Les plasmides sont des molécules d'ADN circulaires et extra-chromosomiques. En biologie moléculaire, ils agissent comme porteurs, ou vecteurs, pour un fragment d'ADN spécifique. Des bactéries sont utilisées pour répliquer les plasmides, de sorte que votre ADN d'intérêt soit produit en masse. Le procédé par lequel les chercheurs obtiennent les plasmides depuis les bactéries est appelé la purification de plasmide, qui sera expliquée dans cette vidéo.
De façon évidente, la purification de plasmide implique la purification des plasmides, mais qu'est-ce-que cela signifie exactement? Pour purifier des plasmides, ils doivent être isolés du chromosome bactérien, des protéines, de la membrane bactérienne et des ribosomes bactériens.
Bien que de nombreux kits différents existent pour purifier les plasmides, le principe de base derrière la purification de plasmide reste le même pour tous. Tout d'abord, la colonnie bactérienne sélectionnée est cultivée dans un milieu de culture approprié qui contient les antibiotiques necessaires. Grâce à un gène de résistance aux antibiotiques, codé par le plasmide, seules les bactéries contenant le plasmide vont croitre dans ce milieu. Les bactéries sont récoltées et lysées à un pH élevé. Le pH est neutralisé, du sel est ajouté, puis le mélange est centrifugé pour retirer les débris et l'ADN génomique.
Le lysat cellulaire neutralisé est ajouté dans une colonne de silice. Il est communément considéré que l'ADN plasmidique se lie à la colonne via un mécanisme appelé échange d'anions, où l'ADN, un anion fort, se lie avec la colonne chargée négativement, via un pont de sels de cations. Les autres substances du lysat, telles que les protéines, sont lavées à travers la colonne avec des tampons hautement salés. Finalement, le plasmide purifié est libéré de la colonne lorsqu'un tampon faiblement salé est ajouté, interrompant le pont de sels.
Pour cette procédure un tablier de laboratoire, des gants jetables et des lunettes de protection doivent être portés.
Les cultures bactériennes, qui sont transformées avec l'ADN plasmidique désiré, doivent être cultivées pendant la nuit dans un milieu de croissance avec l'antibiotique approprié dans un incubateur à agitation à 37 °C.
Le jour suivant, la culture de bactéries est granulée par centrifugation et le supernageant est retiré. Le pellet restant est remis en suspension dans un tampon de remise en suspension.
Une fois remises en suspension, les bactéries peuvent être transférées vers un tube plus petit où le tampon de lyse est ajouté. Le tampon de lyse a un pH élevé et contient des détergents, tel que le dodécylsulfate de sodium, qui perturbent les membranes bactériennes, permettant ainsi la lyse des bactéries. La solution devient trouble avec l'ajout du tampon de lyse et après mélange, la solution devient plus claire. La solution ne doit pas être mélangée en vortex à cause de la possibilité de cisaillement, ou cassure en morceaux, de l'ADN génomique, qui pourrait alors contaminer la purification de l'ADN plasmidique.
Ensuite, le tampon de neutralisation est ajouté, pour neutraliser les conditions alcalines et diminuer le pH. Avec une agitation douce, l'ADN génomique ainsi que n'importe quelles protéines liées à lui vont précipiter, pendant que l'ADN plasmidique restera en solution. Une fois encore évitez d'agiter en vortex, de manière à ce que vos plasmides soient libres de contamination par de l'ADN génomique.
Le mélange est ensuite centrifugé et le précipité ADN génomique/protéine est pelleté. Le supernageant contient l'ADN plasmidique ainsi que des protéines solubles.
Ce supernageant est placé dans la colonne par soutirage, un nom de fantaisie pour tirage, ou pipetage. Les pellets peuvent être jetés.
Ensuite, le tampon de lavage a haute teneur en sel passe à travers la colonne pendant que l'ADN reste lié à la silice. Les étapes de lavage répétées avec un tampon hautement salé retirent les endonucléases, l'ARN, les protéines, les colorants, et les impuretés de faible poids moléculaire. L'écoulement continu des étapes de lavage devrait être jeté. Après l'étape finale de lavage, vérifiez que le filtre est complètement sec sans aucun reste de tampon. L'ADN plasmidique est encore localisé sur le filtre.
L'ADN plasmidique est élué avec de l'eau stérile ou un tampon d'élution. L'ADN est rapidement disponible pour utilisation immédiate dans une large gamme d'applications.
