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Abstract

Source : Koemans, T. S., et al. Le conditionnement de la parade nuptiale comme mesure de l’apprentissage et de la mémoire. J. Vis. Exp. (2017).

Cette vidéo décrit un test de conditionnement classique qui teste l’apprentissage et la mémoire chez la drosophile, appelé conditionnement de parade nuptiale. L’essai est basé sur la réduction de la parade nuptiale des mâles après avoir subi un rejet par une femelle préaccouplée non réceptive. L’exemple de protocole montre une configuration pour la procédure qui peut être utilisée pour évaluer la mémoire à court et à long terme.

Protocol

Ce protocole est un extrait de Koemans et al., Drosophila Courtship Conditioning As a Measure of Learning and Memory, J. Vis. Exp. (2017).

REMARQUE : Dans le protocole décrit ci-dessous, une réplique de la collecte, de la formation et des tests est décrite. Afin de tester la reproductibilité des résultats, ces étapes doivent être répétées en parallèle, sur plusieurs jours et avec des groupes distincts de mouches (tableau 1). Le protocole est basé sur un cycle de vie de 10 jours, de l’œuf à l’adulte, ce qui est normal lorsque les mouches sont élevées dans des conditions constantes de 25 °C, 70 % d’humidité et un cycle lumière/obscurité de 12 heures. Tous les aspects de ce protocole supposent que les conditions sont maintenues constantes tout au long de l’essai. Les heures sont indiquées comme des heures avant l’allumage des lumières (BLO) ou après l’allumage des lumières (ALO) dans l’incubateur, car elles peuvent être réglées de manière pratique en fonction de l’heure de la journée préférée du chercheur. N’utilisez le gaz_CO2 que pour la collecte initiale des mouches mâles naïves et pour la collecte des femelles préaccouplées. Ce protocole de conditionnement de la parade nuptiale est composé des étapes suivantes :

1. Etablissement de cultures de collection de femelles préaccouplées
2. Etablissement de cultures pour la collecte de sujets d’essai masculins
3. Préparation des blocs d’habitation
4. Mise en place de flacons d’accouplement pour la production de femelles préaccouplées normalisées
5. Collection de sujets de test masculins
6. formation
7. test
8. Analyse des données vidéo et statistiques

1. Etablissement des cultures de collection de femelles préaccouplées

1. Préparez des aliments puissants. Faire bouillir 0,8 % (p/v) d’agar-agar, 8 % (p/v) de levure, 2 % (p/v) d’extrait de levure, 2 % (p/v) de peptone, 3 % (p/v) de saccharose, 6 % (p/v) de glucose, 0,05 % (p/v) de MgSO₄ et 0,05 % (p/v) de CaCl₂ dans de l’eau pendant 15 min. Laissez la solution refroidir à 70 °C avant d’ajouter 0,05 % (p/v) de méthylparabène (ATTENTION : toxique) et 0,5 % (v/v) d’acide propionique (ATTENTION : toxique). Bien mélanger en remuant tout en refroidissant davantage à 50 °C pour obtenir une solution homogène.
2. Avant que l’aliment ne se solidifie à température ambiante, ajoutez ~50 ml de powerfood dans chaque flacon en plastique de 175 ml. Laissez les aliments refroidir davantage. Fermez le flacon à l’aide d’un plug.
   REMARQUE : Powerfood est un mélange alimentaire spécialisé formulé spécifiquement pour la production d’un grand nombre de mouches, probablement en induisant la ponte des œufs. Powerfood n’est pas utilisé pour produire des mouches mâles qui seront utilisées pour l’analyse du comportement (étape 2) car le régime alimentaire atypique et la surpopulation potentielle pourraient influencer le développement.
3. Le jour -11 (tableau 1), commencer 5 à 20 cultures de type sauvage avec environ 60 à 100 mouches (un mélange de mâles et de femelles) dans des flacons d’aliments puissants ; ceux-ci seront utilisés à l’étape 4 pour produire des femelles préaccouplées standardisées. Ajoutez un papier filtre à chaque flacon pour augmenter la surface sur laquelle les larves peuvent se nymphoser ; Cela augmentera le nombre de mouches qui peuvent s’y enfermer.
4. Répéter périodiquement les étapes 1.1 à 1.3 tout au long de l’expérience afin d’obtenir suffisamment de mouches nouvellement fermées comme intrants pour « l’établissement de flacons d’accouplement pour la production de femelles préaccouplées normalisées » (étape 4).

