Le test ELISA

L'ELISA, ou dosage d'immunoadsorption par enzyme lié (de enzyme-linked immunosorbent assay), est une méthode largement utilisée pour la détermination de la présence ou absence d'une protéine cible spécifique.

Via une série d'étapes de lavages et d'attaches, un anticorps conjugué ou lié à un enzyme va reconnaitre une protéine cible au fond d'une plaque à 96 puits. Lorsque du substrat est ajouté à l'échantillon, une réaction enzymatique va avoir lieu, causant un changement de couleur qui permet l'identification et la quantification de la protéine cible.

Avant que nous discutions de comment réaliser une ELISA, familiarisons-nous avec l'équipement et les réactifs dont nous aurons besoin.

Le matériel pour une réaction ELISA est typiquement une plaque à 96 puits à fond plat. Les fonds plats des puits vont faciliter une distribution égale de votre échantillon expérimental, ainsi que l’accrochage et la détection des anticorps.

ELISA détecte la présence de protéines cibles spécifiques dans des solutions aqueuses expérimentales. L'urine, le milieu de culture cellulaire, et le sérum sont des échantillons expérimentaux communs.

Dans une ELISA, l'anticorps qui se lie directement à la protéine cible est l'anticorps primaire. Il a une haute affinité, ce qui veut dire, une haute capacité à se lier fermement, à un épitope – une zone spécifique – de la protéine cible. L'anticorps primaire est habituellement non-labellisé, ou non-conjugué.

Comme mentionné, les anticorps se lient généralement à leurs protéines cible par une liaison de haute affinité à un épitope spécifique. Cependant, l'échantillon expérimental peut contenir des morceaux de cellules qui expriment des sites de liaison non-spécifiques, sites qui peuvent se lier au non-épitope spécifique, qui est une zone des anticorps détecteurs.

Donc, l'ajout d'un tampon de blocage est essentiel dans la procédure ELISA pour recouvrir tout site de liaison non-spécifique dans votre échantillon expérimental. Sinon vous pourrez avoir des réactions enzymatiques apparaissant dans les puits qui ne contiennent pas de protéine cible, vous donnant une donnée faussement positive!

L'anticorps secondaire dans une ELISA est l'anticorps utilisé pour reconnaitre l'anticorps primaire. Cet anticorps est habituellement conjugué à un enzyme. Parfois l'anticorps secondaire a un nom cool. Par exemple, si l'anticorps secondaire est fait, ou élevé, dans un âne pour reconnaitre un anticorps primaire élevé dans une chèvre, l'anticorps secondaire serait appelé un anticorps âne anti-chèvre. Lorsqu'il s'agit de nommer les anticorps secondaires, le premier nom indique l'organisme qui a produit l'anticorps secondaire, et le second nom représente l'organisme qui produit l'anticorps primaire.

Un substrat, qui se lie au site actif de l'enzyme lié à l'anticorps secondaire, sera aussi nécessaire. La réaction chimique qui apparait pendant cette réaction provoque un changement de couleur dans le substrat qui sans cela est incolore. Ce bien nommé test colorimétrique permet l'identification et la quantification de la présence de la protéine cible.

La réaction enzymatique va continuer tant qu'il y a du substrat. Donc, après une brève période d'incubation, une solution d'arrêt, qui provoque encore un autre changement de couleur pour indiquer que la réaction a en effet bien été arrêtée, est ajouté aux puits.

Un lecteur de microplaque sera utilisé pour quantifier la concentration de la protéine d'intérêt dans chaque puit par la lecture de l'absorbance, qui est la quantité de produit coloré, dans chaque puit. L'absorbance est proportionnelle à la quantité de protéine cible présente.

Maintenant que vous avez tout votre équipement prêt, réalisons une ELISA!

Pour réaliser une ELISA standard, ou directe, enduisez d'abord les puits de la plaque à 96 puits avec votre protéine d'intérêt cible diluée dans un tampon d'enrobage. Mettez également dans la paque vos contrôles positif et négatif maintenant.

Après l'incubation de la plaque enduite pendant un temps assez long pour que la protéine puisse adsorber complétement, ou attacher, au fond de la plaque, jetez l'excès de solution d'enrobage avec un mouvement brusque du poignet.

Ensuite bloquez toute liaison non-spécifique possible ou signal de fond en incubant chaque puit dans un tampon de blocage.

Maintenant jetez le tampon de blocage et lavez les puits avec une incubation rapide à température ambiante dans un tampon phosphate salin, ou PBS, et 1% de BSA.

