Summary
В этой статье мы опишем, как мы получаем FRET следы от отдельных молекул ДНК, иммобилизованных на поверхности с помощью автоматизированной сканирующей конфокальной микроскопии.
Abstract
Резонансной флуоресценции передачи энергии (FRET) микроскопия нашла широкое применение для изучения структуры и динамики молекул биологического интереса, такие, как нуклеиновые кислоты и белки. Одноместный молекулы FRET (см-FRET) измерений на иммобилизованных молекул разрешения длительные наблюдения системы эффективно, пока обе красителей photobleach-в результате чего время-следы, что отчет о динамике биомолекулярных с широким спектром временных масштабах от миллисекунд до нескольких минут. Для облегчения приобретения большого количества следов для статистического анализа, процесс должен быть автоматизирован и окружения образца должны быть под жестким контролем в течение всего времени измерений (~ 12 часов). Это достигается с помощью автоматизированной сканирующей конфокальной микроскопии, который позволяет допроса тысяч одиночных молекул в одночасье, и микрожидкостных клетка, которая позволяет контролируемого обмена буфера, с ограниченным содержанием кислорода и поддерживает постоянную температуру на протяжении всего периода измерения. Здесь мы показываем, как собрать микрожидкостных устройств и инструкции по активации ее поверхности для иммобилизации ДНК. Затем мы объясняем, как подготовить буфер для максимально фотостабильности и срок службы флуорофоров. Наконец, мы покажем этапы подготовки установки для автоматизированного приобретения с временным разрешением одной молекулы FRET следы молекул ДНК.
Protocol
1 - Сборка микрожидкостных ячейки
Микрожидкостных ячейки производится путем слияния с рисунком, толщиной 2 мм, полидиметилсилоксан (PDMS) диск только что очищенный кварц скольжения покрытия. PDMS диск содержит четыре 30 мкл прямоугольных камерах, к которым обращаются входе и выходе гибкие капилляры связано с резервуаром буфера и шприцевой насос, соответственно, для контролируемого потока буфера. Проточной ячейке поддерживается на ее обратной стороне на оконное стекло и помещен на заказ ячейкой содержащей водяным охлаждением термоэлектрический элемент для регулирования температуры.
- Для того, чтобы узорной PDMS диск, смешать 10 частей силиконового эластомера базу с 1 частью отвердителя, тщательно перемешать и оставить дегазации в течение 1 часа в вакууме.
- Осторожно вылейте смесь эластомера на микрожидкостных форму клетки. В нашем случае это 1 "кремниевой пластины с четырьмя полосами (1x10 1x10 4 х 3 х 300 мкм) из отрицательного фоторезиста. Оставьте это вылечить на горячей плите при температуре 70 ° С в течение двух часов.
- Тщательно очистите вылечить PDMS диск из форм использования лезвия бритвы. Предохранитель диска на 1''стекла (содержащий 8 х 2 мм в диаметре предварительно просверленные отверстия на обоих концах канала) плазмой окислительных обе поверхности в течение 30 секунд. Предохранитель стекла на плоской стороной диска PDMS (сторона не содержащие каналов).
- Вставьте 2-дюймовый длинный гибкий плавленого кварца капиллярную трубку через отверстие каждый стакан окна, пока не достигнет канала. Вставка иглы, а затем следующие с капиллярной могут облегчить этот процесс. Уплотнение стекла отверстия с помощью быстрого отверждения силиконового литья соединения, такие как Kwik-Cast.
- Промыть каналов с этанолом и водой, и плазменно-активировать камере вместе с только что очищенный, 1-дюймовый круговой кварца скольжению покрытие в течение 30 секунд. Мы предлагаем очистку это покрытие скольжения использованием пираньи *. Предохранитель покровным стеклом в сторону ячейки, содержащей каналы, герметизация камер.
- Оставьте собрал ячейки вылечить в течение ночи при комнатной температуре.
* Piranha является решением H 2 O 2 и H 2 SO 4 в 1:2.5 пропорциях. Для очистки крышка скользит, погрузите их в пираний при 90 ° С в течение 20 мин.
2 - активация поверхности для иммобилизации молекул
Для исследования нуклеиновых кислот, Простейшая схема поверхности иммобилизации состоит из первого слоя стекла или кварца скольжения накрыть биотинилированного бычьего сывороточного альбумина (БСА), а затем стрептавидином. Это позволяет биотинилированного образца будет заблокирован с высокой специфичностью в течение нескольких дней при комнатной температуре.
- Подключите гибкий шланг с капиллярами для легкой инъекции буфера с помощью шприца и иглы.
