Name: Desarrollo de un enfoque basado en la microfluídica para investigar la mecánica de los polímeros de microtúbulos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-30T14:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 3 s
Description: Aprenda a desarrollar un dispositivo microfluídico para estudiar la mecánica de microtúbulos in vitro mediante fabricación de silicio y modelado computacional. Este método mejora el análisis de alta producción y reduce la formación de burbujas de aire.

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La microfluídica permite un control preciso de minúsculos volúmenes de fluido, a menudo menos de un microlitro, mediante el intrincado diseño y la fabricación de canales de flujo de fluido 1,2. La pequeña escala de los dispositivos microfluídicos da lugar a fenómenos de ingeniería únicos. Es decir, el número de Reynolds, una medida adimensional de la relación entre las fuerzas inerciales y viscosas en el flujo de fluidos, es pequeño, generalmente del orden de O(10) o menor en microfluídica, lo que subraya la importancia de las fuerzas viscosas en los dispositivos microfluídicos. Además, el número de Péclet, que compara el transporte convectivo con el difusivo, muestra que el transporte convectivo es generalmente insignificante en microfluídica 3,4,5. Este régimen de flujo laminar impulsado por la difusión en microfluídica es ventajoso, ya que admite experimentos paralelos en un solo dispositivo al mantener gradientes de fluido precisos.
La fotolitografía sigue siendo el método principal para la fabricación de dispositivos microfluídicos 6,7,8. En resumen, este proceso implica la creación de una plantilla grabada "maestra" del diseño microfluídico (Figura 1). Se prepara un sustrato fotosensible y una fotomáscara de diseño microfluídico expone selectivamente las áreas de fotorresistencia a la radiación ultravioleta. Los métodos de grabado posteriores desarrollan el sustrato, produciendo un relieve del diseño. El polidimetilsiloxano (PDMS) a menudo se moldea y se cura en el maestro. El PDMS curado, que adopta las características negativas del diseño, se retira del maestro y se adhiere a un cubreobjetos de vidrio. Todo este proceso de fabricación suele tardar entre 1 y 2 días, lo que permite iteraciones rápidas de diseño y la producción de múltiples dispositivos. Revisiones detalladas de los procesos de litografía blanda y microfabricación están disponibles en otras referencias 1,2,3,10,11,12,13.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68185/68185fig01.jpg"> 
Figura 1: Descripciones generales del proceso tradicional de fotolitografía y el proceso de microfabricación. (A) Proceso de fotolitografía tradicional y (B) Proceso de microfabricación. Dependiendo de la aplicación y de las características deseadas de la fotorresistencia, se puede utilizar una fotorresistencia negativa o positiva, aunque produzcan el mismo maestro de diseño. Características como la altura de la característica deseada o la temperatura de fusión de la fotorresistencia ayudan a determinar el tipo de fotorresistencia adecuado. Esta cifra ha sido modificada con permiso de Rogers (2022)14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68185/68185fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
El uso de la microfluídica ha ampliado las posibilidades en muchos campos de investigación, y su impacto más reciente se ha producido en las ciencias biológicas. Dada su pequeña escala, la microfluídica permite la gestión precisa de recursos limitados y valiosos, como células o proteínas. Aún más impactante es la capacidad de ajuste de los sistemas microfluídicos para imitar condiciones fisiológicas, como modificaciones en la rigidez del sustrato, el ejercicio de fuerza sobre una muestra e incluso la integración de corriente eléctrica. Además, el uso de la microfluídica ofrece la capacidad de manipular múltiples reactivos en paralelo y de crear rápidamente prototipos y refinar iterativamente los diseños de los sistemas. Estas características permiten la miniaturización de flujos de trabajo de laboratorio completos en un solo dispositivo, comúnmente conocido como "laboratorio en un chip"1,6,9,15,16,17,18,19.
