Summary
In questo articolo viene descritto come si ottiene FRET tracce di molecole di DNA individuale immobilizzato su una superficie utilizzando un microscopio a scansione automatica confocale.
Abstract
Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) microscopia è stata ampiamente utilizzata per studiare la struttura e la dinamica delle molecole di interesse biologico, come gli acidi nucleici e proteine. Singola molecola FRET (sm-FRET) misurazioni su molecole immobilizzate permettono lunghe osservazioni del sistema in modo efficace fino a quando entrambi i coloranti photobleach-con conseguente time-tracce che relazione sulla dinamica biomolecolare con una vasta gamma di tempi da millisecondi a minuti. Per facilitare l'acquisizione di un gran numero di tracce per analisi statistiche, il processo deve essere automatizzato e l'ambiente campione dovrebbe essere strettamente controllato nel tempo di misura intera (~ 12 ore). Questa operazione viene eseguita utilizzando un microscopio confocale a scansione automatica che permette l'interrogatorio di migliaia di singole molecole durante la notte, e una cella microfluidica che permette lo scambio controllato di buffer, con contenuto di ossigeno limitato e mantiene una temperatura costante durante tutto il periodo di misura. Qui si mostrano come assemblare il dispositivo a microfluidi e come attivare la sua superficie per l'immobilizzazione del DNA. Poi ci spiegano come preparare un buffer di massimizzare la fotostabilità e la durata della fluorofori. Infine, mostriamo i passi necessari per preparare il setup per l'acquisizione automatica del tempo risolto singola molecola FRET tracce di molecole di DNA.
Protocol
1 - Assemblaggio della cella microfluidica
La cella microfluidica è costituito da fondendo una fantasia, 2 mm di spessore, polidimetilsilossano (PDMS) disco di una scivolata appena pulita copertura quarzo. Il disco contiene quattro PDMS 30 camere microlitri rettangolare a cui si accede da ingresso e uscita flessibile capillari collegato ad un serbatoio di buffer e una pompa a siringa, rispettivamente, per il flusso controllato di buffer. La cella di flusso è supportato dalla sua parte posteriore da una finestra di vetro e collocato su una misura titolare cella che contiene un elemento termoelettrico raffreddato ad acqua per regolare la temperatura.
- Per rendere la fantasia PDMS disco, miscelare 10 parti di base di silicone elastomero con 1 agente parte la cura, mescolate bene e lasciate degasaggio per 1 ora nel vuoto.
- Delicatamente versare la miscela nello stampo elastomero cellula microfluidica. Nel nostro caso, questo è un 1 "wafer di silicio con quattro strisce (1x10 1x10 4 x 3 x 300 micron) a base di photoresist negativo. Lasciare questo per la cura su un piatto caldo a 70 ° C per due ore.
- Con attenzione buccia del disco curata PDMS dallo stampo usando una lama di rasoio. Fusibile il disco su un''1 finestra di vetro (contenente 8 x 2 mm di diametro fori già predisposti alle due estremità dei canali) da plasma ossidanti entrambe le superfici per 30 secondi. Fondere le vetrate sul lato piatto del disco PDMS (il lato non contenente i canali).
- Inserire un 2-pollice di lunghezza tubo flessibile capillare di silice fusa attraverso il foro di ogni finestra di vetro fino a quando non raggiunge il canale. Inserimento di un ago e poi segue con il capillare può facilitare questo processo. Sigillare i fori di vetro della finestra con un rapido indurimento composto colata di silicone come Kwik-Cast.
- Sciacquare i canali con etanolo e acqua, e plasma-attivare la cellula insieme ad una appena pulita, da 1 pollice slittamento quarzo circolare copertura per 30 secondi. Si consiglia di pulire questo vetrino utilizzando piranha *. Fondere il vetrino sul lato della cella che contiene i canali, sigillando le camere.
- Lasciare la cella assemblata a curare tutta la notte a temperatura ambiente.
* Piranha è una soluzione di H 2 O 2 e H 2 SO 4 a 1:2.5 proporzioni. Per pulire il copri-oggetto, immergerle in piranha a 90 ° C per 20 min.
2 - Attivare la superficie di immobilizzazione molecola
Per gli studi di acido nucleico, più semplice il regime di immobilizzazione superficie consiste in primo rivestimento un bicchiere o slittamento quarzo con copertura biotinilato albumina sierica bovina (BSA) e poi con streptavidina. Questo permette al campione biotinilato di essere immobilizzato con alta specificità per i giorni a temperatura ambiente.
- Collegare il tubo flessibile per i capillari per l'iniezione del buffer facile utilizzando una siringa e l'ago.
- Iniettare una soluzione di 0,1 mg / ml di BSA biotinilati nel buffer A (10 mM TRIS-HCl, pH 8,0, 50 mM NaCl, filtrata utilizzando filtri 0,02 micron), nel canale e incubare per almeno 30 min.
