What is explant culture and why is it used in neuroscience research?

Explant culture is a technique where neural tissue is carefully excised from an embryo and cultured in vitro to study development. This method allows researchers to manipulate and visualize developing tissues in ways impossible in living organisms. Explants maintain complex cellular architecture, enabling study of cell-cell interactions while providing accessibility to experimental tools and control over the chemical environment.

How are embryonic tissues prepared for explant culture?

Tissue preparation begins by sterilizing instruments with 70% ethanol and euthanizing a pregnant mouse. The uterus is surgically excised and placed in ice-cold buffer. Individual embryos are removed from their yolk sac under a dissection microscope, the brain is isolated, and the region of interest is carefully dissected and transferred to a culture dish containing culture medium.

What is slice culture and how does it differ from standard explant culture?

Slice culture involves sectioning neural tissue into thin sheets for improved visual access to developing cells. Before sectioning, tissue is embedded in 1.5% low melting point agarose for structural support. The agarose-embedded tissue is then glued to a specimen stage and sectioned using a vibratome, which uses a vibrating blade to cut thin slices of living tissue that are subsequently cultured.

What environmental conditions must be maintained for healthy explant tissue?

Explants are maintained in a 37°C incubator containing 5% CO2 for several weeks with 50% medium replacement every 2-3 days. Extracellular matrix proteins are often used to coat culture dishes since the ECM significantly impacts cell behavior. Some experiments require solutions resembling cerebrospinal fluid rather than traditional cell culture media to closely mimic the central nervous system environment.

How are cell migration assays performed using explanted neural tissue?

Cell migration assays use beads soaked in growth factors implanted into hindbrain explants to examine repulsive and attractive signals guiding neural cell movement. After 3-4 days of exposure, neurons are imaged using a confocal microscope. Results show whether neurons migrate toward or away from specific growth factors, revealing the chemical cues that direct neural cell migration during development.

What do co-culture assays reveal about neural development?

Co-culture assays investigate cell-cell interactions by culturing segments of spinal cord on top of muscle cell layers. Neurite projections emerge from the explant within 2 days, and functional innervation is observed by day 5 through muscle cell contraction. This demonstrates how spinal motor neurons establish connections with skeletal muscle and reveals the timeline of synapse formation during nervous system development.

How do axon guidance assays use explanted tissue to study neural development?

Axon guidance assays examine factors within neurons and the surrounding environment that direct axon elongation to proper target locations. Researchers use explanted tissues to study this complex process by observing how axons respond to environmental cues. This approach reveals the intrinsic and extrinsic signals that guide axon pathfinding during the establishment of neural connections between target tissue and the central nervous system.

Culture d'explants de tissu neural

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La culture d’explant est utilisée comme technique pour étudier le développement de populations cellulaires spécifiques et les structures neurales. Dans les expériences sur le neurodéveloppement, les explants sont des tissus neuraux extraits d’un embryon et cultivés in vitro. Ces cultures donnent au chercheur la possibilité de manipuler et de visualiser les tissus en développement par des moyens qui seraient impossible in vivo. Cette vidéo introduira quelques principes sur lesquels s’appuie le travail avec des tissus explantés, les procédures pas à pas de deux techniques de culture d’explants ainsi que des utilisations de ces techniques.

Avant d’aborder les méthodes, revoyons certains principes de base. Les explants peuvent être issus de différents organismes modèles et d’une variété de types de tissus. En général, les cultures sont créées en retirant délicatement du tissu neural d’un embryon, en disséquant la région d’intérêt, et en la plaçant dans un environnement artificiel. Les tissus peuvent aussi être sectionnés en coupes fines et cultivés en « culture en coupe ». Du fait que l’environnement de culture est supposé imiter les conditions in vivo de l’organe entier, cette technique de culture est souvent appelée « organotypique ».

Avant de commencer, assurez-vous de stériliser vos instruments avec de l’éthanol à 70%. Puis, euthanasiez une souris enceinte en utilisant le protocole préféré de votre labo. Ensuite, excisez chirurgicalement l’utérus et placez le dans un tampon refroidit dans la glace. Transférez la section sur un microscope de dissection et retirez les embryons de leur sac vitellin. Ensuite, isolez le cerveau, disséquez avec précaution votre région d’intérêt, et transférez la dans une boite contenant du milieu de culture. Les explants peuvent être maintenus dans un incubateur à 37°C avec 5% de CO2 pendant quelques semaines en remplaçant 50% du milieu tous les 2-3 jours.