2. Etablissement de cultures pour la collection de sujets de test masculins

1. Préparez des aliments normaux composés de 0,5 % (p/v) d’agar, de levure à 2,75 % (p/v), de farine de maïs à 5,2 % (p/v), de sucre à 11 %, de méthylparabène à 0,05 % et d’acide propionique à 0,5 % (p/v) dans de l’eau, comme décrit aux étapes 1.1 et 1.2. Fermez les flacons en plastique de 175 ml à l’aide d’un bouchon anti-mouches.
2. Le jour -10 (tableau 1), placer environ 10 à 20 mâles et environ 30 à 75 femelles vierges (tableau des matériaux et de l’équipement) dans chaque fiole de 175 mL contenant de la nourriture normale. Ajoutez un papier filtre pour augmenter la surface de nymphose et maximiser la productivité.
3. Établir de trois à six flacons de 175 mL par génotype pour obtenir le nombre requis de mâles du sujet d’essai.
   REMARQUE : D’autres flacons peuvent être nécessaires, en fonction de la productivité du génotype souhaité.

3. Préparation des blocs d’habitation (Figure 2A)

1. Faites fondre environ 50 ml de powerfood par bloc d’habitation au micro-ondes ou préparez-le frais.
2. Ajoutez 500 μL de powerfood dans chaque puits d’un bloc à fond plat de 96 puits à l’aide d’une pipette multidistributeur.
3. Laissez les aliments se solidifier à température ambiante.
4. Couvrez les blocs d’un film adhésif PCR et utilisez une aiguille pour faire au moins 4 trous par puits pour fournir de l’air frais aux mouches.
5. Afin de pouvoir ouvrir chaque puits, utilisez une lame de rasoir pour couper le film adhésif dans le sens de la longueur entre chaque rangée. Laissez le film intact à une extrémité du bloc.
6. Les blocs peuvent être conservés à 4 °C jusqu’à 2 jours.
   REMARQUE : Laissez les blocs se rééquilibrer à la température ambiante avant de les utiliser.

4. Etablissement des flacons d’accouplement pour la production de femelles préaccouplées standardisées

1. Le jour -1, retirer et jeter toutes les mouches adultes de type sauvage des cultures de collection de femelles préaccouplées à 2-5 h BLO.
2. Prélever les mouches à l’aide de l’aspirateur (Figure 2B) de ces flacons à intervalles de 2 à 3 heures (par exemple, à 30 min, 2,5 h et 5 h ALO) et les placer dans un nouveau flacon powerfood complété par une petite quantité de pâte de levure et de papier filtre.
3. Pour éviter l’encombrement et favoriser une atmosphère d’accouplement optimale, ne transférez pas plus de 150 à 200 mouches dans chaque nouveau flacon. Assurer l’accouplement de toutes les femelles en fournissant au moins 25 % de mâles. S’assurer qu’il y a suffisamment de femelles dans les flacons d’accouplement pour s’adapter à la taille de l’expérience.
   REMARQUE : Comme il s’agit d’une étape cruciale du protocole, assurez-vous que seules les mouches fraîchement enfermées et qu’aucune vieille mouche, larve ou nymphe n’est transférée dans le nouveau flacon d’accouplement.
4. Incuber ces « fioles d’accouplement » pendant quatre jours pour laisser suffisamment de temps à toutes les femelles pour s’accoupler.