- Flusso di 300-500 ml di tampone A di togliere qualunque BSA libera biotinilato dal canale, facendo attenzione a non intrappolare bolle d'aria all'interno della camera.
- Iniettare una soluzione di 0,1 mg / ml di streptavidina nel buffer A e incubare per 15 min. Poi ripetere il passo 3.
- Flusso attraverso una soluzione 3-5 pM del campione biotinilato. Eseguire una scansione della superficie per verificare la copertura di molecole fluorescenti. Se necessario, aumentare la concentrazione del campione per ottenere una migliore copertura. Incubare per 10 minuti e ripetere il passo 3.
La cella microfluidica è montato su un palcoscenico motorizzata xy permettendo grossolane (fino a 25 mm) movimento utilizzando otticamente codificati motori DC, e fine (1 nm) utilizzando due moto a circuito chiuso attuatori piezoelettrici (Physik Instrumente modello M-014 o simili). Questo può essere fatto prima o dopo aver attivato la superficie per l'immobilizzazione del campione.
3 - Preparazione del Buffer Imaging (IB)
L'IB consiste in un sistema enzimatico dell'ossigeno scavenging e un quencher tripletta, come Trolox. Dal momento che l'IB viene svuotata attraverso costantemente durante la notte, almeno 10 ml deve essere preparato in anticipo.
- Preparare 10 ml di 0,8% w / v D-glucosio, almeno 35 mM TRIS-HCl pH 8,0 e 50 mM NaCl in acqua deionizzata. La maggiore concentrazione di buffer è importante per due motivi: Trolox dissoluzione sarà acidificare la soluzione, e la reazione enzimatica anche abbassare il pH della soluzione nel tempo. Dal momento che questa soluzione ha una lunga durata può essere memorizzato come soluzione stock.
- Sciogliere 5 mg di Trolox nel buffer preparata nella fase 1 con il vortex per un paio di minuti e poi agitando per> 10 min. Trolox non è molto solubile in acqua a pH> 7, in modo da non correre questo passaggio. Filtrare la soluzione con un filtro di 0,2 micron e lasciare degasaggio nel vuoto per 10 minuti.
- Preparare la soluzione "gloxy" enzimatica mescolando wate 60 microlitrir, 20 ml di tampone 5X A, 20 ml di catalasi, glucosio ossidasi 1 mg e 100 ml di 10 mg / ml BSA. Filtrare la soluzione con un filtro di centrifuga 0,22 micron.
- Mescolare delicatamente il tampone dal Punto 2 con la soluzione "gloxy" dal punto 3 evitando la formazione di bolle d'aria.
- Il flusso di IB attraverso il canale ad una velocità costante di 5 microlitri / min con una pompa meccanica siringa per controllare la velocità del flusso. Bolla di gas argon nel serbatoio IB per evitare che l'ossigeno atmosferico da ri-sciogliendo nel buffer.
La scansione della superficie, localizzazione molecola e l'acquisizione di tracce singole intensità molecola è controllato da un programma LabView che permette la raccolta automatica dei dati 1. Il programma esegue la scansione 20x20 micron 2 aree risoluzione a 0,2 micron, con un tasso di 0,1 micron / ms. I dati vengono immediatamente lavorati per produrre intensità ponderata posizioni di tutti i pixel sopra i conteggi di fondo. Una volta che le molecole si trovano immobilizzate, vengono spostati uno per uno nel volume confocale e l'intensità del donatore e fluoroforo accettore sono registrati in funzione del tempo fino a quando entrambi photobleach fluorofori. Il palco è poi programmato di passare a una nuova origine 100 micron di distanza, e il processo di scansione si ripete.
4 - Risultati Rappresentante
Di seguito alcune immagini che mostrano la cellula assemblato microfluidica prima dell'attivazione di superficie e dopo essere stato montato sul microscopio pronto per l'immobilizzazione molecola. Se il canale è attivato con successo, le scansioni di superficie dovrebbe essere simile a quella illustrata qui sotto le scansioni che mostrano emissione del donatore colorante (verde) e accettore (rosso) dopo l'eccitazione del donatore diretta. Queste molecole sono spostati uno dopo l'altro nel volume di sondaggio e la fluorescenza viene registrata nel corso del tempo fino a quando entrambi photobleach coloranti, come indicato nella traccia singola molecola. Da tracce come queste si può ottenere la FRET efficienza che informa sul istantanea donatore-accettore di separazione, che a sua volta viene utilizzato per esplorare la struttura e la dinamica delle molecole di interesse biologico.
Figura 1: cella Microfluidic con quattro canali, ognuno con ingresso / uscita capillari. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande della figura 1.
Figura 2: Cell montato sul microscopio pronto per le misurazioni. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande della figura 2.