- Inject раствор 0,1 мг / мл биотинилированного БСА в буфере (10 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 50 мМ NaCl, фильтруется с помощью фильтра 0,02 мкм) в канал и инкубировать в течение 30 мин.
- Поток 300-500 мкл буфера для удаления любых свободных биотинилированного BSA из канала, стараясь не поймать пузырьки воздуха внутри камеры.
- Inject раствор 0,1 мг / мл в буфере стрептавидином и инкубировать в течение 15 мин. Затем повторите шаг 3.
- Поток через 3-5 рМ решение биотинилированного образца. Выполните проверку поверхности и проверить освещение флуоресцентными молекулами. При необходимости увеличивают концентрацию образца для получения лучшего покрытия сетей. Инкубируйте в течение 10 минут и повторите шаг 3.
Микрожидкостных ячейка монтируется на этапе моторизованных ху позволяет грубые (до 25 мм), движения с помощью оптически закодированные двигатели постоянного тока, и мелкие (1 нм) движение с помощью двух замкнутых пьезоэлектрические приводы (Physik Instrumente модели М-014 или аналогичные). Это можно сделать либо до, либо после активации поверхности образца иммобилизации.
3 - Подготовка буфера изображений (IB)
IB состоит из кислорода ферментативной очистки системы и триплетного тушителя, таких как Trolox. С IB сбрасывается через постоянно на ночь, не менее 10 мл должны быть подготовлены заранее.
- Подготовка 10 мл 0,8% м / о D-глюкозы, по крайней мере 35 мМ Трис-HCl рН 8,0 и 50 мМ NaCl в деионизованной воде. Чем выше концентрация буфера важно по двум причинам: растворение Trolox будет окисляться решение, и ферментативной реакции будет также ниже рН раствора с течением времени. Так как это решение имеет длительный срок хранения может быть сохранен как маточный раствор.
- Растворите 5 мг Trolox в буфер, подготовленный в шаге 1 на вортексе в течение нескольких минут, а затем встряхивания в течение> 10 мин. Trolox не очень хорошо растворяется в воде при рН> 7, поэтому не спешите этого шага. Фильтры решения с использованием 0,2 мкм и оставить дегазации в вакууме в течение 10 минут.
- Подготовка "gloxy" ферментативных решение путем смешивания 60 мкл Уотг, 20 мкл 5X буфера, 20 мкл каталазы, 1 мг оксидазы глюкозы и 100 мкл 10 мг / мл BSA. Фильтры решения с использованием 0,22 мкм центрифуги фильтр.
- Аккуратно перемешайте буфер, начиная с шага 2 с "gloxy" решение с шага 3 избегая образования воздушных пузырей.
- Поток IB через канал с постоянной скоростью 5 мкл / мин с использованием механических насосов шприца для контроля расхода. Bubble аргона в IB резервуар для предотвращения кислородом воздуха от повторного растворения в буфер.
Сканирования поверхности, локализацию молекулы и приобретение одного следы интенсивности молекула находится под контролем программы LabView, которая позволяет автоматизированного сбора данных 1. Программа сканирует 20x20 мкм 2 областях на 0,2 мкм резолюцию, со скоростью 0,1 мкм / мс. Данные сразу же обрабатываются для получения интенсивности-взвешенный расположение всех пикселей выше фона имеет значение. После иммобилизованных молекул будут найдены, они перемещаются по одному в конфокальной объема и интенсивности донора и акцептора флуорофора регистрируются как функция времени, пока обе photobleach флуорофоров. Стадия затем запрограммировать на переход к новой происхождения 100 мкм далеко, и процесс сканирования повторяется.
4 - представитель Результаты
Ниже приведены некоторые изображения, показывающие собравшихся микрожидкостных клетке до активации поверхности и после того, установлен на микроскоп готов к молекуле иммобилизации. Если канал успешной активации, сканирует поверхность должна быть похожа на сканирование показано ниже показаны выбросы доноров красителя (зеленый) и акцепторных (красный) после прямого возбуждения донора. Эти молекулы перемещаются по одному в зондировании объем и флуоресценции регистрируется в течение долгого времени, пока обе photobleach красители, как показано на одном следы молекулы. Из следов подобных можно получить FRET эффективность, которая сообщает о мгновенной донорно-акцепторных разделение, которое в свою очередь, используется для изучения структуры и динамики молекул биологического интереса.
Рисунок 1: микрожидкостных клетка с четырьмя каналами, каждый из которых вход / выход капилляров. Пожалуйста, нажмите здесь , чтобы видеть большую версию рисунке 1.
Рисунок 2: Сотовый установлен на микроскоп готов к измерениям. Пожалуйста, нажмите здесь , чтобы видеть большую версию рисунке 2.
Рисунок 3: Настройка для SM-FRET измерений. Пожалуйста, нажмите здесь , чтобы видеть большую версию рисунке 3.
