Summary
この記事では、我々は、自動走査型共焦点顕微鏡を用いて表面に固定化された個々のDNA分子からのトレースをFRETの取得方法について説明します。
Abstract
蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）顕微鏡は、広くそのような核酸やタンパク質などの生物学的興味の分子の構造とダイナミクスを研究するために使用されています。単一分子が（SM - FRET）FRETを固定化した分子の測定は、両方の色素が分にミリ秒から時間スケールの広い範囲での生体分子のダイナミクスを報告する、時間トレースに退色-生じるまで、効率よくシステムの長期観測を許可する。統計分析にトレースの多数の買収を容易にするために、プロセスを自動化する必要があり、サンプルの環境をしっかりと全測定時間（〜12時間）で制御することがあります。これは、一晩、単一分子の数千人の尋問を可能にする自動化された走査型共焦点顕微鏡、および制限された酸素含有量を、バッファの制御された交換を可能にし、全体の測定期間を通じて一定温度を維持するマイクロセルを使用して行われます。ここでは、マイクロ流体デバイスを組み立てるための方法およびDNA固定化のためにその表面を活性化する方法を示します。その後、我々は、フルオロフォアの光安定と寿命を最大化するためにバッファを準備する方法について説明します。最後に、我々は時間分解単一分子の自動収集のためのセットアップの準備に必要な手順は、DNA分子の痕跡をFRETを示す。
Protocol
1 - マイクロ流体セルの組み立て
マイクロセルを融合させることにより行われる模様の、新鮮な洗浄石英カバースリップに厚さ2mm、ポリジメチルシロキサン（PDMS）ディスク。 PDMSのディスクには、バッファの制御フローについては、それぞれ、バッファのリザーバーとシリンジポンプに接続されている入口と出口柔軟な毛細血管によってアクセスされる4つの30μlの長方形のチャンバーが含まれています。フローセルは、ガラス窓で、その裏側でサポートして温度を調節する熱電素子冷却水を含むカスタムメイドのセルホルダーに配置されます。
- パターニングされたPDMSディスク、1部硬化剤と混合し10重量部のシリコーンエラストマーの基盤を作るために、よく混合し、真空中で1時間脱気したままにします。
- ゆっくりとマイクロセルの金型上にエラストマーミックスを注ぐ。私たちのケースでは、これは、ネガ型フォトレジストから作られたfourストリップ（1 × 4 × 1 × 3 ×300μm以下）1"シリコンウェハである。70℃のホットプレート上で治すためにこれを残す℃で2時間。
- 慎重にカミソリの刃を使用して金型から硬化PDMSのディスク皮。 30秒間の両方の表面を酸化してプラズマ1 ''ガラス窓（チャネルの両端に8 × 2mmの直径プレドリル穴を含む）の上にディスクを融合。 PDMSのディスク（チャネルを含んでいない側）の平らな側面にガラス窓を融合。
- それはチャンネルに達するまで、各ガラスの窓の穴から2インチの長いフレキシブルフューズドシリカキャピラリーチューブを挿入します。第一針を挿入し、毛細管と続くのは、このプロセスを容易にすることができる。クイックキャストのような高速硬化型シリコーン鋳造の化合物を使用してガラス窓の穴を密封する。
- エタノールと水でチャンネルをすすぎ、30秒たての洗浄、1インチの円形の石英カバースリップと一緒に細胞をプラズマが非アクティブにする。私たちは、ピラニアを使用して、このカバーガラスを清掃示唆している*.チャンバーを密閉する、チャネルを含むセルの側面にカバースリップを融合。
- 室温で一晩硬化させるために組み立てられたセルのままにします。
*ピラニアは、H 2 O 2とH 1:2.5の比率で2 SO 4のソリューションです。カバーガラスをクリーニングするには、90ピラニアでそれらを浸す℃で20分間。
2 - 分子の固定化のために表面をアクティブにする
核酸の研究については、最も単純な表面固定化スキームは、最初にコーティングのガラスまたはビオチン化ウシ血清アルブミン（BSA）とその後ストレプトアビジンとを有する石英カバースリップをされています。これにより、ビオチン化サンプルは室温で日間高い特異性で固定化することができます。
- 注射器と針を使って簡単にバッファの注入のために毛細血管にフレキシブルチューブを接続します。
- 0.1バッファのビオチン化BSAのmg / mlの液を注入（10mMトリス- HCl、pH8.0の、50mMのNaClは、0.02μmのフィルターを使用してフィルタ処理された）、少なくとも30分間チャネルとインキュベートに。
- バッファの流れ300から500μlを、チャンバー内の気泡をトラップするように注意しながら、チャンネルから任意の空きビオチン化BSAを除去する。
- バッファ内のストレプトアビジンの0.1 mg / mlの液を注入し、15分間インキュベートする。次に、ステップ3を繰り返します。
- ビオチン化サンプルの3-5 pmのソリューションを介して流れ。蛍光分子のカバレッジをチェックするために表面スキャンを実行します。必要に応じて、より良いカバレッジを取得するサンプルの濃度を増加させる。 10分間インキュベートし、ステップ3を繰り返します。