5. Collection de sujets de test masculins

1. Le jour 1 (tableau 1) à 2-3 h BLO, utilisez du CO₂ pour retirer toutes les mouches adultes des flacons de collecte mâles (étape 2), mais laissez les autres mouches s’approcher au cours des prochaines heures.
2. Au cours des 5 à 6 prochaines heures, enlever les mouches nouvellement fermées toutes les 20 à 30 minutes à l’aide de CO₂ et placer chaque mâle dans un puits individuel du bloc d’habitation (étape 3) à l’aide de l’aspirateur (Figure 2B).
3. Refermez le puits avec le film adhésif PCR.
   REMARQUE : Il s’agit d’une étape cruciale du protocole. Les mâles doivent être collectés fréquemment. Les mâles collectés doivent être isolés dans le bloc d’habitation à peu près au moment de l’éclosion, lorsqu’ils présentent une pigmentation pâle et la présence du méconium dans l’abdomen translucide.
   REMARQUE : L’utilisation douce de l’aspirateur permet le transfert des mouches ; cependant, une utilisation inappropriée stressera les mouches, ce qui entraînera une variation dans le test (voir la discussion).
4. Essayez de collecter jusqu’à 48 mâles par génotype. Cela fournit un léger excédent par rapport au nombre maximal de mâles nécessaire à l’analyse des conditions naïves et entraînées, ce qui permet une certaine perte lors des étapes de transfert ultérieures.

6. Formation

1. Retirez les mouches du flacon d’accouplement (étape 4.2) à l’aide de CO₂ et séparez les femelles préaccouplées des mâles.
2. À l’aide de l’aspirateur, ajoutez une seule femelle anesthésiée et préaccouplée à chaque puits d’une rangée d’un nouveau bloc d’habitation.
3. À l’aide de l’aspirateur et sans anesthésie, transférez un mâle naïf individuel du bloc d’habitation mis en place à l’étape 5.2 vers le puits contenant une femelle préaccouplée. Une fois que le mâle est placé dans le puits, refermez immédiatement avec le film adhésif ; Ne laissez pas le mâle s’échapper.
   REMARQUE : Transférez les mouches mâles de l’aspirateur au bloc d’habitation en profitant de leur comportement naturel de « géotaxie négative ».
4. Répétez les étapes 6.2 et 6.3 jusqu’à ce qu’il y ait suffisamment de paires mâle-femelle établies. Idéalement, établissez 24 couples, deux rangées complètes d’un bloc d’hébergement, par génotype. Laissez les mâles naïfs restants dans le bloc d’habitation d’origine configuré à l’étape 5.2.
5. Laisser les couples mâle-femelle tranquilles pendant la période d’entraînement (Tableau 2, Figure 1B).
   REMARQUE : Pendant ce temps, le mâle fera la cour et sera rejeté par la femelle préaccouplée. Pour l’apprentissage et la STM, la période de formation est de 1 h et pour la LTM, la période de formation est de 7 à 9 h.
6. Terminez l’entraînement (Tableau 2, Figure 1B) en utilisant un aspirateur pour séparer doucement l’homme de la femelle préaccouplée ; n’utilisez pas d’anesthésie. Placez le mâle séparé dans un nouveau bloc d’habitation.
7. À l’aide de l’aspirateur, tous les mâles naïfs sont transférés doucement et sans anesthésie du bloc d’habitation mis en place à l’étape 5.2 vers un nouveau bloc d’habitation.
   REMARQUE : Cette étape est facultative pour le STM et l’apprentissage, mais elle est très importante pour le LTM car les mouches sont logées pendant 24 heures supplémentaires pour tester le LTM.
8. Pour STM et LTM, laisser les mâles se reposer pendant 1 h et ~24 h, respectivement (Tableau 2, Figure 1B) avant le test (étape 7).
9. Pour apprendre, testez immédiatement les mâles entraînés et naïfs (étape 7).

