Summary
המחקר של התנהגות של תנועה מורכבת
Abstract
זבובים לספק מודל חשוב ללימוד התנהגות מורכבת בשל שפע של כלים גנטיים לרשות החוקרים בתחום זה. לימוד התנהגות של תנועה ב
Protocol
חלק 1: האכלה וניהול של זבובים
- זבובים צריכים להיות בוגרים בבקבוקים המכילים שמרים ללא מדיה סטנדרטי. אתה צריך כמויות גדולות של זבובים, כך חוצה צריך להגדיר בהתאם. זבובים צריכים להיות מבוגר אור של 12 שעות: מחזור חשוך במהירות של 25 º C.
- זבובים יש לאסוף מיד לאחר eclosion (1-3 ימים). זבובים יכול להיות עבד עם בשלב זה באמצעות מפזר פחמן דו חמצני, ויש מיון לתוך מבחנות המכילות מדיה autoclaved או ללא שמרים. אנו משתמשים רק זכרים, לאחסן 10 עד מבחנה.
- אפשר לפחות יום או יומיים לאחר שימוש של פחמן דו חמצני לפני הפעלת ניסויים התנהגותיים. אנחנו רצים זבובים assay התנהגותיים שלנו 3-5 ימים לאחר ECLOSION.
- מבחני תמיד צריך להיעשות בתוך החלון שעה באותו 2-3 זמן בכל יום, כדי למנוע בעיות קצב היממה.
חלק 2: הקמת מערכת מעקב בסביבה מבוקרת
- כל הניסויים נעשים בחדר סביבה אשר שומרת על טמפרטורה קבועה של 25 º C עם לחות 70%.
- להשעות מצלמת וידאו דיגיטלית על פני השטח שיירשמו (המצלמה פונה כלפי מטה). מאז תוכנת מעקב שלנו היא בניגוד מבוסס, אנו משעים את המצלמה מעל תיבת האור. רשומות קטעי וידאו המצלמה ישירות למחשב באמצעות חיבור Dell firewire. אנו משתמשים במצלמה שארפ וידאו דיגיטלי, התחברה למחשב של Dell עם Windows MovieMaker (גרסת Vista) לרכישת וידאו.
- פולסים האוויר תנוהל בפרוטוקול זה, אז מקור זרימת האוויר חייב להיות נוכח בחדר. באמצעות צינור גומי, לחבר את מקור האוויר מסנן פחם לסינון אוויר.
- באמצעות צינור גומי יותר, לחבר את הצד השני של פחמן המסנן בקבוק Erlenmeyer באמצעות פקק גומי חלול, ולמלא את הבקבוק עם כחצי סנטימטר מים. זה יהיה ללחלח את האוויר.
- הבקבוק צריך להיות גם אקדח, אשר יתחבר שסתום Y בצורת באמצעות צינור גומי.
- סניף אחד של שסתום ה-Y צריך להיות מחובר flowmeter. הסניף השני אמור לספק אוויר לתא תנועה בכיכר.
חלק 3: אספקת זבובים לחדר תנועה
- החדר תנועה בכיכר מבוסס על העיצוב של וולף et al. 2002 1, עם תוספת של מגשי טיפה קטנה כדי למנוע זבובים מעופפים בתוך החדר. החדר צריך להיות מפורק, וכל הרכיבים יש לנגב ביסודיות למטה עם 70% אתנול ו מיובש לפני השימוש.
- הרדמה מיד לפני ביצוע assay התנהגות עלולה לפגוע בביצועים. כדי למנוע זאת, זבובים הם דפק בעדינות לתוך תא באמצעות משפך עם שקע קטן. כדי להפוך את פורקן בגודל הנכון, לצרף טיפ כחול פיפטה (עבור P1000) לסוף משפך. השתמש במספריים לחתוך את הקצה מאוד של קצה פיפטה לעשות פתיחת מספיק גדול בשביל להטיס לעבור.
- חלקו העליון של החדר שלנו היא פיסה קטנה של פרספקס מאובטח על ידי ברגים בקצוות. כאשר את הברגים מוסרים, החורים יכול לשמש כדי לספק זבובים לתוך החדר. המיקום העליון פרספקס כך חור הבורג יושב ישירות על החדר הפנימי, במקום שבו בורג בדרך כלל יושבת. קחו מבחנה המכילה את הזבובים במקום זה הפוך על המשפך, אשר אמור אז להיות ממוקם לתוך החור בורג.