На рисунках 4 и 5: Красный и зеленый канал сканирования поверхности иммобилизованных FRET молекул, возбужденных с зеленым лазером. Пожалуйста, нажмите, чтобы увидеть большую версию рисунке 4 , или рисунке 5 .
6, 7, 8 и 9: Интенсивность траектории донора (зеленый) и акцепторных (красный) флуорофоров маркированы, чтобы молекулы ДНК 8, 10, 16 и 18 пар оснований друг от друга. Пожалуйста, нажмите, чтобы увидеть большую версию рисунок 6 , рисунок 7 , рисунок 8 , или на рисунке 9 .
Discussion
Хотя приведенный выше протокол был оптимизирован для нашей конкретной системы и конкретного выбора красителей (ПМР и ATTO647N), это отнюдь не только доказал методом. В последнее время альтернативные поглощающего кислород система, состоящая из протокатеховая кислоты (PCA) / protocatechuate-3 ,4-dioxygenase (PCD) было показано, что увеличение фотостабильности некоторых красителей 4. Кроме того, другие триплетного состояния жажду, таких как β-меркаптоэтанола (BME) может быть использован вместо Trolox, хотя они не могут подавить длительного мигание некоторых красителей, в частности Cy5 5.
Хотя иммобилизации с помощью биотин-стрептавидин-биотинилированного бычьего сывороточного альбумина (БСА) является предпочтительным выбором для исследования нуклеиновых кислот, полиэтиленгликоля (PEG)-покрытием лучше подходит для исследования белков, поскольку она препятствует неспецифической адгезии 1. Кроме того, к югу от дифракционной пузырьки размер может быть использован для инкапсуляции биомолекулы интересов в случаях, когда это может повлиять на поверхности взаимодействия 6.
В этой статье мы использовали конфокальной установка оснащена силиконовыми лавинных фотодиодов приобрести флуоресценции следы интенсивности. Этот протокол работает одинаково хорошо с полным внутренним отражением флуоресцентный микроскоп (TIRF), оснащенных ПЗС-камер. Независимо от того, использовали микроскопию, см-FRET можете сообщить по пространственным разрешением приближается ангстрем, когда донор и акцептор сигнал должным образом исправлены 7.
Acknowledgments
Мы благодарим Чандран Sabanayagam за помощь в разработке системы, Джошуа Эдель за советом по проектированию микрожидкостных устройств и сотрудников Rowland института Гарвардского университета для обработки деталей установки. Мы признаем, полезные обсуждения с членами группы Меллер по адресу Rowland института и Бостонского университета, и члены группы Т. Ха "с при UIUC для полезной информации. Наконец, мы ценим финансовой поддержке Национального научного фонда (PHY-0701207) и Национального Института Здоровья (GM075893).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fused silica capillary tubing | Polymicro Technologies | TSP150375 | |
| Fused silica cover slip | Esco Products | R425000 | |
| Tubing | Diba Industries | ||
| Biotinylated BSA | Sigma-Aldrich | A8549 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9085 | |
| Streptavidin | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 0021122 | |
| Sylgard 184 Elastomer Kit | Dow Corning | 3097366-1004 | Silicone Elastomer Kit |
| Trolox | Aldrich | 238813 | |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C3155 | |
| Glucose Oxidase | Sigma-Aldrich | G2133 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| Kwik-Cast Sealant | World Precision Instruments, Inc. | Kwik-Cast | Silicone Casting Compound |
References
- Selvin, P. R., Ha, T. Single-Molecule Techniques, a Laboratory Manual. CSHL Press. , (2008).
- Sabanayagam, C. R., Eid, J. S., Meller, A. High-throughput scanning confocal microscope for single molecule analysis. Applied Pys. Letters. , 84-87 (2004).
- Sabanayagam, C. R., Eid, J. S., Meller, A. Using Fluorescence resonance energy transfer to measure distances along individual DNA molecules: Corrections due to nonideal transfer. J. Chem. Phys. 122, 61103-61105 (2004).
- Echeverra, A., Aitken, C., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An Oxygen Scavenging System for Improvement of Dye Stability in Single-Molecule Fluorescence Experiments. Biophysical Journal. 94, 1826-1835 (2008).
- Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. Nonblinking and long-lasting single molecule fluorescence imaging. Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).
- Boukobza, E., Sonnenfeld, A., Haran, G., Puglisi, J. D. Immobilization in Surface-Tethered Lipid Vesicles as a New Tool for Single Biomolecule Spectroscopy. J. Phys. Chem. 105, 12165-12170 (2001).
- Di Fiori, N., Meller, A. Article in preparation. , Forthcoming.