Figura 3: Impostazione per sm-FRET misurazioni. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande della figura 3.
Figure 4 e 5: il canale Rosso e verde di una scansione della superficie di immobilizzata FRET molecole eccitati con il laser verde. Clicca per vedere una versione più grande di figura 4 , o figura 5 .
Figure 6, 7, 8 e 9: traiettorie Intensità del donatore (verde) e accettore (rosso) fluorofori etichettati per una molecola di DNA 8, 10, 16 e 18 paia di basi a parte. Clicca per vedere una versione più grande di figura 6 , figura 7 , figura 8 , o figura 9 .
Discussion
Anche se il protocollo di cui sopra è stato ottimizzato per il nostro particolare sistema e per una precisa scelta di coloranti (TMR e ATTO647N), esso non è affatto l'unico metodo provato. Recentemente, un sistema alternativo di ossigeno scavenging composto da acido protocatechuic (PCA) / protocatechuate-3 ,4-diossigenasi (PCD) ha mostrato di aumentare la fotostabilità di alcuni coloranti 4. Allo stesso modo, altri tripletta stato quenchers come il β-mercaptoetanolo (BME) può essere usato al posto di Trolox, anche se queste non possono sopprimere lunga durata lampeggiante di alcuni coloranti, in particolare Cy5 5.
Anche se immobilizzazione tramite biotina-streptavidina-biotinilato albumina di siero bovino (BSA) è la scelta preferita per gli studi di acidi nucleici, un polietilene glicole (PEG)-superficie rivestita è più adatto per gli studi di proteine in quanto impedisce ai non-specifica adesione 1. Inoltre, sub-diffrazione limitata vescicole formato può essere utilizzato per incapsulare le biomolecole di interesse nei casi in cui può essere influenzata dalle interazioni superficie 6.
In questo articolo abbiamo utilizzato una configurazione confocale dotato di silicone fotodiodi a valanga per acquisire le tracce intensità di fluorescenza. Questo protocollo funziona altrettanto bene con microscopi a fluorescenza di riflessione interna totale (TIRF) dotate di telecamere CCD. Indipendentemente dal microscopio usato, sm-FRET può informare sulle risoluzioni spaziali avvicinando al angstrom quando il donatore e il segnale accettore sono adeguatamente corretti 7.
Acknowledgments
Ringraziamo Chandran Sabanayagam per il suo aiuto nello sviluppo del sistema, Joshua Edel per la consulenza sulla progettazione del dispositivo a microfluidi e lo staff del Rowland Institute presso la Harvard University per la lavorazione di pezzi di setup. Riconosciamo utili discussioni con i membri del gruppo Meller presso l'Istituto Rowland e alla Boston University, e membri del gruppo T. Ha 's a UIUC per ottenere informazioni utili. Infine, apprezziamo il sostegno finanziario della National Science Foundation (PHY-0701207) e l'Istituto Nazionale della Salute (GM075893).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fused silica capillary tubing | Polymicro Technologies | TSP150375 | |
| Fused silica cover slip | Esco Products | R425000 | |
| Tubing | Diba Industries | ||
| Biotinylated BSA | Sigma-Aldrich | A8549 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9085 | |
| Streptavidin | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 0021122 | |
| Sylgard 184 Elastomer Kit | Dow Corning | 3097366-1004 | Silicone Elastomer Kit |
| Trolox | Aldrich | 238813 | |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C3155 | |
| Glucose Oxidase | Sigma-Aldrich | G2133 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| Kwik-Cast Sealant | World Precision Instruments, Inc. | Kwik-Cast | Silicone Casting Compound |
References
- Selvin, P. R., Ha, T. Single-Molecule Techniques, a Laboratory Manual. CSHL Press. , (2008).
- Sabanayagam, C. R., Eid, J. S., Meller, A. High-throughput scanning confocal microscope for single molecule analysis. Applied Pys. Letters. , 84-87 (2004).
- Sabanayagam, C. R., Eid, J. S., Meller, A. Using Fluorescence resonance energy transfer to measure distances along individual DNA molecules: Corrections due to nonideal transfer. J. Chem. Phys. 122, 61103-61105 (2004).
- Echeverra, A., Aitken, C., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An Oxygen Scavenging System for Improvement of Dye Stability in Single-Molecule Fluorescence Experiments. Biophysical Journal. 94, 1826-1835 (2008).
- Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. Nonblinking and long-lasting single molecule fluorescence imaging. Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).
- Boukobza, E., Sonnenfeld, A., Haran, G., Puglisi, J. D. Immobilization in Surface-Tethered Lipid Vesicles as a New Tool for Single Biomolecule Spectroscopy. J. Phys. Chem. 105, 12165-12170 (2001).
- Di Fiori, N., Meller, A. Article in preparation. , Forthcoming.