7. Tests

1. Prélever les mouches dans les flacons d’accouplement (étape 4.2) en utilisant du CO₂ et séparer les femelles préaccouplées des mâles.
2. Laissez les femelles se remettre de l’anesthésie pendant au moins 1 h dans un flacon contenant des aliments normaux.
3. Montez les magnétoscopes à l’avance (Figure 2C), afin d’avoir tout l’équipement prêt avant le début des tests.
4. Commencer les tests selon les différents calendriers d’apprentissage, de STM et de LTM (Tableau 2, Figure 1B). Effectuez des tests immédiatement après la formation pour l’apprentissage, 1 h après la formation pour STM et 24 h après la formation pour LTM.
5. À l’aide de l’aspirateur, transférez doucement un mâle du bloc d’habitation au repos ou du bloc d’habitation d’entraînement si l’apprentissage est testé (étape 6.7, dressé ; étape 6.8, naïf) dans une moitié d’une arène de parade nuptiale avec le séparateur fermé (Figure 2D ; voir le fichier S1 pour un plan de construction).
   REMARQUE : L’utilisation du comportement naturel de « géotaxie négative » devrait être suffisante pour transférer les mouches mâles de l’aspirateur à l’arène nuptiale.
6. Déplacez rapidement mais doucement le trou d’entrée vers le manège suivant et répétez l’étape 7.5 jusqu’à ce que les 18 manèges contiennent un mâle.
7. À l’aide de l’aspirateur et sans CO₂, ajoutez une femelle préaccouplée (recueillie à l’étape 7.2) à l’autre moitié des 18 arènes.
8. Placez soigneusement la chambre nuptiale sous la caméra, avec l’ouverture des puits vers le bas (Figure 2C).
9. Retirez la cloison des arènes pour permettre une interaction directe entre les mâles et les femelles préaccouplées.
10. Démarrez immédiatement l’enregistrement du comportement pendant au moins 10 min.
    REMARQUE : Lors de l’utilisation d’une configuration à deux caméras, l’enregistrement parallèle de deux plaques de parade nuptiale peut être effectué dans des délais qui se chevauchent pour maximiser l’efficacité.
11. Videz les arènes de parade nuptiale à l’aide d’un aspirateur à main et laissez la chambre de parade nuptiale s’aérer avant de la réutiliser.
12. Répéter les étapes 7.4 à 7.11 jusqu’à ce que les tests de tous les génotypes et affections (c.-à-d. naïfs et entraînés) soient terminés.

8. Analyse des données vidéo et statistiques

1. Calculez l’indice de parade nuptiale (IC), défini comme le pourcentage de temps que le mâle courtise pendant les 10 premières minutes de la période de test, pour chaque mouche mâle.
   REMARQUE : Cela peut être fait manuellement en observant le comportement de parade nuptiale stéréotypé (Figure 1A) ou en utilisant un logiciel informatique pour la quantification automatisée du comportement de parade nuptiale.
   REMARQUE : Il est recommandé d’analyser de 40 à 60 mâles par condition pendant trois jours afin d’obtenir une puissance statistique suffisante et de juger de la cohérence des données de l’IC.
2. Calculez l’indice d’apprentissage (IL), défini comme le pourcentage de réduction de l’IC moyen des hommes entraînés par rapport aux hommes naïfs (LI = (_{IC naïf} – IC_formé) / CI_naïf). Évaluez l’indice de gravité pour chaque jour de test et comparez-le à l’indice de confiance cumulatif calculé à partir de tous les jours de test combinés.
3. Créez un fichier de données d’onglet séparé à deux colonnes avec « Génotype » et « CI » comme en-têtes.
   REMARQUE : Ces rubriques sont sensibles à la casse. Le nom du génotype de chaque IC doit consister en une description du génotype suivie d’un trait de soulignement et de la condition d’entraînement (par exemple, genotype_N et genotype_LTM, etc., où N = naïf et LTM = mémoire à long terme ; voir le fichier supplémentaire S2 pour un exemple). Cette annotation est essentielle, car la fonction analearn permettra d’identifier les mouches dressées et naïves en fonction des caractères présents après le premier trait de soulignement dans la colonne « Génotype ».
4. Utilisez le script analearn R (fichier supplémentaire S3) pour effectuer un test de randomisation afin de juger de la signification statistique des différences entre les valeurs de l’indice de gravité de différents génotypes.
   1. Source le script (fichier supplémentaire S3) dans R, qui définit une fonction appelée « analearn.”
      REMARQUE : La définition de la fonction est la suivante : analearn <- function(nboot = 10 000, naivelevel = 'N', refmutation = NA, datname = NA, header = TRUE, seed = NA, writeoutput = TRUE).
   2. Démarrez la fonction en saisissant « analearn() » dans la ligne de commande R et en sélectionnant le fichier de données à analyser (produit à l’étape 8.3) via la fenêtre contextuelle.
   3. Choisissez la mutation de référence, qui est le génotype de contrôle, en saisissant le numéro correspondant et en appuyant sur entrée.
      REMARQUE : Après avoir sélectionné le génotype de référence, le script prend plusieurs secondes pour effectuer 10 000 réplications bootstrap.
   4. Observez le tableau de sortie (tableau 3), qui contient le génotype, la condition d’apprentissage (c’est-à-dire apprentissage, STM ou LTM), l’IC moyen naïf, l’IC moyen entraîné, LI, la différence entre l’IC du contrôle par rapport à la condition expérimentale (LI dif), la limite inférieure (LL) et la limite supérieure (UL) de l’intervalle de confiance à 95 % de l’ILI dif, et la valeur p indiquant la probabilité qu’il n’y ait pas de différence significative.
      NOTE : analearn stockera un fichier texte de sortie dans le répertoire où se trouve le fichier de données. Cependant, la table de sortie apparaît également dans la console R-Studio. Le nom par défaut est construit en fonction du nom du fichier de données fourni.
   5. Il y a plusieurs arguments dans la fonction analearn qui peuvent être utilisés pour modifier les paramètres par défaut de la fonction afin d’ajuster les paramètres du bootstrapping.
      REMARQUE : « nboot » définit le nombre de réplicats d’amorçage et est fixé à 10 000 par défaut. Cette valeur peut être remplacée par n’importe quel nombre entier supérieur à zéro. Le tableau 5 répertorie plusieurs arguments qui peuvent être utilisés pour modifier les paramètres par défaut de la fonction. Cependant, il n’est pas recommandé d’utiliser des données produites avec un faible nombre de réplicats bootstrap.