マイクロセルは光学的に符号化されたDCモータを使用して粗（最大25 mm）の動きを可能にする電動XYステージに搭載された、と細かい（1 nm）の動き二つクローズドループピエゾアクチュエータを使用している（Physik InstrumenteモデルM - 014または類似の）。これは、前またはサンプルの固定化のための表面を活性化後に行うことができます。
3 - イメージングバッファ（IB）を準備
IBは、酵素的酸素掃気システムや、トロロックスのような三重項消光剤、から構成されています。 IBは常に一晩を通してフラッシュされるので、少なくとも10 mlを事前に準備する必要があります。
- 0.8パーセントw / vのD -グルコースを10ml、少なくとも35 mMのトリス- HCl pH 8.0にし、脱イオン水のNaCl 50mMのを準備します。バッファの高濃度は、2つの理由から重要です：溶解トロロックスは、ソリューションを酸性化し、酵素反応は、また時間をかけて溶液のpHが低下します。このソリューションは、長い貯蔵寿命を持っているので、それは、原液として保存することができます。
- 数分間ボルテックスしてから、> 10分間振とうすることにより、ステップ1で調製した緩衝液中でトロロックスの5mgを溶解する。トロロックスは、pH> 7で水に溶けにくいので、このステップを急がせることはありません。 0.2μmのフィルターを使用してソリューションをフィルタリングし、10分間真空下で脱ガスしておきます。
- 60μlの瓦を混合することにより、"gloxy"酵素溶液を調製R、5X緩衝液20μl、カタラーゼ、1mgのグルコースオキシダーゼおよび10 mg / mlのBSAを100μl、20μlの。 0.22μmの遠心フィルターを使用してソリューションをフィルタリングする。
- ゆっくりと気泡の形成を回避手順3から"gloxy"ソリューションでステップ2からバッファを混ぜる。
- 流量を制御する機械式シリンジポンプを使用して、5μl/分の一定速度でチャンネルを介してIBが流れます。バッファーに再溶解から大気中の酸素を防止するためにIBの貯水池にバブルアルゴンガス。
表面スキャン、単一分子の強度のトレースの分子の局在や買収は、自動データ収集1を許可するLabVIEWプログラムによって制御されます。プログラムは、0.1μm/秒の速度で、0.2μmの解像度で20 × 20μmの2つのエリアをスキャンします。データはすぐにバックグラウンドカウント上記の全ての画素の輝度加重の位置を得るために処理されます。固定化分子が発見されれば、それらは共焦点体積中に一つずつ移動され、ドナーとアクセプターフルオロフォアの強度は、両方の蛍光体の光退色するまでの時間の関数として記録されます。ステージは、100μmの離れて新たな原点に移動するようにプログラムされ、スキャンプロセスが繰り返されます。
4 - 代表的な結果
下記の表面活性化の前と分子の固定化の準備ができて顕微鏡にマウントされた後、組み立てられたマイクロセルを示すいくつかの画像があります。チャネルが正常にアクティベートされている場合は、表面のスキャンが直接ドナーの励起後にドナー色素（緑）とアクセプター（赤）の発光を示す下図のスキャンのようになります。これらの分子は、プローブのボリュームに一つずつ移動され、単一分子のトレースに示すように蛍光が、両方の染料の光退色するまで時間をかけて記録されます。これらのような痕跡から順番に生物学的興味の分子の構造とダイナミクスを探求するために使用される瞬間的なドナー - アクセプター分離、上知らせるFRETの効率を得ることができます。
図1：4つのチャンネルを持つマイクロ流体セル、入口/出口毛細血管それぞれ。してくださいここをクリックして図1の拡大バージョンを参照すること。
図2：測定の準備ができて顕微鏡に搭載されたセル。してくださいここをクリックして図2の拡大バージョンを参照すること。
図3：SM - FRETの測定のセットアップ。してくださいここをクリックして図3の拡大バージョンを参照すること。
図4および図5：固定化の表面のスキャンの赤と緑のチャンネルは、緑色のレーザーで励起分子のFRET。大きいのバージョンを確認するにはクリックしてください図4 、または図5 。
図6、7、8、9：ドナーの強度の軌跡（緑）とDNA分子8、10、16と離れて18塩基対に標識された受容体（赤色）蛍光体。の拡大バージョンを確認するためにクリックしてください図6 、 図7 、 図8 、または図9 。
Discussion
上記のプロトコルは、私たちの特定のシステムのために、染料（TMRとATTO647N）の特定の選択のための最適化されていますが、それは決して唯一の証明方法を意味することです。最近、プロトカテク酸（PCA）/ protocatechuate -3,4 -ジオキシゲナーゼ（PCD）で構成される代替酸素掃気システムは、特定の染料4の光安定性を向上させることが示された。これらは特定のCy5で5に、いくつかの色素の点滅長期的な抑制されない場合がありますが、同様に、このようなβ-メルカプトエタノール（BME）のような他の三重項状態の消光剤は、トロロックスの代わりに使用できます。
（BSA）ビオチン-ストレプトアビジン-ビオチン化ウシ血清アルブミンを介して固定化核酸の研究のための好ましい選択肢ですが、それが非特異的接着1をしなくなるため、ポリエチレングリコール（PEG）でコーティングされた表面は、より良いタンパク質の研究に適しています。さらに、サブ回折限界サイズの小胞は、それが表面の相互作用6によって影響を受けることができる場合に関心の生体分子をカプセル化するために使用することができます。