Una de las aplicaciones celulares y biológicas de la microfluídica es la investigación de polímeros de microtúbulos. Los microtúbulos son un componente esencial del citoesqueleto de la célula, desempeñando un papel vital en procesos como la división celular y el transporte de carga intracelular20,21. Como el elemento más rígido del citoesqueleto, los microtúbulos exhiben un módulo elástico comparable al del plexiglás22,23. Sus robustas propiedades mecánicas son cruciales para diversas funciones celulares, incluyendo, por ejemplo, la contracción de los cardiomiocitos, donde se doblan y relajan cíclicamente durante las fases sistólica y diastólicadel corazón 24. Los dispositivos microfluídicos se han adoptado previamente para investigar las propiedades de los microtúbulos y sus estructuras de orden superior in vitro. De hecho, la microfluídica se ha utilizado para investigar la dinámica de polimerización de los microtúbulos, las interacciones entre microtúbulos y los efectos de las proteínas asociadas a los microtúbulos en las propiedades mecánicas de los microtúbulos 25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35 ,36,37,38,39,40,41.
Si bien la introducción de la microfluídica en el campo de los microtúbulos ha dado lugar a muchos descubrimientos interesantes, aún hay margen de mejora en la adaptación de estos dispositivos para la investigación de los microtúbulos. En este trabajo, abordamos dos limitaciones específicas que persisten en el estudio de los microtúbulos en dispositivos microfluídicos: el potencial de formación de burbujas de aire dentro del dispositivo, típicamente introducido por la manipulación manual de dispositivos microfluídicos, y la infrautilización de ensayos de alto rendimiento. En primer lugar, las manipulaciones manuales, como taponar y desenchufar los tubos, pueden introducir la formación de burbujas en los canales. La formación de burbujas de aire dentro de una celda de flujo es catastrófica, ya que las burbujas de aire pueden desnaturalizar proteínas, cortar polímeros de microtúbulos y afectar negativamente a los cultivos celulares42,43. Además, las esquinas afiladas y los ángulos oblicuos del dispositivo dan como resultado una humectación superficial no uniforme, lo que aumenta la posibilidad de arrastre de aire. Se han desarrollado numerosas técnicas para reducir la formación, la persistencia y el impacto de las burbujas de aire; Sin embargo, el uso de métodos de mitigación de burbujas no es universal 42,43,44,45,46. Además, aunque una de las principales ventajas del uso de la microfluídica es la capacidad de experimentación de alto rendimiento, la microfluídica aún no se ha utilizado para ampliar la investigación de los microtúbulos. Los dispositivos microfluídicos pueden diseñarse para probar múltiples condiciones experimentales en paralelo en el mismo dispositivo. Por ejemplo, los gradientes de fluidos se pueden utilizar para dirigir el flujo de diferentes proteínas o fármacos asociados a los microtúbulos, lo que permite su administración dirigida a regiones específicas de microtúbulos particionados dentro del mismo dispositivo.
Aquí, diseñamos iterativamente un dispositivo microfluídico que aborda estas limitaciones. Proporcionamos el protocolo paso a paso de la fabricación del dispositivo, lo que permite que un público más amplio emplee la tecnología microfluídica en su investigación sobre microtúbulos. Este diseño de dispositivo incorpora funciones de captura de burbujas y utiliza un sistema de control de flujo automatizado para reducir la intervención manual, al tiempo que permite gradientes de soluciones en el dispositivo para análisis de alto rendimiento. En resumen, el desarrollo de este diseño microfluídico puede facilitar una investigación y una comprensión más amplias de la mecánica de los microtúbulos, al tiempo que ofrece valiosas mejoras a los diseños experimentales en el campo más amplio de la investigación de los microtúbulos.