Il y a plusieurs moyens de vérifier la pureté des plasmides après purification. Un spectromètre peut être utilisé pour comparer l'absorbance à différentes longueurs d'ondes pour déterminer la concentration en ADN plasmidique. Une analyse sur gel d'agarose de plasmide purifié peut déterminer si le plasmide est de taille conforme et s'il n'y a pas de contaminants. Cette étape assure qu'il n'y ait pas de contamination par l'ADN génomique et que le plasmide n'ait pas été modifié en bactérie.
La procédure de purification de plasmide peut être modifiée pour s'adapter à différentes tailles de plasmide, nombre de copies, volume de culture, et peut inclure différents équipements pour les étapes d'attache, de lavage et d'élution. Le rendement s'avère être une des plus importantes distinctions entre les préparations de plasmide, qui sont souvent divisés entre la minipréparation, ou miniprep, la midiprep, la maxiprep, et la megaprep en fonction du rendement désiré.
En terme d'utilisations en aval, la transfection est une procédure qui suit généralement la purification de plasmide. Elle implique l'introduction d'ADN plasmidique dans des cellules eucaryotes. Le but d'une expérience de transfection est souvent de visualiser la strucure des cellules et des tissus avec des protéines rapportrices, tels que ces étiquetages de neurones dans les images que vous voyez ici.
Parfois de multiple plasmides purifiés par plusieurs actions de purification peuvent être introduits dans la même bactérie, reproduisant ainsi une voie entière de biosynthèse via la production d'enzymes codés par les plasmides. Le résultat final est la fabrication d'un composé complexe, comme l'antibiotique que vous voyez ici, par la cellule.
Les plasmides purifiés peuvent être réintroduits dans les bactéries, en vue de générer une grande quantité de protéines codées par le plasmide. Ici vous voyez des cellules bactériennes être homogénéisées et lysées avant qu'une technique appellée purification par affinité puisse être réalisée pour isoler la protéine cible. La protéine purifiée est crystalisée et sa structure est ensuite identifiée.
Vous venez de regarder l'introduction de JoVE à la purification de plasmide. Dans cette vidéo nous avons parlé des principes de base derrière la méthode, sa description pas à pas et une poignée d'applications de votre préparation de plasmide. Comme toujours, merci pour votre attention!
La purification de plasmide est une technique utilisée pour isoler et purifier l'ADN plasmidique de l'ADN génomique, des protéines, des ribosomes, et…
Les plasmides sont des molécules d'ADN circulaires et extra-chromosomiques. En biologie moléculaire, ils agissent comme porteurs, ou vecteurs, pour un fragment d'ADN spécifique. Des bactéries sont utilisées pour répliquer les plasmides, de sorte que votre ADN d'intérêt soit produit en masse. Le procédé par lequel les chercheurs obtiennent les plasmides depuis les bactéries est appelé la purification de plasmide, qui sera expliquée dans cette vidéo.
De façon évidente, la purification de plasmide implique la purification des plasmides, mais qu'est-ce-que cela signifie exactement? Pour purifier des plasmides, ils doivent être isolés du chromosome bactérien, des protéines, de la membrane bactérienne et des ribosomes bactériens.
Bien que de nombreux kits différents existent pour purifier les plasmides, le principe de base derrière la purification de plasmide reste le même pour tous. Tout d'abord, la colonnie bactérienne sélectionnée est cultivée dans un milieu de culture approprié qui contient les antibiotiques necessaires. Grâce à un gène de résistance aux antibiotiques, codé par le plasmide, seules les bactéries contenant le plasmide vont croitre dans ce milieu. Les bactéries sont récoltées et lysées à un pH élevé. Le pH est neutralisé, du sel est ajouté, puis le mélange est centrifugé pour retirer les débris et l'ADN génomique.
Le lysat cellulaire neutralisé est ajouté dans une colonne de silice. Il est communément considéré que l'ADN plasmidique se lie à la colonne via un mécanisme appelé échange d'anions, où l'ADN, un anion fort, se lie avec la colonne chargée négativement, via un pont de sels de cations. Les autres substances du lysat, telles que les protéines, sont lavées à travers la colonne avec des tampons hautement salés. Finalement, le plasmide purifié est libéré de la colonne lorsqu'un tampon faiblement salé est ajouté, interrompant le pont de sels.
Pour cette procédure un tablier de laboratoire, des gants jetables et des lunettes de protection doivent être portés.
Les cultures bactériennes, qui sont transformées avec l'ADN plasmidique désiré, doivent être cultivées pendant la nuit dans un milieu de croissance avec l'antibiotique approprié dans un incubateur à agitation à 37 °C.