- אל תזיז את המשפך, כמו זה יכול לפגוע או לגרום נזק זבובים. במקום זאת, בעדינות המפץ חדר שלם, משפך וכל, עד זבובים כולם בתוך החדר. לדפוק זה צריך להיעשות על משטח עכבר לספוג את ההלם של מכה זו. כאשר נמצאים בתוך זבובים, להסיר את המשפך, מחדש במיקום העליון פרספקס על מיטות בורג. אז מחדש בורג העליון פרספקס למקומו.
חלק 4: הפעלת Assay של תנועה
- לאחר זבובים נטענים כמו שצריך, לתת להם להסתגל בחדר במשך 30 דקות. תקופת ההסתגלות אמורה להתקיים בסביבה מבוקרת (25 מעלות צלזיוס, לחות 70%), ובית הנבחרים צריך להיות ממוקם על גבי תיבת אור (שאמור להיות מופעל). כבה את האורות בחדר אחר.
- לאחר תקופת הסתגלות, מתג ה-Y שסתום במערכת זרימת אוויר כזה באוויר רק לזרום flowmeter. הפעל באוויר, כבש את האוויר עד למהירות הרצויה (4.0-6.0 L / min). אנו משתמשים בדרך כלל 5.0-5.5 ליטר / דקה, אבל בכל מהירות בטווח זה יעבוד.
- לאחר המהירות הרצויה מושגת, להחליף את שסתום ה-Y, כך האוויר זורם אל חדר תנועה. זה זמן אוויר הדופק במשך 15 שניות, ואז פתאום להפוך את האוויר מעל. כפי שאתה להפוך את האוויר מעל, לעבור את המצלמה כדי להקליט במצב. (חלק זה לוקח בפועל לעשות הכל בבת אחת).
- עצור את ההקלטה לאחר זמן הרצוי ולשמור. אנו רושמים 30 ניסויים השני 10 מסגרות לשנייה (לפחות 8 משפטים לכל גנוטיפ).
חלק 5: ניתוח סרטי וידאו
- אנו משתמשיםתמונה דינמית ניתוח מערכות (דיאס) 3.2 תוכנה עבור ההצעה מעקב 2. כדי להשתמש בתוכנה זו, אנחנו הראשונים להמיר קטעי וידאו שלנו בתבנית קובץ AVI עם Quicktime 7.5.5.
- כדי לעקוב אחר הזבובים על בסיס לעומת זאת, אנו משתמשים "Autotrace ידי סף" פונקציה. אנחנו מכן להשתמש "הפוך מן הנתיב Trace" פונקציה לספרת אלה עקבות.
- כדי התפוקה במהירויות מיידי של זבוב אחד, אנו משתמשים "Compute פרמטרים" פונקציה כדי להפיק קובץ מסד הנתונים (דיאס ספציפי). שימוש בפונקציה זו, אנו גם חלקה את הנתונים באמצעות "5,15,60,15,5" חלון טיוקי החלקה.
- לאחר מידע זה outputted כקובץ מסד נתונים, אותו ניתן לפתוח ב-Microsoft Excel. אנו משתמשים תסריט Matlab כדי לקמפל את מהירויות מיידי בתוך להצטיין לחשב פרמטרים נוספים הדרושים להבנת הדינמיקה התנועה מבנה התקף.
נציג תוצאות:
איור 1 מציג עקבות נציג אורגניזמים סוג קנטון S בר (איור 1, פאנל משמאל) זבובים null עבור הגן dCASK אשר נוצרו על ידי מעבר בשני מחיקות חופפים גדול (DF (3R) x307 ו DF (3R) x313) (איור 1 , נכון פאנל). זבובים dCASK null בעבר הראו בעיות של תנועה באמצעות פרדיגמה של Buridan 3, ועל הפרדיגמה שלנו, לעומת קנטון S, הם מראים ירידה מאוד תנועה. אנחנו תמיד לרוץ אורגניזמים סוג בר הראשון לוודא כי התנאים התנהגות בטווח התקין ביום נתון. ראינו סטיות תקן התגובות% פחות מ 5 ימים של בדיקות. הבדלים אלה בדרך כלל ניתן לייחס בעיות עם פרמטרים של סביבה מבוקרת שלנו.
באיור 1. דיאס שנוצר עקבות של שני S קנטון זבובים בר סוג (לעיל, משמאל) של תנועה מחסר Null dCASK זבובים שנוצר מחיקות חופפים (למעלה, מימין). עקבות מייצגים מה לראות קטעי וידאו מוקלטים. שני contrain עקבות תמונות 8-10 זבובים לרוץ במשך 30 שניות ב assay מעקב וידאו הבאים הדופק אוויר.