<table><tbody><tr><td>Tubos de microcentrífuga de 0,6 ml (transparentes)</td><td>Cualquier marca</td><td></td><td>Se prefiere el tipo de baja retención</td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga de 1,5 ml (transparentes)</td><td>Cualquier marca</td><td></td><td>Se prefiere el tipo de baja retención</td></tr><tr><td>Punzón de biopsia estándar de 1,5 mm</td><td>Integra LifeSciences</td><td>33-31A-P/25</td><td></td></tr><tr><td>100x/1,49 apertura numérica Objetivo TIRF</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>22 x 22 mm vidrio cubreobjetos</td><td>ThorLabs</td><td>CG15CH</td><td></td></tr><tr><td>Obleas de silicio pulido de un solo lado Oblea</td><td>universitaria</td><td>447</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri de 4"</td><td>Cualquier marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>450 &micro; L, tubo ultra claro de pared delgada abierta</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>345843</td><td>Denominado "tubo de fuga de aire" en el protocolo</td></tr><tr><td>láseres de estado sólido de 488, 561 y 640 nm</td><td>Nikon</td> A-95 Rotor de ángulo fijo Beckman <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Coulter, Inc.</td><td></td><td></td>347595</tr><tr><td>Acetona</td><td>Cualquier marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Airfuge Air-Driven Ultracentrifuge</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>347854</td><td>Denominado 'airfuge' en el protocolo</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Microscale Protein Labeling Kit Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>A30006</td><td></td></tr><tr><td>Papel de aluminio</td><td>Cualquier marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Andor iXon Ultra EM-CCD</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Andor NEO sCMOS</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AutoCAD Autodesk</td><td></td><td></td><td>Versiones genéricas se puede usar</td></tr><tr><td>Cerebro bovino tubulina sin etiquetar (purificada)</td><td>N/A</td><td></td><td>Hecho en casa, pero se puede comprar</td></tr><tr><td>Caseína</td><td>MilliporeSigma</td><td>C7078</td><td></td></tr><tr><td>Catalase</td><td>MilliporeSigma</td><td>C9322</td><td></td></tr><tr><td>Aire limpio y seco (CDA) (gas presurizado)</td><td>Cualquier marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Suministro de aire comprimido</td><td>Cualquier marca</td><td></td><td>Se conecta a la microfluídica controlador de flujo</td></tr><tr><td>COMSOL Software multifísico</td><td>COMSOL, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adaptador de platina de latón personalizado</td><td>N/A</td><td></td><td>Hecho en casa para encajar nuestros cubreobjetos de 22 mm x 22 mm en el microscopio</td></tr><tr><td>Agua desionizada</td><td>Cualquier marca</td> Desecador Cualquier marca <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-glucosa</td><td>MilliporeSigma</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>MilliporeSigma</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Software MilliporeSigma</td><td>324626</td><td></td></tr><tr><td>Elveflow Smart Interface (ESI)</td> Accesorios PFA sin brida <td>Elveflow</td><td></td><td></td></tr><tr><td>con ETFE &frac14; "-28 a 1/16" Punteras de diámetro exterior&nbsp;</td><td>Darwin Microfluidics</td><td>CIL-XP-245X</td><td>Se utiliza para conectar el tubo de los viales fuente micrewtube al sensor de flujo a través de la rejilla del depósito presurizado</td></tr><tr><td>Fluiwell 4-Channel 2 mL Low Pressure</td><td>Fluigent</td><td>14002001</td><td>Se utiliza para conectar el sistema de control de flujo a los micrewtubes. También se denomina 'bastidor de depósito presurizado'Campana</td></tr> extractora <tr><td></td><td>Cualquier marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glucosa oxidasa</td><td>MilliporeSigma</td><td>G6125</td><td></td></tr><tr><td>GMPCPP</td><td>Jena Bioscience</td><td>NU-405L</td><td></td></tr><tr><td>Guanosina trifosfato (GTP)</td><td>MilliporeSigma</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>Placa calefactora</td><td>Cualquier marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HS-625 de alta velocidad rueda de filtros de emisión</td><td>Finger Lakes Instrumentación</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software ImageJ N</td><td>/A</td><td></td><td>Acceso abierto</td></tr><tr><td>Incubadora</td><td>Cualquier marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alcohol isopropílico</td><td>Cualquier marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Karl Suss MA-6 alineador de mascarilla</td><td>SUSS