Le jour suivant, la culture de bactéries est granulée par centrifugation et le supernageant est retiré. Le pellet restant est remis en suspension dans un tampon de remise en suspension.
Une fois remises en suspension, les bactéries peuvent être transférées vers un tube plus petit où le tampon de lyse est ajouté. Le tampon de lyse a un pH élevé et contient des détergents, tel que le dodécylsulfate de sodium, qui perturbent les membranes bactériennes, permettant ainsi la lyse des bactéries. La solution devient trouble avec l'ajout du tampon de lyse et après mélange, la solution devient plus claire. La solution ne doit pas être mélangée en vortex à cause de la possibilité de cisaillement, ou cassure en morceaux, de l'ADN génomique, qui pourrait alors contaminer la purification de l'ADN plasmidique.
Ensuite, le tampon de neutralisation est ajouté, pour neutraliser les conditions alcalines et diminuer le pH. Avec une agitation douce, l'ADN génomique ainsi que n'importe quelles protéines liées à lui vont précipiter, pendant que l'ADN plasmidique restera en solution. Une fois encore évitez d'agiter en vortex, de manière à ce que vos plasmides soient libres de contamination par de l'ADN génomique.
Le mélange est ensuite centrifugé et le précipité ADN génomique/protéine est pelleté. Le supernageant contient l'ADN plasmidique ainsi que des protéines solubles.
Ce supernageant est placé dans la colonne par soutirage, un nom de fantaisie pour tirage, ou pipetage. Les pellets peuvent être jetés.
Ensuite, le tampon de lavage a haute teneur en sel passe à travers la colonne pendant que l'ADN reste lié à la silice. Les étapes de lavage répétées avec un tampon hautement salé retirent les endonucléases, l'ARN, les protéines, les colorants, et les impuretés de faible poids moléculaire. L'écoulement continu des étapes de lavage devrait être jeté. Après l'étape finale de lavage, vérifiez que le filtre est complètement sec sans aucun reste de tampon. L'ADN plasmidique est encore localisé sur le filtre.
L'ADN plasmidique est élué avec de l'eau stérile ou un tampon d'élution. L'ADN est rapidement disponible pour utilisation immédiate dans une large gamme d'applications.
Il y a plusieurs moyens de vérifier la pureté des plasmides après purification. Un spectromètre peut être utilisé pour comparer l'absorbance à différentes longueurs d'ondes pour déterminer la concentration en ADN plasmidique. Une analyse sur gel d'agarose de plasmide purifié peut déterminer si le plasmide est de taille conforme et s'il n'y a pas de contaminants. Cette étape assure qu'il n'y ait pas de contamination par l'ADN génomique et que le plasmide n'ait pas été modifié en bactérie.
La procédure de purification de plasmide peut être modifiée pour s'adapter à différentes tailles de plasmide, nombre de copies, volume de culture, et peut inclure différents équipements pour les étapes d'attache, de lavage et d'élution. Le rendement s'avère être une des plus importantes distinctions entre les préparations de plasmide, qui sont souvent divisés entre la minipréparation, ou miniprep, la midiprep, la maxiprep, et la megaprep en fonction du rendement désiré.
En terme d'utilisations en aval, la transfection est une procédure qui suit généralement la purification de plasmide. Elle implique l'introduction d'ADN plasmidique dans des cellules eucaryotes. Le but d'une expérience de transfection est souvent de visualiser la strucure des cellules et des tissus avec des protéines rapportrices, tels que ces étiquetages de neurones dans les images que vous voyez ici.
Parfois de multiple plasmides purifiés par plusieurs actions de purification peuvent être introduits dans la même bactérie, reproduisant ainsi une voie entière de biosynthèse via la production d'enzymes codés par les plasmides. Le résultat final est la fabrication d'un composé complexe, comme l'antibiotique que vous voyez ici, par la cellule.
Les plasmides purifiés peuvent être réintroduits dans les bactéries, en vue de générer une grande quantité de protéines codées par le plasmide. Ici vous voyez des cellules bactériennes être homogénéisées et lysées avant qu'une technique appellée purification par affinité puisse être réalisée pour isoler la protéine cible. La protéine purifiée est crystalisée et sa structure est ensuite identifiée.
Vous venez de regarder l'introduction de JoVE à la purification de plasmide. Dans cette vidéo nous avons parlé des principes de base derrière la méthode, sa description pas à pas et une poignée d'applications de votre préparation de plasmide. Comme toujours, merci pour votre attention!