איור 2. זבובים מסוג Wild נוהלו assay של תנועה (לעיל) בעקבות דופק אוויר (ברים סגול) וללא דופק האוויר (כחול). בכל הפרמטרים מחושב על ידי תוכנית הניתוח, לא היו הבדלים משמעותיים בין שני תנאים (נקבע עם התלמיד שני זנב t-test). זה מדגים כי בעקבות דופק אוויר, זבובים locomote בדרך כלל ההתקנה שלנו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ב ההתקנה שלנו, דופק אוויר חזק בינוני transiently עוצר את התנועה לעוף. כאשר הדופק האוויר נגמר, הזבובים משתחררים ממצב זה נייחים locomote בדרך כלל, כפי שמוצג באיור 2. כי זה דופק האוויר ביעילות מסנכרן תנועה של האוכלוסייה, אנחנו משתמשים בו כדי להתחיל את הניסוי, כדי שנוכל ללמוד גם את תחילתה של התנועה בעקבות גירוי שבירת המומנטום. Assay עם זאת, ניתן לעשות זאת ללא דופק אוויר מאז פרמטרים של תנועה בעקבות חניכה אינם מושפעים על ידי הדופק האוויר (איור 2).
אחת הבעיות השכיחים לראות עם ניתוח אוטומטי של תנועה הוא הנושא של התנגשויות. תוכניות מעקב הן על פי רוב רע לשמצה בהתמודדות עם זבובים מתנגשים. תוכניות אלו לעתים קרובות מאבדים את "מראה" של אובייקט לרגע במהלך התנגשות, ועל ממצא זה תווית האובייקט אותו כאובייקט חדש. התוצאה יכולה להיות פלט כי יש חפצים רבים יותר מאשר לייחס למעשה קיימות בתא. אנשים רבים לפתור את הבעיה הזו על ידי התחקות זבובים אחד. הבעיה עם זה ברור, עם זאת, היא כי התנהגות זבוב אחד עשוי להיות שונה מאוד מאשר התנהגות האוכלוסייה בשל תפקידו של רמזים חברתיים בהתנהגות תסיסנית ו תנועה 4. זהו, כמובן, לא בהכרח דבר רע, תלוי מה אתה מנסה ללמוד, אבל למטרות שלנו, אנחנו מעדיפים להשתמש אוכלוסיות זבובים להגדיל את כוח סטטיסטי שלנו. מסיבה זו, אנו מתמודדים עם התנגשויות בשתי דרכים. ראשית, אנחנו משתמשים רק 8-10 זבובים לכל משפט (ב 56 מ"מ רבוע שלנו קאמרית), כך התנגשויות כי תהיה מינימלית. שנית, במסגרת ניסויים thirty שלנו השני, אנחנו רק לנתח עקבות, כי הם לפחות 18 שניות אורך. בעשותם זאת, אנחנו תמיד הקלטה מספיק זמן כדי ללכוד התקפים מרובים של תנועה בשלמותם. זה גם מבטיח כי גודל המדגם שלנו תמיד משקף את מספר זבובים בתא, כמו שברים קטנים של תנועה מבוטלים וגם את האורך הכולל של וידאו היא רק 30 שניות.
ניתוח נתונים יכול להיות החלק הקשה ביותר של התהליך הזה. השלב החשוב ביותר בניתוח נתוני המעקב הוא לקבוע את ההבדל בין רעש ותנועה. דיאס (כמו תוכניות רבות אחרות) יהיה כמעט אף פעם פלט מהירות מ"מ 0 / s, גם אם לטוס הפסיק לזוז. בגלל זה, חשוב לראות את קטעי וידאו בעת מסתכל מסגרת נתוני התפוקה על ידי מסגרת לראות מתי אורגניזמים הם בעצם בתנועה, כאשר הם לא. ב ההתקנה שלנו, כל במהירויות מתחת ל -1 מ"מ / s נראה רעש, אשר עולה בקנה אחד עם מה קבוצות אחרות באמצעות דיאס מצאו זבובים בוגרים 1. בשביל להסתכל על הדינמיקה של מבנה התקף, צריך גם להגדיר התקף. אנו מגדירים פעילות כמו 3 או יותר מסגרות רצופות של מהירות מעל 1 מ"מ / s, וחוסר פעילות כמו 3 או יותר מסגרות רצופות מתחת לסף זה.
