Antikor Etiketleme Drosophila politen Kromozom kabak hazırlanması

Summary

Bu video protokol hazırlamak için Johansen laboratuvarında kullanılan kabak tekniği göstermektedir.

Abstract

Drosophila uzun, kromatin yapısı ve üçüncü instar larvaların dev tükürük bezi politen kromozom tarafından sağlanan sitolojik avantajları nedeniyle gen regülasyonu arasındaki ilişkiyi çalışmak için favori bir model sistem olmuştur. Bu doku kromozomların yaklaşık 1000 kopya yol açan hücre bölünmesi yokluğunda çoğaltma çok sayıda mermi uğrarlar. DNA spesifik protein lokalizasyonu ile kromatin morfolojisi ilişkilendirmek için eşsiz bir fırsat sunan büyük ölçüde genişlemiş kromozom sonuçlanan her replikatif döngüsü sonra dizilen kalır. Sonuç olarak, farklı genlerin epigenetik değişiklikleri tanımlamada ve transkripsiyon sürecinin farklı aşamalarında yüksek düzeyde ilgi olmamıştır. Bu tür çalışmalar için önemli bir araç politen kromozom enzim antikorları ile etiketleme, transkripsiyon faktörü, ya da ilgi histon modifikasyonu. Bu video protokolü antikor etiketlenmesi için Drosophila politen kromozom hazırlamak için Johansen laboratuvarında kullanılan kabak tekniği göstermektedir.

Protocol

Politen kromozomu squash hazırlanması için aşağıdaki protokol Johansen ve ark açıklanan prosedür uyarlanmıştır. (2009).

1. Üçüncü instar Drosophila larvaları Kültür

Yüksek kaliteli squash hazırlıkları için optimal politen kromozom elde etmek için, bulursunuz kültür koşullarında (yani, yer yaklaşık 20 yumurta döşeme standart bir 4 "sinek şişe ve değişim her geçen gün yeni bir şişe içinde erkek sineklerin) seçin şişman bireylerin temel hala dolaşıp ama pupa devresi hemen önce ise 3. instar larvaları tırmanma ilk ürün. rutin kültür 21 ° C, ancak 18 ° C gibi bazı amaçlar için, örneğin daha uygun olabilir şişmandır kromozom verecektir grup / bantlar bölgelerde yüksek çözünürlükte görüntülenir gerekir.

2. Politen kabak malzemeleri

• Drummond diseksiyonu forseps (2)
• Petri kapları (60 x 15 mm)
• Buzlu mikroskop lamı (Fisher No 12-544-3) (poli-lizin kaplı)
• 22 x 22 mm No: 15 kapak fişleri (Fisher No 12-520B) (Sigmacote ile kaplı; Sigma # SL2)
• 22 x 40 mm No 15 kapak fişleri (Fisher No 12-530B)
• Kim-mendil
• 20X hedefi ile faz kontrast mikroskobu
• Küçük Dewar (örneğin, vakum şişesi veya termos şişesi)
• Uzun forseps
• Tıraş bıçağı
• Coplin Kavanoz
• Lastik-Maid veya Tupperware tepsi (veya eşdeğeri yapışmalı, tepsi)
• Parafilm (22 mm kareler halinde kesilmiş)
• 175 g ağırlıkları

3. Fiksatifler ve çözümler

1. 5X formaldehit stok. 0,74 g taze bir çözüm hazırlayın dH ₂ O 4.0 ml ve 28 ul 1N KOH paraformaldehid. Sıcak - 65 ° C paraformaldehid çözülür ve ardından buz üzerinde saklayın.
2. Sabitleme 1. 5X formaldehit stoku 0.5 ml 10X PBS, 50μl Triton X-100, 3.45 ml dH ₂ O ve 1.0 ml taze bir çözüm hazırlayın. Triton X-100 1 saat içinde dağıtmak ve kullanmak için ısıtın.
3. Sabitleme 2. 1.5 ml dH ₂ O, 2.5 ml Asetik Asit, 1.0 ml ve 1 saat içinde 5X formaldehit stok ve kullanımı yeni bir çözüm hazırlayın.
4. Lactoacetic asit solüsyonu. 1 ml laktik asit, 2 ml dH ₂ O, 3 ml asetik asit çözeltisi hazırlayın.