MicroTec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio</td><td>MilliporeSigma</td><td>1.05833</td><td></td></tr><tr><td>Software de MATLAB</td><td>MathWorks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MEGAPOSIT SPR 220 7.0 fotorresistente</td><td>Dow, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit de adaptadores de accesorios microfluídicos de 6-40 a 1/4"-28</td><td>Darwin Microfluidics</td><td>LVF-KFI-08</td><td>Se utiliza para conectar el tubo de los viales fuente micrewtube al sensor de flujo a través de la rejilla del depósito presurizado (gradilla Fluiwell)</td></tr><tr><td>Accesorios microfluídicos Kit de adaptador Luer Lock hembra</td><td>Darwin Microfluidics</td><td>LVF-KFI-04</td><td>Se utiliza para conectar la jeringa al tubo Controlador</td></tr> <tr><td></td><td>de flujo microfluídicoElveflow</td><td>OB1 MK3+</td><td></td></tr><tr><td>Sensor de flujo microfluídico</td><td>Elveflow</td><td>MFS3</td><td>Este rango de sensor de flujo es de 0-80 &mu; L&nbsp;</td></tr><tr><td>Desarrollador de MICROPOSIT MF-319</td><td>Dow, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti</td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elements software</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nitrógeno (gas presurizado)</td><td>Cualquier marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calentador de objetivo</td><td>Tokai Hit</td><td></td><td></td></tr><tr><td>One-Piece Fingertight 10-32 Coned Fitting para tubería de 1/16" de diámetro exterior&nbsp;</td><td>Darwin Microfluidics</td><td>CIL-F-120X</td><td>Se utiliza para conectar la jeringa al tubo</td></tr><tr><td>Paclitaxol (Taxol)</td><td>Tocris Bioscience</td><td>1097</td><td></td></tr><tr><td>Máscaras de fotolitografía</td><td>N/A</td><td></td><td>Fabricado por una parte externa utilizando nuestros diseños</td></tr><tr><td>PIPES</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>172615000</td><td></td></tr><tr><td>Limpiador de plasma</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-32G</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de caudalímetro de plasma</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-FMG</td><td>Se integra con el limpiador de plasma para permitir el control del flujo de gas presurizado</td></tr><tr><td>Pipeta de bulbo de plástico</td><td>Cualquier marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pluoronic F-127</td><td>MilliporeSigma</td><td>P2443</td><td>Denominado 'poloxómero 407' en el protocolo</td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>Research Products International</td><td>P41000</td><td></td></tr><tr><td>Plásticos de alto rendimiento de Saint Gobain&nbsp; Tubo Tygon .020 ID</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50-206-8921</td><td>Referido como 'tubo de 1,5 mm' y 'tubing' en el protocolo</td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Any brand</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spin coater</td><td>Cost Effective Equipment, LLC.</td><td>200x</td><td>Este modelo puede ser descontinuado</td></tr><tr><td>Juegos de pipetas y puntas estándar</td><td>Cualquier marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jeringa de plástico estándar</td><td>Cualquier marca</td><td></td><td>Utilizamos una jeringa Luer-slip de 10 mL</td></tr><tr><td>Kit de elastómero de silicona Sylgard 184</td><td>Dow, Inc.</td><td></td><td>Denominado 'PDMS' y 'agente de curado' en el protocolo</td></tr><tr><td>T339 Micrewtube con sello de labio y tapón de rosca plano</td><td>Medline Industried, LP.</td><td>T339</td><td>Denominado "vial fuente" en el protocolo. Utilizamos tamaños de 0,5 ml y 1,5 ml</td></tr><tr><td>TAMRA, SE; 5-(y 6)-carboxitetrametilrodamina, Succinimidyl Ester</td><td>Invitrogen</td><td>C1171</td><td>Denominado 'TTR' en el protocolo</td></tr><tr><td>Tricloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctilo) silano</td><td>MilliporeSigma</td><td>448931</td><td></td></tr><tr><td>Trion Phantom RIE ICP&nbsp;</td><td>Tecnología Trion, Inc.</td><td></td><td>Este limpiador de plasma solo se usa en el Paso 1.1 del protocolo. En su lugar, se puede usar otro limpiador de plasma, como el que se usa para la unión PDMS; simplemente preferimos el vacío mucho más bajo que se puede lograr con este sistema para limpiar la oblea de silicio</td></tr><tr><td>TRITC Anticuerpo policlonal</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A6397</td><td>Denominado 'anticuerpo anti-rodamina' en el protocolo</td></tr><tr><td>Pinzas</td><td>Cualquier marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bomba de vacío</td><td>Cualquier marca</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

