Desarrollo de un enfoque basado en la microfluídica para investigar la mecánica de los polímeros de microtúbulos

Los microtúbulos son polímeros citoesqueléticos que desempeñan funciones esenciales en la división celular y el transporte intracelular. En este estudio, adoptamos la microfluídica para estudiar la mecánica de los microtúbulos in vitro. Este trabajo aborda dos limitaciones específicas para el estudio de microtúbulos en dispositivos microfluídicos, el potencial de burbujas de aire, que pueden desnaturalizar las proteínas y la falta de uso de ensayos de alto rendimiento. Nuestro dispositivo y protocolo microfluídico permiten una variedad de configuraciones experimentales con capacidades de prueba de alto rendimiento más sólidas que nuestros ensayos de celda de flujo anteriores.

[Instructor] Para comenzar, limpie con plasma una oblea de silicio de tres pulgadas al vacío durante cinco minutos con oxígeno o plasma de aire seco limpio. Asegúrese de que la presión de vacío esté por debajo de cinco veces diez a la potencia de menos cinco torr. Centre la oblea de silicio limpia en el codificador de centrifugado para la deposición de fotorresistencia y deposite uno o dos mililitros de fotorresistencia SPR 227.0 en el centro de la oblea de silicio. Aplique una capa de centrifugado de la fotorresistencia para lograr una capa de 13 micrómetros de espesor a 1000 revoluciones por minuto durante 30 segundos. Mientras minimiza el contacto con la superficie recubierta, transfiera la oblea de silicio a una placa caliente a 70 grados Celsius. Incube la oblea de silicio en la placa calefactora, aumentando la temperatura en 10 grados centígrados cada tres a cinco minutos hasta que la temperatura alcance los 115 grados centígrados. Luego apague la placa caliente y deje que la oblea de silicio se enfríe hasta que su temperatura sea inferior a 65 grados centígrados. Con unas pinzas, transfiera la oblea enfriada al alineador de la máscara. Cargue tanto la oblea de silicio como la máscara fotográfica adecuada en el alineador de acuerdo con los protocolos específicos del fabricante o del sitio, ahora exponga la oblea a la radiación ultravioleta con una energía de aproximadamente 400 milijulios por centímetro cuadrado. Calcule el tiempo de exposición requerido utilizando la fórmula. Después de la rehidratación y el tratamiento térmico, sumerja la oblea en el revelador adecuado. Luego enjuague suavemente ambos lados de la oblea con agua desionizada durante 30 segundos. Después de secar la oblea desarrollada con gas nitrógeno, transfiérala a un desecador. Coloque un recipiente pequeño de aluminio en el desecador y agregue una gota de silano en el recipiente de aluminio. Después de la desecación, vierta el polidimetilsiloxano mezclado y desgasificado en el molde maestro dentro de una placa de Petri. Incube el plato a 65 grados centígrados durante la noche para permitir que el PDMS se cure por completo. Alrededor de las características del dispositivo, use un bisturí o una hoja de afeitar para cortar piezas rectangulares de PDMS de la capa maestra. Asegúrese de que cada pieza incluya un espacio de flanqueo adecuado para permitir un contacto de unión adecuado y se ajuste a un cubreobjetos de vidrio de 22 por 22 milímetros. Coloque el PDMS en una capa de PDMS de sacrificio de repuesto, evitando superficies duras. Luego, con una perforadora limpia de 1,5 milímetros, haga orificios de entrada y salida en cada pieza de PDMS. Ahora recupere un cubreobjetos de vidrio de 22 por 22 milímetros y límpielo con una toallita unida con alcohol isopropílico. Luego, limpie con plasma el deslizador de la cubierta de vidrio al vacío durante cinco minutos con plasma de aire limpio y seco. Limpie tanto el cubreobjetos de vidrio como el lado característico del PDMS con toallitas húmedas con alcohol isopropílico antes de colocarlas en el limpiador de plasma y límpielas simultáneamente con plasma durante 30 segundos al vacío con plasma de aire limpio y seco. Después de la limpieza, invierta el PDMS para que su lado característico quede hacia abajo. Coloque el PDMS en el cubreobjetos de vidrio y presione ligeramente para estimular la adhesión. Las extensiones de microtúbulos estabilizados se doblaron mediante el flujo de una solución tampón perpendicular a su dirección de crecimiento, lo que demuestra la capacidad de aplicar fuerza direccional dentro del dispositivo. La velocidad del flujo cercano a la superficie experimentada por los microtúbulos se calculó como 92 micrómetros por segundo utilizando simulación y modelado analítico basado en la ecuación de Navier-Stokes. Las simulaciones computacionales demostraron el establecimiento de gradientes estables a través del dispositivo confirmados experimentalmente por un tinte fluorescente que muestra patrones de concentración predecibles. Las extensiones de microtúbulos marcadas dualmente, confirmaron la partición basada en gradientes con diferentes proteínas fluorescentes que dominan en distintas zonas espaciales a lo largo del dispositivo.