4. Politen kromozomu squash hazırlığı:

1. Larvaları su ile durulayın ve diseksiyon için bir doku kültürü çanak PBS transfer.
2. Ağız forseps bir çift kanca ucu tutun, diğer çifti ile yol aşağı yaklaşık 2 / 3 vücudu tutun, ve ağız çekin tükürük bezleri maruz kalan kanca. Beyin tükürük bezleri ve göz antennal diskler ayırın ve yağ bezlerinin vücut ve herhangi bir diğer ilgili dokuların uzak teşrih.
3. De ilk iki sıra depresyon slayt ve 200-300 mikrolitre Sabitleme 2 sıra iki Sabitleme 1 200 mikrolitre ekleyin. Bir anda tükürük bezlerinin bir çift iyi bir Sabitleme 1 Transferi ve hedef epitop için gerekli süreyi, genellikle 1-2 dakika inkübe edin. (Not: histon modifikasyonları çoğu gibi bazı epitoplar, 5 dakika veya daha uzun fiksasyon gerekebilir.)
4. Kullanarak forseps Sabitleme 2 tükürük bezlerinde iyi 2 transfer ve iki dakika boyunca inkübe.
5. Bezleri, temiz bir Sigmacoted lamel Lactoacetic asit çözeltisi 10-30 ul aktarın. Lamel üzerine hafifçe polylysine kaplı bir mikroskop lamı alt ve bezleri slayt ve lamel arasındaki böylece dikey basınç uygulamadan, lamel alıp hemen bir kenarına özenle forseps ile lamel tutarak yayılan hücre lizis ve kromozomal kolaylaştırmak ve yavaşça dokusu üzerinde herhangi bir dikey basınç en aza indirmek için çalışıyor, biraz ileri ve geri hareket. Alternatif lamel yavaşça ileri ve geri hareket ettirmek için bile bir kalem silgi tarafı ya da bir parmak ucu kullanın. Lamel ileri ve geri hareket eden herhangi bir gecikme Lactoacetic asit çözeltisi maruz kalma üzerine daha sert hale eğiliminde olacaktır kromozomal silahların yayılmasını azaltmak için muhtemel olduğunu unutmayın. Çözüm bulanıklığı genellikle hücre ayrılması iyi bir göstergedir. Birkaç kez hafifçe kromozomal yayılmasını yardımcı bir kalem silgi tarafı da (dikey basınç önlemek için) oblik lamel dokunarak.
6. Hemen kromozom iyi yayılmış olup olmadığını belirlemek için 20 veya 40X amacı ile bir faz kontrast mikroskop altında dokuyu inceler.
7. Yayılmasını kromozomal yeterli olduğundan, temiz Kim-mendil bir yığın aşağı lamel yan slayt. Yerleştirin ikinci bir üst Kim silin ve kayma olur lamel herhangi bir yatay hareket kaçınarak, lamel konumlandırılmış ve sıkıca basarak üzerinde baş parmağınızı koyarak kromozom düzleştirmekKromozomlar.
8. Hazırlık amacı için uygun olup olmadığını belirlemek için mikroskop altında tekrar slayt inceleyin. Kromozom Ezici üzerine anlamlı hareket varsa, sonraki hazırlıkları Lactoacetic asit çözeltisi daha az hacimli kullanın. Yeterli sayıda uygun slaytlar elde edilene kadar tekrarlayın 4,1-4,8 adımları. Slaytların lamel üzerine 175 g ağırlık yerleştirin.
9. Küçük bir Dewar (örneğin, termos şişe) sıvı nitrojen ile doldurun. Uzun bir pens kullanarak, kaynama duruncaya kadar sıvı N ₂ içine daldırma slayt, slayt kaldırmak ve lamel hemen çevirmek için bir köşesinde temiz bir jilet kenarı kullanabilirsiniz. 4 PBS ile Coplin kavanoza slayt hemen kullanılacaksa, yer ° C Aksi takdirde,% 95 etanol ile dolu bir Coplin kavanoza slayt toplamak. Don doku slayt yapıştırılır ve lamel kalır olmadığını teyit etmek için uzakta süblime sonra lamel inceleyin. Slaytlar geri kalan tüm slaytlara PBS (birkaç saat içinde kullanılmak için) veya etanol (uzun süreli depolama için) saklanır kadar tekrarlayın.

Temsilcisi Sonuçlar

, Yüksek kalite politen squash hazırlık elde etmek için ilk kritik adım, büyük tükürük bezi çekirdeklerinin yağ larvaları büyümektir. Ikinci yayma işlemi ile iyi bir tekniği, biraz pratik gerektirebilir. Bir ucu geliştirilmiş yayma başarısı için Ezici adım sırasında lactoacetic asit çözeltisi minimal volüm bulmak için. Bu kromozom yayılmasını yeterli uzaklıkta kromozom kolları yıkamak aşırı akışı güçleri oluşturmadan teşvik edecektir. Ayrıca Lactoacetic asit çözeltisi maruz kaldığında daha sert hale lamel ileri ve geri hareket eden herhangi bir gecikme, kromozom silahların yayılmasını azaltacaktır fazlalaştı.

Her şey yolunda giderse, çok sayıda iyi yayılır politen kromozom olması gerekir. Şekil 1 çift yeşil bantlar bölgeler için bir marker ve bir boya ile etiketlenmiş, böyle bir hazırlık bir örnek gösterir lekeleri mavi bantlı bölgelerde. Yetersiz yayılan elde edilirse, kromozom, Şekil 2'de gösterildiği gibi küçük toplar gibi görünecektir. Öte yandan, çok fazla yayılmasını oluştu, chomosomes çok ince ve uzun veya Şekil 3'te görüldüğü gibi küçük parçalar halinde parçalanmış bazı durumlarda olacaktır.

Şekil 1 politen squash hazırlık JIL-1 histon H3S10 kinaz (kırmızı) Hoechst (mavi) iki antikor ile etiketlenir.

Şekil 2 yetersiz yayılıyor. Politen squash.

Şekil 3 çok fazla yayılmasını ile politen squash.

Discussion

Geleneksel kabak tespit protokollerinde asetik ve laktik asitler dahil, yayılmasını bantlar çözünürlük ve kromozomal kol kolaylaştırır ama ne yazık ki, bazı epitoplar bu tedavi hayatta yok. Böyle bir epitopu bir örnek H3S10ph (Cai ve ark, 2008). Asit tedavisi de GFP etiketli proteinler, DiMario ve ark doğasında floresan doyurur dezavantajı vardır. (2006) son zamanlarda aside duyarlı epitoplar antikor tespiti için GFP-antikor etiketleme gibi politen kromozom GFP-füzyon proteinine doğrudan görünüm için izin tabanlı bir formaldehit "asit-squash tekniği" geliştirdi. Bu işlem için değişiklikler, daha ayrıntılı olarak Johansen ve ark açıklanmıştır . (2009). JIL-1 histon H3S10 kinaz ve Hoechst çift antikor ile etiketlenmiş bir temsilci asit sabit politen squash hazırlık Şekil. 1.