הנתונים חייב גם להיות מוחלק שצריך לחסל את החפצים מן הבהוב אור חולף ועיוותים מצלמה, אשר מופיעה מדי פעם. אין שיטה סטנדרטית נתונים החלקה, אך חשוב כי תהליך ההחלקה לא משנה את המגמה הכללית של הנתונים באופן דרסטי מדי, או אחד יכול ליצור חפצים החלקה. אנחנו חלק פעמיים עם חלון טיוקי של "5,15,60,15,5", כי זה נראה לחסל את כל קפיצות גדולות או שינויים במהירות כי טועים בבירור, אך לא משנה את המגמה הכללית הטבע או של הנתונים.
חשוב להכיר בכך setups שונים וסביבות יפיק תוצאות התנהגותיות שונות. ההמלצה שלנו לכל אחד להקים assay מעקב להתנסות עם כל הבעיות הללו עד שתמצאו שיטה אשר מייצרת נתונים שתואם את מה שניתן לראות ויזואלית, ולאחר מכן להיות עקבי ככל האפשר בטיפול כל הנתונים באותו אופן.
בחירת תוכנית המעקב הנכון הוא גם חשוב. למרות שאנו משתמשים דיאס 3.2 (www.solltechnologies.com), זה בהחלט לא הטוב ביותר או את המערכת זמינה רק. במשך מעקב של זבובים יחיד, דן ולנטה (מיטרה מעבדה, CSHL) פיתחה תוכנית בשם Ftrack. עבור זבובים מרובים locomoting יחד (כלומר, היכן התנגשויות עלולות להתרחש), קריסטין ברנסון (דיקינסון / Perona Labs, קלטק) פיתחה תוכנית בשם Ctrax. Ftrack זמין בכתובת www.chronux.org, בעוד Ctrax זמין בכתובת www.dickinson.caltech.edu / מחקר / Mtrax. Ethovision תוכנה (Noldus, הולנד) הוא עוד אפשרות עוצמה עבור מעקב וידאו של זבובים גם יחיד מרובים, אבל זה רק זמינים מסחרית, וגם הוא די יקר.
אם יש לך להקים assay מעקב אחר לא יכול להשיג הקלטות אמין, יש כמה דברים לשקול. בעיות מקצב צירקדי לעיתים קרובות בעיה גדולה. בעת הפעלת מבחני התנהגות, יש תמיד לוודא שלא להתמודד זבובים במהלך הצהריים הסייסטה שלהם. מאז אנחנו curreמעוניין ntly בגנים שיכול לייצר ירידה התנהגות של תנועה, אנחנו מעדיפים לרוץ זבובים בקרבת שיא פעילות אחר הצהריים המאוחרות (ZT 80-10). בעיה נוספת יכולה לנבוע גם זרימת אוויר עולה בקנה אחד מהמקור. לפני ניסויים החל, להיות בטוח כדי לבדוק את זרימת האוויר עם flowmeter, כך שזה לא תשתנה באופן משמעותי על הדופק 15 האוויר השני. לבסוף, הרקע הגנטי יכול לשחק תפקיד בכל משימות התנהגותיות, אז כמה פרמטרים של assay זה ייתכן שיהיה צורך אופטימיזציה עבור רקע מסוים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות גרנט R01 GM54408 הוענק LC גריפית. ברצוננו להודות פרד וולף על כל העזרה שלו בעיצוב חדר מרובע שלנו בהקמת assay שלנו, פרנק מלו בחנות אוניברסיטת ברנדייס מכונה לבניית החדר שלנו, דן ולנטה וטים Lebestky לשיחות מועילות בנושאים ניתוח.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Square Chamber | Tool | Machine Shop | N/A | Design from Wolf et al. 20021 |
| Digital Camera | Camera | Sharp | ViewcamZ VL-23 | |
| Flowmeter | Tool | Cole-Parmer | SY-32003-12 | |
| Light Box | Tool | DNASTAR | Seq-Easy | |
| Charcoal Filter | Tool | Fisher Scientific | 09-744-37 | |
| DIAS 3.2 | Software | Soll technologies | N/A | www.solltechnologies.com |
References
- Wolf, F. W., Rodan, A. R., Tsai, L. T. High-Resolution Analysis of Ethanol-Induced Locomotor Stimulation in Drosophila. J Neurosci. 22 (24), 11035-11044 (2002).
- Soll, D. R. The use of computers in understanding how animal cells crawl. International review of cytology. 163, 43-104 (1995).
- Martin, J. R., Ollo, R. A new Drosophila Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase (Caki) is localized in the central nervous system and implicated in walking speed. The EMBO journal. 15 (8), 1865-1876 (1996).
- Levine, J. D., Funes, P., Dowse, H. B. Resetting the Circadian Clock by Social Experience in Drosophila melanogaster. Science. 298, 2010-2012 (2002).