Les cultures en coupes de tissus du cerveau nécessitent quelques étapes supplémentaires. Avant la coupe, le tissu est enrobé dans de l'agarose, ce qui permet son soutien pour qu’il reste intact pendant la coupe. Pour ce faire, une solution à 1,5% d'agarose à point de fusion bas est chauffée jusqu'à dissolution de l'agarose. L'agarose est ensuite transféré dans des moules d’inclusion et laissé un peu refroidir pour éviter d'endommager le tissu. Le tissu peut ensuite être soigneusement immergé et l'agarose va durcir. Les blocs obtenus sont coupés, collés à un porte-échantillon, et sectionnés grâce à un vibratome, un instrument avec une lame vibrante pour couper de fines sections de tissus vivants. Les coupes obtenues sont soigneusement transférées sur une plaque contenant le milieu de culture et sont cultivées comme indiqué précédemment.

Il y a de nombreux avantages à utiliser la culture d'explants plutôt que les méthodes in vivo et d’autres in vitro. Premièrement, les cellules des tissus explantés sont plus accessibles pour les outils expérimentaux. Deuxièmement, le fait que les explants conservent l'architecture cellulaire complexe du tissu neural en développement signifie que les interactions cellule-cellule peuvent être étudiées. Troisièmement, étant donné que les chercheurs peuvent contrôler la composition chimique du milieu de culture, ils peuvent tester l'effet de composés spécifiques sur le développement du tissu.

Néanmoins, puisque le tissu est séparé de son milieu naturel, une attention particulière doit être portée pour le maintenir heureux et en bon état sous in vitro. Par exemple, la présence de matrice extracellulaire, ou MEC, a un impact significatif sur le comportement cellulaire, donc des protéines purifiées de MEC sont souvent utilisées dans les boîtes de culture. Un autre critère important est la solution dans laquelle les explants sont cultivés. Le milieu de culture cellulaire traditionnel est souvent utilisé, mais certaines expériences requièrent des solutions qui ressemblent de près au fluide circulant dans le système nerveux central: le liquide céphalo-rachidien, qui est un réactif critique dans les expériences comme celles que vous êtes sur le point de voir.

Maintenant que nous avons vu les méthodes de culture d'explants, voyons comment ces techniques sont utilisées.

Les tests de migration cellulaire utilisent les explants pour examiner les signaux répulsifs et attractifs impliqués dans la migration des cellules neurales. Dans cette expérience, des billes préalablement imprégnées de facteurs de croissance sont implantées dans des explants de cerveau postérieur pour étudier la migration des cellules neurales. Après 3 à 4 jours d'exposition, les neurones sont visualisés grâce à un microscope confocal. Les résultats montrent que les neurones moteurs migrent vers les billes imprégnées de facteur de croissance de l’endothélium vasculaire, mais pas vers les billes de contrôle.

Les expériences de co-culture sont souvent utilisées pour étudier les interactions cellule-cellule au cours du développement. Dans cet exemple, des segments de moelle épinière ont été cultivés sur une couche de cellules musculaires pour étudier la façon dont les connexions sont faites entre les neurones moteurs spinaux et les muscles squelettiques. Après 2 jours d’incubation, les projections des neurones, aussi appelées neurites, sortent de l'explant. Dans les 5 jours, une innervation fonctionnelle est mise en évidence par la contraction de la couche de cellules de muscle.

Au cours du développement du système nerveux, les neurones doivent allonger leurs axones pour établir une connexion entre le tissu cible et le système nerveux central. Une manière d'étudier ce processus complexe est par essais de guidage axonal. Les chercheurs utilisent des tissus explantés pour examiner les facteurs dans les neurones et dans le milieu environnant qui aident à guider l'axone à l'emplacement approprié.

Vous venez de regarder le guide de JoVE sur la culture d’explants de tissu neural. Cette vidéo a parcouru les avantages des cultures d'explants, les stratégies de culture, les protocoles pas à pas de deux procédures d'explants souvent utilisées et comment ces techniques sont utilisées en laboratoire aujourd'hui. Merci de nous avoir regardés!

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La structure élaborée du système nerveux des vertébrés provient d'une série complexe d'événements impliquant la différenciation cellulaire, la migrati…