Summary
هذا البروتوكول فيديو يوضح تقنية الاسكواش المستخدمة في المختبر لإعداد يوهانسن
Abstract
وقد تم منذ فترة طويلة ذبابة الفاكهة المفضلة لنظام نموذجي لدراسة العلاقة بين لونين وتنظيم بنية الجينات بسبب المزايا التي يقدمها الخلوي العملاقة اللعابية الكروموسومات كثور الخيوط الصبغية الغدة اليرقات طور مرحلي الثالثة. في هذا النسيج الكروموسومات الخضوع عدة جولات من تكرارها في حال عدم وجود انقسام الخلايا مما يؤدي إلى حوالي 1000 نسخة. الحمض النووي لا يزال الانحياز بعد كل دورة تنسخي مما أدى إلى تضخم كبير الكروموسومات التي توفر فرصة فريدة لربط مورفولوجيا لونين مع توطين للبروتينات محددة. وبالتالي ، كان هناك مستوى عال من الاهتمام في تحديد تعديلات جينية موجودة في جينات مختلفة وفي مراحل مختلفة من عملية النسخ. أداة مهمة لمثل هذه الدراسات هو وضع العلامات من الكروموسومات كثور الخيوط الصبغية مع الأجسام المضادة للانزيم ، وعامل النسخ ، أو تعديل هيستون في المصالح. هذا البروتوكول فيديو يوضح تقنية الاسكواش المستخدمة في المختبر يوهانسن لإعداد ذبابة الفاكهة الكروموسومات كثور الخيوط الصبغية لوصفها الأضداد.
Protocol
ويتم تكييف بروتوكول التالية للإعداد للاسكواش كثور الخيوط الصبغية كروموسوم من الإجراء وصفها في يوهانسن وآخرون. (2009).
1. ثقافة يرقات ذبابة الفاكهة الثالث طور مرحلي
من أجل الحصول على الكروموسومات كثور الخيوط الصبغية الأمثل للاسكواش الاستعدادات العالية الجودة وشروط زراعة غير مزدحمة ضرورية (أي حوالي 20 مكان وضع البيض الذباب الإناث في مستوى 4 زجاجة الطيران "وتغيير قنينة جديدة كل يوم). حدد الأفراد بدانة من أول محصول من التسلق 3 طور مرحلي اليرقات في حين أنها لا تزال تتخبط ولكن فقط قبل pupation نحن الثقافة بشكل روتيني في 21 درجة مئوية ولكن 18 درجة مئوية وسوف تسفر بدانة الكروموزومات التي قد تكون أكثر ملاءمة لبعض الأغراض مثل على سبيل المثال عندما الفرقة / إنتربيرد مناطق تحتاج إلى تصور بدقة عالية.
2. مواد الاسكواش كثور الخيوط الصبغية
- ملقط تشريح دروموند (2)
- أطباق بتري (60 × 15 ملم)
- شرائح مجهرية بلوري (رقم فيشر 12-544-3) (بولي يسين المغلفة)
- 22 × 22 مم تغطية زلات رقم 15 (فيشر رقم 12 - 520B) (مغلفة Sigmacote ؛ سيغما # SL2)
- رقم 22 × 40 ملم زلات تغطية 15 (فيشر رقم 12 - 530B)
- كيم مناديل
- المرحلة المجهر يتناقض مع الهدف 20X
- ديوار الصغيرة (على سبيل المثال ، وقارورة فراغ أو زجاجة الترمس)
- ملقط طويل
- شفرات حلاقة
- Coplin جرة
- خادمة المطاط أو علبة تثبرور (أو علبة اغلاقها باحكام ما يعادلها)
- Parafilm (مقطعة إلى مربعات 22 ملم)
- أوزان 175 غرام
3. مثبتات والحلول
- 5X الأسهم الفورمالديهايد. يعد حلا جديدة من 0.74 غرام. بارافورمالدهيد في مل من 4.0 درهم و 2 O مع 28 ميكرولتر من KOH 1N. الحارة إلى 65 درجة مئوية إلى حل بارافورمالدهيد وتخزينها ثم على الجليد.
- تثبيتي 1. يعد حلا جديدة من برنامج تلفزيوني 0.5 مل 10X ، 50μl تريتون X - 100 ، 3.45 مل درهم 2 O و 1.0 مل من الأسهم الفورمالديهايد 5X. الحارة لتفريق تريتون X - 100 واستخدامها في حدود 1 ساعة.
- تثبيتي 2. يعد حلا جديدة من 1.5 مل O 2 درهم ، 2.5 مل حمض الخليك الجليدية ، و 1.0 مل من المخزون واستخدام الفورمالدهايد 5X في حدود 1 ساعة.