Les plasmides sont des molécules d'ADN circulaires et extra-chromosomiques. En biologie moléculaire, ils agissent comme porteurs, ou vecteurs, pour un fragment d'ADN spécifique. Des bactéries sont utilisées pour répliquer les plasmides, de sorte que votre ADN d'intérêt soit produit en masse. Le procédé par lequel les chercheurs obtiennent les plasmides depuis les bactéries est appelé la purification de plasmide, qui sera expliquée dans cette vidéo.
De façon évidente, la purification de plasmide implique la purification des plasmides, mais qu'est-ce-que cela signifie exactement? Pour purifier des plasmides, ils doivent être isolés du chromosome bactérien, des protéines, de la membrane bactérienne et des ribosomes bactériens.
Bien que de nombreux kits différents existent pour purifier les plasmides, le principe de base derrière la purification de plasmide reste le même pour tous. Tout d'abord, la colonnie bactérienne sélectionnée est cultivée dans un milieu de culture approprié qui contient les antibiotiques necessaires. Grâce à un gène de résistance aux antibiotiques, codé par le plasmide, seules les bactéries contenant le plasmide vont croitre dans ce milieu. Les bactéries sont récoltées et lysées à un pH élevé. Le pH est neutralisé, du sel est ajouté, puis le mélange est centrifugé pour retirer les débris et l'ADN génomique.
Le lysat cellulaire neutralisé est ajouté dans une colonne de silice. Il est communément considéré que l'ADN plasmidique se lie à la colonne via un mécanisme appelé échange d'anions, où l'ADN, un anion fort, se lie avec la colonne chargée négativement, via un pont de sels de cations. Les autres substances du lysat, telles que les protéines, sont lavées à travers la colonne avec des tampons hautement salés. Finalement, le plasmide purifié est libéré de la colonne lorsqu'un tampon faiblement salé est ajouté, interrompant le pont de sels.
Pour cette procédure un tablier de laboratoire, des gants jetables et des lunettes de protection doivent être portés.
Les cultures bactériennes, qui sont transformées avec l'ADN plasmidique désiré, doivent être cultivées pendant la nuit dans un milieu de croissance avec l'antibiotique approprié dans un incubateur à agitation à 37 °C.
Le jour suivant, la culture de bactéries est granulée par centrifugation et le supernageant est retiré. Le pellet restant est remis en suspension dans un tampon de remise en suspension.
Une fois remises en suspension, les bactéries peuvent être transférées vers un tube plus petit où le tampon de lyse est ajouté. Le tampon de lyse a un pH élevé et contient des détergents, tel que le dodécylsulfate de sodium, qui perturbent les membranes bactériennes, permettant ainsi la lyse des bactéries. La solution devient trouble avec l'ajout du tampon de lyse et après mélange, la solution devient plus claire. La solution ne doit pas être mélangée en vortex à cause de la possibilité de cisaillement, ou cassure en morceaux, de l'ADN génomique, qui pourrait alors contaminer la purification de l'ADN plasmidique.
Ensuite, le tampon de neutralisation est ajouté, pour neutraliser les conditions alcalines et diminuer le pH. Avec une agitation douce, l'ADN génomique ainsi que n'importe quelles protéines liées à lui vont précipiter, pendant que l'ADN plasmidique restera en solution. Une fois encore évitez d'agiter en vortex, de manière à ce que vos plasmides soient libres de contamination par de l'ADN génomique.
Le mélange est ensuite centrifugé et le précipité ADN génomique/protéine est pelleté. Le supernageant contient l'ADN plasmidique ainsi que des protéines solubles.
Ce supernageant est placé dans la colonne par soutirage, un nom de fantaisie pour tirage, ou pipetage. Les pellets peuvent être jetés.
Ensuite, le tampon de lavage a haute teneur en sel passe à travers la colonne pendant que l'ADN reste lié à la silice. Les étapes de lavage répétées avec un tampon hautement salé retirent les endonucléases, l'ARN, les protéines, les colorants, et les impuretés de faible poids moléculaire. L'écoulement continu des étapes de lavage devrait être jeté. Après l'étape finale de lavage, vérifiez que le filtre est complètement sec sans aucun reste de tampon. L'ADN plasmidique est encore localisé sur le filtre.
L'ADN plasmidique est élué avec de l'eau stérile ou un tampon d'élution. L'ADN est rapidement disponible pour utilisation immédiate dans une large gamme d'applications.
Il y a plusieurs moyens de vérifier la pureté des plasmides après purification. Un spectromètre peut être utilisé pour comparer l'absorbance à différentes longueurs d'ondes pour déterminer la concentration en ADN plasmidique. Une analyse sur gel d'agarose de plasmide purifié peut déterminer si le plasmide est de taille conforme et s'il n'y a pas de contaminants. Cette étape assure qu'il n'y ait pas de contamination par l'ADN génomique et que le plasmide n'ait pas été modifié en bactérie.