Pendant que les puits sont rincés avec du PBS, préparez les dilutions à concentration connue de la protéine cible pour créer une courbe standard. L'absorbance des puits de la courbe standard, qui contient des concentrations connues de la protéine cible, sera utilisée pour calculer la concentration de la protéine cible dans vos puits d'échantillons expérimentaux sur base de la comparaison de l'absorbance des puits d'échantillon à l'absorbance des puits de la courbe standard.

Maintenant il est temps d'ajouter l'anticorps de détection ou anticorps primaire!

La plaque est ensuite incubée, généralement à température ambiante, pour permettre à un nombre suffisant d'anticorps de se lier à la protéine cible pour la détection et quantification en aval de la protéine.

Après l'incubation, l'anticorps en excès est retiré et les puits sont brièvement lavés avec du PBS.

L'anticorps secondaire est alors ajouté à la plaque, et la plaque est incubée encore une fois – typiquement sur une plateforme rotative – pour permettre à l'anticorps secondaire de se lier. Les étapes de lavage sont répétées comme précédemment.

Ensuite, ajoutez le substrat à la plaque pour voir quels puits contiennent la protéine cible. Couvrez la plaque pour protéger la réaction de la lumière, et après une incubation rapide, arrêtez la réaction avec une solution d'arrêt.

Finalement, placez la plaque dans le lecteur de microplaque pour mesurer l'absorbance ou la quantité de solution colorée, dans chaque puit. Vous devrez sélectionner quels puits vous voulez que le lecteur analyse. Lorsque l'instrument a fini de lire la plaque, une mesure de l'absorbance pour chaque puit s'affichera.

Il est important de noter que chaque kit d'ELISA a une limite de détection. C'est-à-dire que seulement les concentrations en protéine au-dessus et en-dessous des limites spécifiques peuvent être déterminées précisément. Des concentrations très faible en protéine sont généralement trop proche du niveau de coloration non spécifique de fond, tandis que des concentrations très élevées peuvent indiquer que l'excès de protéines ou d'anticorps n'a pas été lavé correctement dans cet échantillon de puits.

Alors, pourquoi devriez-vous réaliser une ELISA? Regardons quelques utilisations communes.

Le type d'ELISA probablement le plus commun est l'ELISA en sandwich.

Dans une ELISA en sandwich, une plaque à 96 puits est d'abord enduite avec un anticorps primaire qui reconnait la protéine d'intérêt cible.

Après le lavage des échantillons en excès par PBS, un anticorps secondaire lié à un enzyme est ajouté, suivi par un substrat colorimétrique.

L'absorbance est alors mesurée de la même manière que pour une ELISA typique. Par exemple, dans cette expérimentation, les données de l'ELISA seront utilisées pour déterminer quelles lignées de cellules produisent l'anticorps humain avec la plus haute affinité pour - qui a la plus grande capacité à se lier précisément à – son antigène cible.

Le test de grossesse en vente libre est un type d'ELISA en sandwich.

Lorsque l'urine de la femme potentiellement enceinte est ajoutée au test, les anticorps primaires à enzyme lié attachés au test vont se lier à l'hormone de grossesse hCG si elle est en présence. Si la femme est enceinte, une réaction enzyme-substrat aura lieu lorsque les anticorps primaires seront reconnus au site de test par les anticorps secondaires liés au substrat, et une ligne colorée va apparaitre.

Un autre type d'ELISA est l'ELISA par compétition, qui peut être utilisé pour détecter la présence d'anticorps.

Si les anticorps d'intérêt sont présents dans l'échantillon, ils vont se lier à la protéine cible attachée au fond de la plaque. Après, lorsque les anticorps détecteurs à enzyme liés sont ajoutés à la plaque, ils vont trouver peu à aucunes protéines pour se lier; ils sont mis “hors compétition” par les anticorps d'intérêt dans l'échantillon expérimental.

Dans une ELISA par compétition, de ce fait, les puits colorés indiquent les échantillons qui ne contiennent pas l'anticorps d'intérêt. Les échantillons de plasma de patients sont typiquement analysés par ELISA par compétition en vue de déterminer si les anticorps pour certains pathogènes, comme le virus VIH, sont présents dans l'échantillon.

Vous venez de visionner l'introduction de JoVE à la réalisation d'une ELISA. Dans cette vidéo nous avons vu: ce qu'est une ELISA et comment elle fonctionne; quels équipement et réactifs vous avez besoin pour réaliser une ELISA; et quelques utilisations différentes de cette analyse. Merci de nous avoir regardé, et souvenez-vous de ne pas laisser votre substrat se surdévelopper!