- Lactoacetic حامض الحل. إعداد محلول حامض اللبنيك 1 مل ، 2 مل 2 O درهم ، و 3 مل حامض الخليك.
4. كثور الخيوط الصبغية إعداد كروموسوم الاسكواش :
- شطف اليرقات بالماء ونقل لبرنامج تلفزيوني في نسيج الثقافة طبق لتشريح.
- فهم غيض من الفم السنانير مع زوج واحد من الملقط ، عقد الجسم حوالي 2 / 3 من الطريق نزولا مع الزوج الآخر ، وسحب السنانير على الفم بحيث تتعرض الغدد اللعابية. فصل الغدد اللعابية من الدماغ والعين antennal أقراص ، وبعيدا عن تشريح الجسم من الدهون والأنسجة الأخرى المرتبطة بها أي من الغدد.
- إضافة 200 microliters من 1 إلى تثبيتي أول بئر للشريحة two الاكتئاب جيدا و200-300 microliters من 2 مثبت لاثنين ايضا. نقل زوج واحد من الغدد اللعابية في وقت لتثبيتي 1 في بئر واحدة لاحتضان مقدار الوقت اللازم لحاتمة الهدف ، وعادة حوالي 1-2 دقائق. (ملاحظة : بعض الحواتم ، مثل معظم تعديلات بسيطة ، قد تحتاج إلى 5 دقائق أو أطول التثبيت).
- ملقط به نقل الغدد اللعابية إلى 2 في 2 مثبت جيدا واحتضان لمدة دقيقتين.
- نقل إلى الغدد 10-30 ميكرولتر من محلول حمض Lactoacetic على ساترة a Sigmacoted نظيفة. انخفاض بلطف شريحة مجهر متعدد الليزين المغلفة على وساترة ، وبدون الضغط العمودي ، التقط ساترة حتى الغدد ما بين الشريحة وساترة ل. تيسير فورا تحلل الخلايا والكروموسومات التي تنتشر استيعاب بعناية ساترة مع ملقط على حافة واحدة وتتحرك بلطف مرة أخرى بشكل طفيف وإيابا ، في محاولة للحد من أي ضغط عمودي على الأنسجة. بدلا من استخدام الجانب ممحاة قلم رصاص أو حتى الإصبع لتحريك بلطف ساترة ذهابا وإيابا. علما بأن أي تأخير في نقل ساترة ذهابا وإيابا من المرجح أن يتضاءل انتشار الأسلحة الكروموسومات لأنها سوف تميل الى ان تصبح أكثر جمودا عند التعرض لمحلول حمض Lactoacetic. تغيم الحل هو غالبا ما يكون مؤشرا جيدا لفصل الخلايا. التنصت بلطف ساترة بشكل غير مباشر (لتجنب الضغط العمودي) مع الجانب ممحاة قلم رصاص في أوقات قليلة قد تساعد أيضا في نشر الكروموسومات.
- فحص الأنسجة على الفور تحت المجهر مرحلة يتناقض مع هدف 40X 20 أو لتحديد ما إذا كانت الصبغيات بشكل جيد الانتشار.
- عندما نشر الكروموسومات يكون كافيا وتعيين الشريحة مع الجانب ساترة الخناق على كومة من مناديل وكيم نظيفة. المركز الثاني على رأس كيم يمسح وتتسطح الكروموسومات عن طريق وضع الإبهام على حيث يتم وضع ساترة وضغط بشدة ، وتجنب أي تحرك الأفقي للساترة أن القصالكروموسومات.
- فحص الشريحة مرة أخرى تحت المجهر لتحديد ما إذا كان إعداد مناسبة لهذا الغرض المقصود. إذا تحركت بشكل ملحوظ الكروموسومات على سحق ، واستخدام أقل حجم من محلول حمض Lactoacetic الخاص في الأعمال التحضيرية اللاحقة. كرر الخطوات من 4،1-4،8 حتى تم الحصول على عدد كاف من الشرائح مناسبة. مكان أوزان 175 غرام على ساترة من الشرائح.
- ملء ديوار صغيرة (مثل زجاجة الترمس) مع النيتروجين السائل. باستخدام الملقط طويلة ، وتراجع الانزلاق الى السائل N 2 حتى توقف عن الغليان ، وإزالة الشريحة ، واستخدامها مباشرة على حافة شفرة حلاقة نظيفة في زاوية واحدة على الوجه قبالة ساترة. إذا كان سيتم استخدام الشريحة على الفور ، ومكان في جرة Coplin مع برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية. بخلاف ذلك جمع الشريحة في جرة مليئة Coplin الايثانول 95 ٪. دراسة ساترة مرة واحدة في الصقيع ومصعد بعيدا للتأكيد على أن الأنسجة انضمت إلى الشريحة ، ولم يبقى مع ساترة. أكرر مع بقية الشرائح حتى يتم تخزين كافة الشرائح في أي برنامج تلفزيوني (للاستخدام في غضون عدة ساعات) أو الإيثانول (للتخزين على المدى الطويل).