この記事では、蛍光強度のトレースを取得するためにシリコンアバランシェフォトダイオードを搭載した共焦点セットアップを使用している。このプロトコルは、CCDカメラを搭載した全反射蛍光顕微鏡（全反射）でも同様に動作します。に関係なく使用される顕微鏡の、SM - FRETドナーとアクセプターの信号が適切に7を修正されると、オングストロームに近づいて空間分解能で通知することができます。
Acknowledgments
我々はシステム、マイクロ流体デバイスの設計上のアドバイスやセットアップの機械加工部品のハーバード大学のローランド研究所のスタッフのためのジョシュアエデルの開発に彼の助けのためにチャンドラSabanayagamに感謝。我々は、有用な情報については、UIUCで便利ローランド研究所とボストン大学のメラーのグループのメンバーとのディスカッション、そしてT.ハのグループのメンバーを認識する。最後に、我々は、国立科学財団（PHY - 0701207）と国立衛生研究所（GM075893）から財政支援に感謝。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fused silica capillary tubing | Polymicro Technologies | TSP150375 | |
| Fused silica cover slip | Esco Products | R425000 | |
| Tubing | Diba Industries | ||
| Biotinylated BSA | Sigma-Aldrich | A8549 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9085 | |
| Streptavidin | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 0021122 | |
| Sylgard 184 Elastomer Kit | Dow Corning | 3097366-1004 | Silicone Elastomer Kit |
| Trolox | Aldrich | 238813 | |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C3155 | |
| Glucose Oxidase | Sigma-Aldrich | G2133 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| Kwik-Cast Sealant | World Precision Instruments, Inc. | Kwik-Cast | Silicone Casting Compound |
References
- Selvin, P. R., Ha, T. Single-Molecule Techniques, a Laboratory Manual. CSHL Press. , (2008).
- Sabanayagam, C. R., Eid, J. S., Meller, A. High-throughput scanning confocal microscope for single molecule analysis. Applied Pys. Letters. , 84-87 (2004).
- Sabanayagam, C. R., Eid, J. S., Meller, A. Using Fluorescence resonance energy transfer to measure distances along individual DNA molecules: Corrections due to nonideal transfer. J. Chem. Phys. 122, 61103-61105 (2004).
- Echeverra, A., Aitken, C., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An Oxygen Scavenging System for Improvement of Dye Stability in Single-Molecule Fluorescence Experiments. Biophysical Journal. 94, 1826-1835 (2008).
- Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. Nonblinking and long-lasting single molecule fluorescence imaging. Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).
- Boukobza, E., Sonnenfeld, A., Haran, G., Puglisi, J. D. Immobilization in Surface-Tethered Lipid Vesicles as a New Tool for Single Biomolecule Spectroscopy. J. Phys. Chem. 105, 12165-12170 (2001).
- Di Fiori, N., Meller, A. Article in preparation. , Forthcoming.