La procédure de purification de plasmide peut être modifiée pour s'adapter à différentes tailles de plasmide, nombre de copies, volume de culture, et peut inclure différents équipements pour les étapes d'attache, de lavage et d'élution. Le rendement s'avère être une des plus importantes distinctions entre les préparations de plasmide, qui sont souvent divisés entre la minipréparation, ou miniprep, la midiprep, la maxiprep, et la megaprep en fonction du rendement désiré.
En terme d'utilisations en aval, la transfection est une procédure qui suit généralement la purification de plasmide. Elle implique l'introduction d'ADN plasmidique dans des cellules eucaryotes. Le but d'une expérience de transfection est souvent de visualiser la strucure des cellules et des tissus avec des protéines rapportrices, tels que ces étiquetages de neurones dans les images que vous voyez ici.
Parfois de multiple plasmides purifiés par plusieurs actions de purification peuvent être introduits dans la même bactérie, reproduisant ainsi une voie entière de biosynthèse via la production d'enzymes codés par les plasmides. Le résultat final est la fabrication d'un composé complexe, comme l'antibiotique que vous voyez ici, par la cellule.
Les plasmides purifiés peuvent être réintroduits dans les bactéries, en vue de générer une grande quantité de protéines codées par le plasmide. Ici vous voyez des cellules bactériennes être homogénéisées et lysées avant qu'une technique appellée purification par affinité puisse être réalisée pour isoler la protéine cible. La protéine purifiée est crystalisée et sa structure est ensuite identifiée.
Vous venez de regarder l'introduction de JoVE à la purification de plasmide. Dans cette vidéo nous avons parlé des principes de base derrière la méthode, sa description pas à pas et une poignée d'applications de votre préparation de plasmide. Comme toujours, merci pour votre attention!
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Q1: What is a plasmid and how is it used in molecular biology?
A plasmid is a small, circular, double-stranded DNA molecule that acts as a vector to carry specific DNA fragments. When introduced into bacteria through transformation, plasmids are replicated, creating numerous copies of the DNA of interest. This allows researchers to mass-produce desired genetic material for various molecular biology applications.
Q2: Why is bacterial culture grown with antibiotics during plasmid purification?
Antibiotics are added to the growth media to select for bacteria containing the plasmid. The plasmid encodes an antibiotic resistance gene, allowing only bacteria with the plasmid to survive in the antibiotic-containing media. This ensures that the bacterial culture used for purification contains the desired plasmid.
Q3: How does anion exchange help purify plasmid DNA on a silica column?
Plasmid DNA, a strong anion, binds to the negatively charged silica column through a cation salt bridge mechanism called anion exchange. Proteins and other contaminants are washed away with high salt buffers, while plasmid DNA remains bound. When low salt buffer is added, the salt bridge is disrupted, releasing purified plasmid DNA from the column.
Q4: Why should the lysate mixture not be vortexed during plasmid purification?
Vortexing can shear or break apart genomic DNA, which would then contaminate the plasmid DNA preparation. Instead, gentle mixing is used throughout the procedure to keep genomic DNA intact so it precipitates during neutralization and can be separated from the plasmid DNA in solution.
Q5: What methods verify the purity and quality of purified plasmid DNA?
A spectrophotometer measures absorbance at different wavelengths to determine plasmid DNA concentration and purity. Agarose gel electrophoresis concept procedure and applications can verify that the plasmid is the correct size and free from contaminants like genomic DNA. Together, these techniques confirm successful purification and that the plasmid was not modified during bacterial replication.
Q6: How do miniprep, midiprep, maxiprep, and megaprep differ?
These plasmid purification methods are distinguished by their yield and are selected based on the desired amount of plasmid DNA needed. Miniprep produces the smallest yield, while megaprep produces the largest. The choice depends on downstream applications and the volume of bacterial culture available for processing.
Q7: What happens to purified plasmids after they are isolated from bacteria?
Purified plasmids are used in various downstream applications. One common procedure is transfection inserting genetic materials into mammalian cells to visualize cellular structures with reporter proteins. Plasmids can also be reintroduced into bacteria to produce large amounts of encoded proteins, which are then isolated and analyzed for research and biotechnology purposes.
Chapters in this video
0:00
Overview
0:44
Principal Components of the Plasmid Purification Procedure
2:25
Plasmid Purification Procedure: Step by Step
5:53
Applications
7:51
Summary
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