ممثل النتائج
الخطوة الأولى الحاسمة للحصول على ارتفاع الاسكواش كثور الخيوط الصبغية إعداد الجودة هي أن تنمو اليرقات الدهون مع كبير نوى الغدة اللعابية. والثاني هو أسلوب جيد للإجراءات نشر ، والذي قد يستغرق بعض الممارسات. طرف واحد لتحسين نجاح نشر هو العثور على كمية ضئيلة من محلول حمض lactoacetic خلال سحق الخطوة. وهذا يكفي تعزيز انتشار الصبغيات دون توليد القوى المفرطة التي يمكن أن تدفق الأسلحة غسل كروموسوم بعيدا. ومن الجدير بالذكر أيضا أن أي تأخير في نقل ساترة ذهابا وإيابا سوف يقلل انتشار الأسلحة الكروموسومات لأنها تصبح أكثر جمودا عند تعرضها للحمض Lactoacetic الحل.
إذا كان كل شيء على ما يرام ، يجب أن يكون هناك العديد من الكروموسومات كثور الخيوط الصبغية انتشار جيدا. ويظهر الشكل 1 مثالا على إعداد مثل هذا المسمى مع علامة ضعف للمناطق الخضراء في إنتربيرد مع وجود بقع الصبغة التي تجمعت في المناطق الزرقاء. إذا تم الحصول على نشر غير كافية ، فإن الصبغيات تبدو وكأنها كرات صغيرة ، كما هو مبين في الشكل 2. من ناحية أخرى ، إذا كان الكثير من الانتشار قد حدث ، فإن chomosomes تكون رقيقة جدا وطويلة أو في بعض الحالات مجزأة الى قطع صغيرة كما هو مبين في الشكل 3.
الرقم الاسكواش كثور الخيوط الصبغية 1. إعداد المسمى مزدوجة مع الأجسام المضادة للكيناز H3S10 الشبكة الاسلامية الليبرالية هيستون - 1 (باللون الأحمر) وهويشت (الأزرق).
كثور الخيوط الصبغية الاسكواش الرقم 2. مع انتشار غير كافية.
الشكل 3. الاسكواش كثور الخيوط الصبغية مع الكثير من الانتشار.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
إدراج الأحماض الخل واللبن في البروتوكولات التقليدية التثبيت الاسكواش يسهل على حد سواء ، والقرار إنتربيرد الذراع الكروموسومات نشر ولكن للأسف بعض الحواتم لا ينجو من هذا العلاج. مثال على مثل هذا هو حاتمة H3S10ph (تساى وآخرون ، 2008). منذ حامض العلاج أيضا لديه عيب أن يروي مضان المتأصلة في GFP الموسومة البروتينات ، DiMario وآخرون. (2006) وضعت مؤخرا الفورمالديهايد المستندة إلى تقنية "الاسكواش الخالية من المواد الحمضية" التي تسمح لرؤية مباشرة من البروتين GFP الانصهار في الكروموسومات كثور الخيوط الصبغية GFP الضد دون وضع العلامات وكذلك للكشف عن الأجسام المضادة لحمض حساسة الحواتم. موصوفة مزيد من التعديلات لهذا الإجراء بالتفصيل في يوهانسن وآخرون. (2009). ويرد حمض الثابتة ممثل إعداد الاسكواش كثور الخيوط الصبغية المسمى مزدوجة مع الأجسام المضادة للكيناز H3S10 الشبكة الاسلامية الليبرالية - 1 هيستون وهويشت في الشكل. 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
نشكر السيدة ف Lephart لصيانة المخزونات يطير وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية الصحية للحصول على منحة (GM62916) والمؤسسة الوطنية للعلوم منح (MCB0817107).
References
- Cai, W., Bao, X., Deng, H., Jin, Y., Girton, J., Johansen, J., Johansen, K. M. RNA polymerase II-mediated transcription at active loci does not require histone H3S10 phosphorylation in Drosophila. Development. 135, 2917-2925 (2008).
- DiMario, P., Rosby, R., Cui, Z. Direct visualization of GFP-fusion proteins on polytene chromosomes. Dros. Inf. Serv. 89, 115-118 (2006).
- Johansen, K. M., Cai, W., Deng, H., Bao, X., Zhang, W., Girton, J., Johansen, J. Methods for studying transcription and epigenetic chromatin modification in Drosophila polytene chromosome squash preparations using antibodies. Methods. 48, 387-397 (2009).