Representative Results

Materials

<em>P{KK101437}VIE-260B</em>	VDRC	101437	Dhat-at-RNAi in 60100 background
<em>P{KK108109}VIE-260B</em>	–	–	Control-RNAi in 60100 background (gift from K. Keleman)
<em>w+, UAS-dcr2/yhh;;elav-Gal4 (III)</em>	–	–	panneuronal driver line
Containers for plant tissue culture	VWR	960177	175 mL plastic vials
Folded filters	Whatman	10311643	Filter paper to enlarge area flies can pupate on
Flat-bottom blocks (96-wells)	Qiagen	19579	Used for housing blocks
MicroAmp Clear Adhesive Film	Applied Biosystems	4306311	PCR adhesive film as lid on flat-bottom blocks
Razor blade	–	–	Any sharp will do
Needle	–	–	0.8 mm diameter
Aspirator	–	–	Cut a 1mL pipet tip with scissors in order to have two pieces. The narrow tip of the pipettip is placed as fly entrance in a ~80 cm flexible hose. To prevent a fly from getting in the hose, a normal piece of cotton or small mesh gaze is placed in between the tip and the hose. The other half of the pipettip can be used as mouth piece at the end of the hose.
Courtship chambers	–	–	file S1 can be opened with indicated CAD software
Camcorder	Sony	–	camera specification: >4M pixels, full HD.
For manual quantification, any simple video recording device has the potential to produce a video of sufficient quality to observe courtship behavior accurately. For automated quantification, there will likely be different requirements depending on the software to be used, and users should investigate this thoroughly if automated quantification is desired.
<strong>Name</strong>	<strong>Company</strong>	<strong>Catalog Number</strong>	<strong>Comments</strong>
power food
Agar	Sigma	A7002
Yeast	Bruggeman	–
Yeast extract	MP biomedicals	0210330391
Peptone	Sigma	P6838
Sucrose	Sigma	S9378
Glucose	Sigma	G7021
MgSO4	Sigma	M2643
CaCl2	Merck	1023780500
Methylparabene (CAUTION)	Sigma	H5501
Propionic acid (CAUTION)	Sigma	P1386
Demineralized water	–
Yeast paste	–		yeast grains and water mixture in a 1:1 ratio
Name	Company	Catalog Number	Comments
normal food
Agar	MP biomedicals	215017890
Yeast	bruggeman	–
Corn flour	de Molen	–
Sugar	de Molen	–
Methylparabene (CAUTION)	Sigma	H5501
Propionic acid (CAUTION)	Sigma	P1386
Demineralized water	–