La Red de Evaluación Preclínica del Ictus Modelo Multilaboratorio del Ictus Tromboembólico con Trombolisis: TE-MCAo

El alcance de nuestra investigación es desarrollar un modelo de ictus tromboembólico con trombolisis controlada para su uso en rigurosos ensayos terapéuticos preclínicos multilaboratorio. Nuestro protocolo aborda la ausencia de un modelo simple y reproducible de ictus tromboembólico que imite la trombólisis clínica y apoye ensayos preclínicos multicéntricos. Para empezar, un tubo PE-50 romo cortando el extremo en ángulo biselado.

Recorta la punta del bisel con microtijeras. Después de preparar a la rata anestesiada para la cirugía, realiza una incisión vertical en la parte interna del muslo, de aproximadamente 1,5 a dos centímetros de largo a lo largo del pliegue natural de la intersección inguinal con la pierna. La incisión debe ser ortogonal al curso anatómico esperado de la arteria femoral.

Con disección roma, disecciona cuidadosamente hasta los vasos femorales. Luego separa la arteria femoral de la vena y el nervio que discurren en el mismo hace. Esqueletose la arteria femoral lo más proximal posible, rastreando la arteria hasta su origen retroperitoneal.

Coloca de forma suelta un lazo de seda 5-0 alrededor de la arteria femoral y utiliza las colas para proporcionar una tensión suave en el extremo proximal de la arteria. Luego ocluye distalmente la arteria femoral con una ligadura de seda 5-0 y utiliza las colas de la sutura para proporcionar una ligera tensión distalmente con pinzas hemostáticas. A unos dos tercios de la distancia desde el lazo de sutura proximal, coloca un trozo de sutura de seda bajo la arteria y haz una pequeña arteriotomía distal a la sutura suelta usando microtijeras.

Con pinzas afiladas, levanta la abertura superior de la arteriotomía e introduce el catéter PE-50 biselado y romo en la abertura. Avanzar el catéter proximalmente lo máximo posible, de modo que el lazo flojo, al tensarse, cubra el catéter. Aprieta la sutura suavemente, asegurándote de que no ocluya el catéter ni se asiente sobre el bisel.

Suelta la abrazadera de goma. El catéter debe llenarse inmediatamente de sangre. Llena tres tubos de centrífuga de 1,5 mililitros y guárdalos a cuatro grados Celsius.

Una vez rellenados los tubos, retirar el catéter PE-50 de la arteria femoral, ligar el extremo proximal y cerrar la incisión con suturas interrumpidas de Prolene 5-0. Para preparar el trombo, transfiere 500 microlitros de sangre recién extraída o almacenada de donante a un tubo microcentrífuga de 1,5 mililitros y añade un mililitro de cloruro de calcio para la reversión de la anticoagulación. Luego aspira inmediatamente la sangre del tubo de la microcentrífuga a un tubo PE-50 de 100 centímetros, usando una succión suave, e incuba el tubo enrollado en PBS precalentado a 37 grados Celsius durante dos horas en un horno de mesa.

Tras expulsar el trombo en una placa de Petri que contiene PBS, córtalo en secciones de aproximadamente seis centímetros usando una cuchilla de afeitar. Extrae cada trombo suavemente en un catéter PE-50 y expulsa completamente cinco veces para lavarlo. Lava el trombo de nuevo introduciéndolo suavemente en un catéter PE-10 y expulsándolo completamente 15 veces.

Añadir 200 microlitros de azul de Evans al 4% en una placa de Petri que contenga 10 mililitros de PBS para crear la dilución número 1. Luego pipeteo 400 microlitros de dilución número 1 en una placa de Petri separada que contenga 20 mililitros de PBS para crear la dilución número 2. Coloca el coágulo en la solución más concentrada de la placa de Petri azul de Evans durante un segundo, luego transfiere a la placa de Petri azul de Evans diluida.

Carga un trombo lavado en microcatéteres prefabricados sin émbolos de aire, usando el método húmedo a húmedo. Una vez que el trombo está completamente cargado, extruye suficiente trombo para que queden exactamente cinco centímetros en el microcatéter. Recorta el exceso con una cuchilla de afeitar.

Marca el microcatéter a 16 milímetros de la punta para delimitar la extensión del catéter que debe avanzar intraluminalmente. Los tromboembolos precargados se inyectaron en la arteria carótida interna de 135 sujetos distribuidos en seis laboratorios de investigación para comprobar la viabilidad del modelo de oclusión de la arteria cerebral media tromboembólica. Se realizó una resonancia magnética tras tres días en 102 animales, lo que indica una tasa de completación del escaneo del 75%.

La pérdida de animales antes de la imagen fue consistente en los seis laboratorios. El volumen medio de lesiones en todos los sitios fue del 13% del hemisferio ipsilateral, con cierta variación entre los seis laboratorios. Nuestro protocolo imita el trombo y la trombolisis humanos, reduce el uso de animales, estandariza la cirugía y logra una reproducibilidad multicéntrica fiable.

Como resultado importante de nuestra investigación, creamos un modelo escalable y reproducible TE-MCAo que es utilizable en múltiples laboratorios con resultados consistentes y un control de calidad estructurado. Este modelo puede utilizarse de forma constante tanto en estudios de ictus en un solo laboratorio como en varios laboratorios, mejorando el cribado terapéutico y acelerando la traducción de tratamientos candidatos a protección cerebral.