desarrollo de un enfoque basado en la microfluídica para investigar la mecánica de los polímeros de microtúbulos

Development of a Microfluidics-Based Approach for Investigating Microtubule Polymer Mechanics

Desarrollo de un enfoque basado en la microfluídica para investigar la mecánica de los polímeros de microtúbulos

In this protocol, we describe the design and fabrication of a microfluidic device developed for the investigation of microtubule polymer mechanics. The ...

development-microfluidics-based-approach-for-investigating

Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Se presenta un procedimiento para la formación de un poli (etilenglicol) auto-ensambladas monocapa (PEG-SAM) en un substrato de silicio con microelectrodos de oro. El PEG-SAM se forma en un solo paso y evita la contaminación biológica en las superficies de silicio y oro. Electroforesis se utiliza para modelar biomoléculas a la nanoescala.

Antifouling monocapas auto-ensambladas de microelectrodos de Biomoléculas Patrones

Un método para medir la longitud de persistencia o rigidez a la flexión de los biopolímeros se describe. El método utiliza una quinesina impulsado por microtúbulos ensayo de deslizamiento para determinar experimentalmente la longitud de persistencia de los microtúbulos individuales y es adaptable a actina ensayos basados ​​en deslizamiento.

Medidas de flexión rigidez de biopolímeros utilizando ensayos de Vuelo a Vela

Los microtúbulos son polímeros inherentemente inestables, y su conmutación entre el crecimiento y acortamiento es estocástico y difícil de controlar. Aquí se describen los protocolos que utilizan microtúbulos segmentados con tapones estabilizadores fotoescindible. La despolimerización de los microtúbulos segmentados puede ser activado con una alta resolución temporal y espacial, ayudando de este modo el análisis de los movimientos con los extremos de los microtúbulos desmontaje.

Preparación de segmentados microtúbulos para estudiar las mociones impulsadas por las que desmontan microtúbulos Ends

Levadura en ciernes es un modelo ventajoso para el estudio de la dinámica de microtúbulos in vivo debido a sus potentes genética y la simplicidad de su citoesqueleto de microtúbulos. El siguiente protocolo describe cómo transformar células de levadura y la cultura, adquirir imágenes de microscopía confocal, y analizar cuantitativamente la dinámica de microtúbulos en las células vivas de levadura.

Imágenes de alta resolución y análisis de la dinámica de microtúbulos astrales individuales de levadura en ciernes

Aquí presentamos un método robusto y detallado de análisis de dinámica de microtúbulos en células sincronizadas en prometiafase utilizando microscopía confocal de disco giratorio de células vivas y procesamiento de imágenes basado en MATLAB.

Medición de microtúbulos dinámicos mediante microscopía de disco giratorio en husillos mitoticos Monopolar

Aquí, se presenta un ensayo de reconstitución in vitro basado en microscopía TIRF para cuantificar y comparar simultáneamente la dinámica de dos poblaciones de microtúbulos. Se describe un método para ver simultáneamente la actividad colectiva de múltiples proteínas asociadas a microtúbulos en haces de microtúbulos reticulados y microtúbulos individuales.

Visualización simultánea de la dinámica de microtúbulos reticulados y únicos in vitro mediante microscopía TIRF

Presentamos un protocolo para implementar la microscopía de interferencia-reflexión y la microscopía de reflexión-fluorescencia interna-total para la obtención simultánea de imágenes de microtúbulos dinámicos y proteínas asociadas a microtúbulos marcadas fluorescentemente.

Reflexión de interferencia simultánea y microscopía de fluorescencia de reflexión interna total para imágenes de microtúbulos dinámicos y proteínas asociadas

Aquí, presentamos un protocolo para reconstituir haces de microtúbulos in vitro y cuantificar directamente las fuerzas ejercidas dentro de ellos utilizando trampeo óptico simultáneo y microscopía de fluorescencia de reflexión interna total. Este ensayo permite la medición a nivel nanométrico de las fuerzas y desplazamientos generados por los conjuntos de proteínas dentro de las redes de microtúbulos activos.

Medición directa de las fuerzas dentro de haces de microtúbulos activos reconstituidos

Presentamos protocolos para ensayos microfluídicos de filamentos de actina simples, en combinación con microscopía de fluorescencia, que permiten monitorear con precisión filamentos de actina individuales en tiempo real mientras se exponen secuencialmente a diferentes soluciones de proteínas.

Uso de microfluídica y microscopía de fluorescencia para estudiar la dinámica de ensamblaje de filamentos y haces de actina única

Este artículo presenta un protocolo para la formación de conjuntos de microtúbulos en forma de tactoides utilizando MAP65, un reticulante de microtúbulos a base de plantas, y PEG como agente de apiñamiento.

Autoensamblaje de tactoides de microtúbulos

Este protocolo es una guía para visualizar actina dinámica y microtúbulos utilizando un ensayo de microscopía de fluorescencia interna total (TIRF) in vitro .

Visualización de la dinámica de acoplamiento de actina y microtúbulos in vitro mediante microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF)

Aprenda a desarrollar un dispositivo microfluídico para estudiar la mecánica de microtúbulos in vitro mediante fabricación de silicio y modelado computacional. Este método mejora el análisis de alta producción y reduce la formación de burbujas de aire.

Desarrollo de un enfoque basado en la microfluídica para investigar la mecánica de los polímeros de microtúbulos

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