con la mayoría de las velocidades concentradas en el rango de 10 a 25 milímetros por segundo. Las imágenes del modelo de rata con glioblastoma mostraron dilatación vascular anormal, irregularidades estructurales cerca del tumor, patrones de flujo sanguíneo alterados en la región del tumor y un flujo vascular heterogéneo dentro y alrededor del tumor.